基于全基因組重測序SNP標(biāo)記的148份馬鈴薯種質(zhì)遺傳多樣性分析

韓志剛，郝文勝，謝 銳，郭景山，伊六喜，侯建華*

(1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，呼和浩特 010019； 2 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特 010031)

中國的馬鈴薯研究始于20世紀(jì)30年代，在40年代分批次從美國、日本等國家引種，50年代利用這些引進(jìn)的資源開始了有規(guī)模的自主育種工作[1]。經(jīng)歷半個多世紀(jì)，中國的馬鈴薯育種工作從無到有，從傳統(tǒng)育種到現(xiàn)在的與分子標(biāo)記輔助育種相結(jié)合的發(fā)展經(jīng)歷，取得了長足的進(jìn)步。截止2020年利用前人引進(jìn)的資源中國的馬鈴薯育種家們選育審定登記的新品種873份，而這些自主選育的新品種在中國的不同生態(tài)地區(qū)發(fā)揮著各自的優(yōu)勢，為當(dāng)?shù)乩习傩諑砹藢?shí)惠，同時，有些國外種質(zhì)資源至今仍在大面積種植，例如，美國的‘布爾班克’、‘大西洋’，加拿大的‘夏波蒂’，荷蘭的‘費(fèi)烏瑞它’等品種?！最^翁’、‘卡它丁’等老品種更是育種家們沿用已久的經(jīng)典親本[2]。因此，對國外引進(jìn)的馬鈴薯種質(zhì)資源及國內(nèi)選育新品種的充分利用就顯得十分必要，而要有效合理地利用這些資源，就必須了解其遺傳背景、親緣關(guān)系，對其遺傳多樣性進(jìn)行研究[3]。分子標(biāo)記無疑是對各種生物群體的遺傳多樣性研究中最常用的方法。邸宏[4]利用AFLP和RAPD分子標(biāo)記對國內(nèi)主栽品種、地方品種、新型栽培種及抗PVY品種等4類資源種植共157份品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，表明新型栽培種和地方品種的遺傳基礎(chǔ)豐富于普通栽培種，普通栽培種與新型栽培種在遺傳組成上有明顯區(qū)別，而地方品種與普通栽培種無明顯差異。徐敏[1]用SSR分子標(biāo)記對國內(nèi)審定的203份品種遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，中國馬鈴薯審定品種遺傳多樣性較低。程永芳[5]基于SRAP標(biāo)記通過UPGMA法可將54份種質(zhì)資源分為6大類群。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)指相同或不同的物種個體間的基因組DNA序列同一區(qū)間上的單個核苷酸存在差別的現(xiàn)象，是由美國學(xué)者Lander提出的DNA遺傳分子標(biāo)記，起初應(yīng)用于醫(yī)學(xué)[6]。隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展SNP標(biāo)記以廣泛應(yīng)用于各類植物的遺傳學(xué)研究，而馬鈴薯SNP標(biāo)記的研究還處于初級階段[7-10]。王艦[11]基于簡化基因組SNP標(biāo)記對288份種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯種質(zhì)資源地域間差異不明顯。Sofía等[12]用SNP標(biāo)記對231個不同基因型馬鈴薯品種做了群體結(jié)構(gòu)分析和主成分分析。Li等[13]用 6 487 006 個高質(zhì)量 SNPs 構(gòu)建了有根鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹，以S.chomatophilumBitter 作為外群，對‘clade 4’成員和栽培種進(jìn)行了主成分分析，這兩個分析得到類似的結(jié)果，將野生馬鈴薯分成兩個亞群，其中一個亞群的物種位于秘魯，為北方野生亞組；而另一亞群的物種位于阿根廷，玻利維亞和智利，為南方野生亞組，這些分析得到了一致的結(jié)果，相對于南方野生亞組，栽培馬鈴薯與北方野生群體的親緣關(guān)系更近。以上研究報道表明利用分子標(biāo)記技術(shù)分析馬鈴薯不同品種間的遺傳多樣性是可行的。

本研究以內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院馬鈴薯課題組多年收集的國內(nèi)外500余份馬鈴薯種質(zhì)資源為基礎(chǔ)，篩選出性狀穩(wěn)定、表現(xiàn)優(yōu)良、系譜明確的148份核心種質(zhì)資源，通過全基因組重測序，以全基因組范圍內(nèi)的SNP標(biāo)記，全面挖掘遺傳變異信息，進(jìn)一步了解148份種質(zhì)資源的親緣關(guān)系和遺傳多樣性，旨在提高馬鈴薯種質(zhì)資源的利用效率，為馬鈴薯定向育種提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

材料為四倍體馬鈴薯普通栽培種148個(表1)，國內(nèi)品種108個，其中華北地區(qū)48個、西北地區(qū)22個、東北地區(qū)16個、華中地區(qū)4個、西南地區(qū)15個以及華東地區(qū)3個品種；國外品種40個，包括歐洲22個、美洲17個及亞洲日本的1個品種。這些材料為系譜明確且田間表型穩(wěn)定的馬鈴薯優(yōu)良品種。

表1 基于SNP分析的四倍體馬鈴薯品種名稱來源及系譜

續(xù)表1 Continued Table 1

續(xù)表1 Continued Table 1

續(xù)表1 Continued Table 1

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)材料的種植各試驗(yàn)材料種植于呼和浩特市武川縣國家馬鈴薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系呼和浩特試驗(yàn)站試驗(yàn)田內(nèi)，各品種種植5株，行長1.5 m，株距0.3 m，行距0.9 m，機(jī)器開溝人工點(diǎn)種覆土，前作葵花。

1.2.2 樣品DNA的提取供試材料148個種植出苗后，選擇健壯無退化表現(xiàn)的植株取新鮮嫩葉2.0 g，參照Stewart等[14]提出的CTAB法提取基因組DNA，用NanoDrop核酸蛋白測定儀檢測DNA的純度，Qubit對DNA濃度進(jìn)行精確定量。

1.2.3 SNP標(biāo)記檢測148個樣品基因組DNA送至諾禾致源公司進(jìn)行高通量重測序。高通量IlluminaHiSeqTM測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，去除未測出的堿基等干擾信息后得到有效數(shù)據(jù)。通過BWA軟件，將這些有效數(shù)據(jù)與已公布的馬鈴薯參考基因組(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Solanum+tuberosum+L.)進(jìn)行比對。SAMTOOLS軟件進(jìn)行群體SNP的檢測，貝葉斯模型檢測群體中的多態(tài)性位點(diǎn)，通過有效過濾(測序深度>5X；最小等位基因頻率MAF>0.1；Call rate>90%)，獲得高質(zhì)量的SNPs用于遺傳多樣性分析。

1.2.4 群體結(jié)構(gòu)分析和聚類分析本研究以群體結(jié)構(gòu)分析和聚類分析2種方法來探究148個馬鈴薯種質(zhì)資源各品種間群體結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系，兩者的結(jié)果可以相互驗(yàn)證。運(yùn)用TreeBestv1.9.2軟件計(jì)算距離矩陣，以此為基礎(chǔ)換算成遺傳相似系數(shù)，通過鄰接法(neighbor-joining method)構(gòu)建群體聚類圖，引導(dǎo)值(bootstrap values)經(jīng)過達(dá)1 000次計(jì)算獲得。采用PLINK進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，首先創(chuàng)建PLINK的輸入文件—Ped文件，然后利用admixture軟件構(gòu)建群體遺傳結(jié)構(gòu)和群體世系信息。PLINK (http://pngu.mgh. harvard.edu/-purcell/plink/)。

1.2.5 部分骨干親本雜交后實(shí)生種子統(tǒng)計(jì)2018和2019年間按照育種目標(biāo)對148份種質(zhì)資源內(nèi)篩選出的部分骨干親本于馬鈴薯盛花期進(jìn)行雜交授粉，待坐果成熟后對漿果內(nèi)實(shí)生種子(True Potato Seed TPS)有無、數(shù)量等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并結(jié)合各品種間遺傳相似系數(shù)即親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，為不同親本間雜交組合選配提供參考。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA樣本檢測與重測序質(zhì)量評估

148份馬鈴薯種質(zhì)資源提取到的DNA濃度在20.6～166.0 μg/μL之間，平均為92.88 μg/μL，總量在2.47～17.42 μg范圍內(nèi)，平均為7.44 μg，表明DNA質(zhì)量符合后續(xù)重測序的要求。經(jīng)每樣本重測序數(shù)據(jù)與參考基因組比對Q20值(錯誤率1%以下)在95.77%～98.04%，平均為96.92%，錯誤率在Q30值(錯誤率0.1%以下)在89.27%～94.16%之間，平均值為91.77%，GC含量在35.44%～36.34%之間，平均為35.79%。與參考基因組的比對率最高96.51%，最低93.53%，平均95.66%，測序深度最高21.91X，最低11.93X，平均深度為15.12X，平均覆蓋度為95.55%。以上數(shù)據(jù)表明各樣本與參考基因組的相似度達(dá)到重測序標(biāo)準(zhǔn)，并且足以滿足該群體的遺傳多樣性分析。

2.2 多態(tài)性SNP位點(diǎn)的分布

經(jīng)重測序148個馬鈴薯樣本共獲得2 315 860個SNP位點(diǎn)，過濾篩選后獲得1 209 969個高質(zhì)量SNP位點(diǎn)，其中被明確定位在染色體水平上的SNP位點(diǎn)為1 192 472個，比例為98.55%，這些SNP位點(diǎn)將用于148份種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析。

SNP位點(diǎn)從染色體分布情況來看差距較大，11號染色體沒有SNP位點(diǎn)，而最多的是5號染色體有258 909個位點(diǎn)占總數(shù)的21.71%，其次為1號染色體的194531個位點(diǎn)占比為16.08%，之后依次為2號、10號、6號、4號、9號、8號以及3號和12號染色體，SNP位點(diǎn)數(shù)量分別為153 224、149 793、133 432、123 134、58 965、54 202、30 106、27 671個，占比依次為12.17%、12.38%、11.03%、10.17%、4.87%、4.48%、2.49%和2.29%，除了11號染色體外的7號染色體SNP分布數(shù)量最少為8 485個，僅占0.70%(圖1)。

圖1 SNP位點(diǎn)在染色體上的分布Fig.1 Distribution of polymorphic SNPs on chromosomes

2.3 各品種間的遺傳相似系數(shù)

利用國內(nèi)外148個馬鈴薯品種全基因組重測序獲得的SNP標(biāo)記，通過TreeBestv1.9.2軟件計(jì)算出各品種間遺傳相似系數(shù)，共獲得10 878個遺傳相似值，范圍為0.784～0.958，平均值為0.842。遺傳相似系數(shù)最低的是華北地區(qū)山西省農(nóng)科院高寒區(qū)作物所育成的‘系薯1號’和同為華北地區(qū)內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)育成的‘內(nèi)農(nóng)薯1號’之間的0.784，遺傳相似系數(shù)最高的是華北地區(qū)河北省張家口農(nóng)科院育成的2個品種‘冀張薯-59’和‘冀張薯20號’之間的0.958。各品種間遺傳相似系數(shù)主要集中于0.800～0.880之間，有10 604個，占97.5%，小于0.800的有55個，占0.5%，大于0.88的有219個，占2.0%(圖2)。

圖2 品種間遺傳相似系數(shù)的次數(shù)分布Fig.2 Distribution of genetic similarity between varieties

按照各品種育成地區(qū)將中國馬鈴薯品種劃分為華北、西北、東北、華中華東、西南等5個區(qū)域，國外品種劃分為歐洲、美洲、亞洲(日本)等3個區(qū)域。對各區(qū)域內(nèi)育成品種間遺傳相似性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)(表2)，中國華北地區(qū)平均遺傳相似系數(shù)為0.841，西北地區(qū)為平均系數(shù)為0.843，東北地區(qū)為0.842、華中華東地區(qū)是0.845，西南地區(qū)各品種間平均遺傳相似系數(shù)最高為0.848，國外歐洲品種間平均遺傳相似系數(shù)為0.844，美洲品種間平均遺傳相似系數(shù)為0.850。數(shù)據(jù)結(jié)果表明無論是國內(nèi)還是國外各區(qū)域品種間平均遺傳相似系數(shù)差距不明顯。

表2 不同地區(qū)育成品種間遺傳相似系數(shù)

2.4 群體結(jié)構(gòu)分析

將148個馬鈴薯品種通過PLINK和admixture軟件構(gòu)建群體遺傳結(jié)構(gòu)和群體世系信息。進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析時將分群數(shù)K值設(shè)置為2-8。根據(jù)各品種間的交叉驗(yàn)證錯誤率ΔK最小時K=6，說明最佳分群K值為6(圖3)，因此148個品種分為6個群最為接近于群體的真實(shí)情況(圖4)，圖中每一個直方柱子代表1個品種，每根柱子的顏色代表遺傳組分的構(gòu)成。利用admixture軟件對每個個體的遺傳背景進(jìn)行分組并計(jì)算相應(yīng)的Q值，即某一材料基因組變異源于某個群體的概率，Q值>0.6視為來源較單一、遺傳背景較純，Q值<0.6視為來源混合，遺傳背景較為雜[15-16]。

圖3 交叉驗(yàn)證錯誤率ΔK值隨K值的變化Fig.3 The variation of cross validation error rate ΔK with K value

淺藍(lán)色代表群組1；藍(lán)色代表群組2；淺綠色代表群組3；綠色代表群組4；粉色代表群組5；紅色代表群組6圖4 148份四倍體馬鈴薯種質(zhì)SNPs群體結(jié)構(gòu)分析(K=6)Light blue blocks represent Pop1; Blue blocks represent Pop2; Light green blocks represent Pop3; Green blocks represent Pop4; Pink blocks represent Pop5; Red blocks represent Pop6Fig.4 Population structure analysis of 148 tetraploid potato varieties (K=6) by using identified SNPs

本次分析的6個群組主色段分別為淺藍(lán)、藍(lán)、淺綠、綠、粉以及紅色。第一群組(Pop1)包括21個品種，主色段為淺藍(lán)色，其中5個品種的遺傳背景較純，分別為中國農(nóng)科院蔬菜花卉研究所的‘中薯19號’、‘中蔬9518-15’，內(nèi)蒙古烏蘭察布市農(nóng)科院的‘烏蘭一號’以及國外美洲地區(qū)加拿大的‘亨特’、美國的‘Atlantic’，其他品種含有多種遺傳組分，屬于混合型。第二群組(Pop2)藍(lán)色為主色段，包括30個品種，其中6個品種的遺傳背景較純，分別是華北區(qū)中國農(nóng)科院蔬菜花卉研究所的‘中薯10號’、‘中薯4號’及‘中薯21號’，河北省張家口農(nóng)科院的‘壩薯9號’，西南地區(qū)云南省農(nóng)科院經(jīng)濟(jì)作物所的‘云薯506’，美洲地區(qū)加拿大的‘阿旺’。其他品種均為混合型。第三群組(Pop3)有33個品種，主色段是淺綠，其中華北區(qū)山西省高寒區(qū)作物所的‘晉薯24號’、內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院的‘紅美’、河北省張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院的‘冀張薯5號’、中國農(nóng)科院蔬菜花卉研究所的‘中蔬613’，西南地區(qū)貴州省威寧地區(qū)農(nóng)科所的‘威176選2’以及歐洲地區(qū)俄羅斯的‘Epicure’和‘Cибиpяк’等7個品種的遺傳背景較純，其他品種為混合型。第四群組(Pop4)共18個品種，主色段為綠色，其中包括華北地區(qū)的‘中薯12號’、‘冀張薯-59’、‘冀張薯20號’，東北地區(qū)黑龍江省農(nóng)科院克山分院的‘克新1號’以及美洲地區(qū)加拿大的‘貝勒斯利’和美國的‘Kennebec’等6個品種的遺傳背景較純。第五群組(Pop5)包括29個品種，主色段是粉色，其中6個品種遺傳背景較純分別是華北地區(qū)的‘冀張薯12號’和‘系薯1號’，西北地區(qū)甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所的‘隴薯3號’，華東地區(qū)山東省希森集團(tuán)的‘希森3號’以及歐洲地區(qū)荷蘭的‘荷蘭薯’和‘Favorita’，其余品種為混合型。第六群組(Pop6)包括17個品種，主色段為紅色，其中6個品種較遺傳背景較純，分別為西北地區(qū)甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所的‘渭會四號’，西南地區(qū)四川省農(nóng)科院作物所的‘川芋39號’，東北地區(qū)吉林省蔬菜花卉科學(xué)研究所的‘春薯3號’，歐洲地區(qū)德國的‘強(qiáng)壯’、‘北斗星’,以及美洲地區(qū)美國的‘Katahdin’，其他品種為混合型。

2.5 聚類分析

為探明148個馬鈴薯品種間的親緣關(guān)系，本研究以遺傳相似系數(shù)為基礎(chǔ)，通過鄰接法構(gòu)建NJ聚類圖。結(jié)果表明(圖5)，148個馬鈴薯品種被劃分為3個類群。

圖5 基于SNP標(biāo)記的148份四倍體馬鈴薯種質(zhì)的進(jìn)化樹Fig.5 Neighbor-joining tree for 148 tetraploid potato varieties based on SNP markers

第Ⅰ類有6個品種，也是3個類群中品種數(shù)最少的一個群，遺傳相似系數(shù)在0.852～0.956之間。包含華北地區(qū)的3個品種，西北及東北地區(qū)各1個品種，國外美洲的1個品種?！墒?8號’的父本‘3-4-4’和‘烏盟851’的母本‘474-7-9’有野生種的親緣，據(jù)此推測僅這6個品種在148個群體中形成獨(dú)立分支很可能與野生種親緣有關(guān)。

第Ⅱ類有80個品種，分為3個亞類，遺傳相似系數(shù)在0.784～0.956之間，平均為0.843，其中華北地區(qū)內(nèi)蒙古華頌公司育成的‘華頌7號’與歐洲德國的‘Agria’遺傳相似系數(shù)最高為0.956，華北區(qū)內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)育成的‘內(nèi)農(nóng)薯1號’與山西省高寒區(qū)作物所育成的‘系薯1號’相似系數(shù)最低為0.784。Ⅱ-1亞類有18個品種，主要包括華北地區(qū)5個品種，西北地區(qū)5個品種，國外美洲的5個品種，其中西北地區(qū)甘肅農(nóng)科院育成的‘隴薯系列’5個品種緊相鄰，美洲5個品種中除了‘亨特’為加拿大品種外，其他4個均為美國品種。從系譜上看，此亞類18個品種親本大多為國外引進(jìn)品種，尤其是‘Shepody’、‘疫不加’、‘燕子’、‘菲多利’等都是國外的老品種?！甃enape’是‘Atlantic’的母本也是‘Belchip’的父本，因此‘Lenape’與‘Atlantic’相似系數(shù)較高為0.895，與‘Belchip’的相似系數(shù)為0.889。‘內(nèi)農(nóng)薯1號’與‘隴薯8號’的母本同為‘Atlantic’，兩者相似系數(shù)較高為0.896，‘隴薯11號’和‘隴薯14號’母本為‘L9712-2’，兩者遺傳相似系數(shù)也為較高的0.881。Ⅱ-2亞類共有30個品種，此亞類較為典型的是中國農(nóng)科院蔬菜花卉研究所育成的‘中薯系列’7個品種聚在此亞群，其中‘中薯19’號與‘中薯21’號父母本相同，為同胞關(guān)系，兩者相似系數(shù)為0.899?！惺?9號’、‘中薯21號’、‘中薯18號’的父本同為‘C93.154’，此類半同胞關(guān)系的遺傳相似值也較高，‘中薯18號’與‘中薯19號’之間為0.854，與‘中薯21號’之間為0.876?！惺?0號’的父本與‘中薯19號’和‘中薯21號’的母本同為品系‘92.187’，因此‘中薯20號’與‘中薯19號’的遺傳相似系數(shù)為0.858，與‘中薯21號’的相似值為0.868。歐洲德國品種‘Agria’為荷蘭品種‘Ramos’的母本，兩者遺傳相似系數(shù)為0.890。Ⅱ-3亞類有32個品種，為第Ⅱ類群中品種數(shù)最多的亞類，華北區(qū)品種有14個，其他品種無明顯的地域性，育成地區(qū)比較混雜。從系譜角度觀察，‘冀張薯14號’和‘冀張薯-88’為同胞關(guān)系，具有相同的父母本，兩者遺傳相似值是此亞群最高的0.955，‘隴薯12號’和‘隴薯13號’的父本同為‘L0202-2’屬半同胞關(guān)系相似值為0.942，‘冀張薯8’號是‘冀張薯24號’的母本，其相似值是0.905。

第Ⅲ類共有62個品種，分為2個亞類，遺傳相似值在0.789～0.958之間，平均值是0.847，其中華北區(qū)中國農(nóng)科院蔬菜花卉研究所育成的‘中蔬613’和西北區(qū)甘肅農(nóng)科院育成的‘隴薯5號’之間遺傳相似系數(shù)最低為0.789，最高的是‘冀張薯-59’和‘冀張薯20號’之間的0.958，也是148群體各品種間遺傳相似值最高的2個品種。Ⅲ-1亞類有22個品種，從聚類圖上看華北區(qū)中國農(nóng)科院蔬菜花卉研究所育成的 ‘中薯系列’3個品種相鄰，河北張家口農(nóng)科院育成的‘冀張薯-59’和‘冀張薯20’號相鄰，其他品種無明顯育成地區(qū)的一致性。由各品種系譜關(guān)系看，‘冀張薯-59’和‘冀張薯20號’為父母本相同的同胞關(guān)系，‘中薯3號’是‘中薯9號’的父本，兩者之間的相似值為0.949?！疀鍪?號’是‘川芋10號’的父本，相似值為0.856?！惺?號’和‘XS-06YH-03’的母本同為‘Shepody’，兩者的相似值為0.873。Ⅲ-2亞類共有40個品種，包括華北地區(qū)9個品種、西北地區(qū)6個品種、東北地區(qū)5個品種、西南地區(qū)5個品種、華中地區(qū)1個品種、歐洲8個品種及美洲的6個品種，品種育成區(qū)域較為混雜。東北地區(qū)5個品種均為黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院克山分院育成的‘克新系列’品種，其中‘克新23號’與‘克新25號’為同胞關(guān)系，在聚類圖上緊相鄰，遺傳相似值為0.909?！瓺esiree’是‘青薯168’的父本，兩者聚類位置也是緊相鄰，相似值為0.884，另外‘Shepody’是‘Innorvator’的母本，兩者相似值為0.886，其他品種在系譜上無明顯親緣關(guān)系。

2.6 TPS情況統(tǒng)計(jì)分析

2018至2019年間按照“鮮食、高產(chǎn)(3 000 kg以上)”育種目標(biāo)，篩選出骨干親本38份，配制349個雜交組合，坐果并有TPS的組合(視為成功組合)32個，占9.17%。雜交成功組合中‘中薯12號’(♀)與‘早大白’(♂)之間的遺傳相似系數(shù)最低為0.807，‘費(fèi)烏瑞它’(♀)與‘冀張薯12號’(♂)的遺傳相似系數(shù)最高為0.895，32個組合平均為0.843(表3)。

表3 2018和2019年部分骨干親本雜交選配TPS統(tǒng)計(jì)

3 討 論

種植資源是作物基礎(chǔ)研究和遺傳改良的基礎(chǔ)物質(zhì)，其數(shù)量和質(zhì)量是定向育種的兩大制約因素[17]。而種質(zhì)資源的遺傳多樣性是育種工作中各品種間的雜交選配、親緣關(guān)系遠(yuǎn)近、雜種優(yōu)勢強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，因此，對種質(zhì)資源的遺傳背景，各品種間的遺傳相似系數(shù)的了解顯得格外重要[18]。隨著測序技術(shù)的發(fā)展從起初的第一代測序到現(xiàn)在第三代高通量測序使得各作物的起源、馴化、傳播，各群體間的遺傳多樣性研究更加深入明了。相對于簡化基因組測序，全基因組重測序理論上應(yīng)該覆蓋整個基因組，測序深度10X以上可覆蓋整個基因組的90%～99%，足以達(dá)到群體遺傳多樣性分析。分子標(biāo)記從最初的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)經(jīng)歷了隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)及簡單序列重復(fù)(SSR)直到現(xiàn)在的SNP，可謂層出不窮[19]。SNP作為第三代分子標(biāo)記是基于第二代SSR等分子標(biāo)記發(fā)展起來的新型標(biāo)記技術(shù)，近年來已廣泛應(yīng)用于水稻、玉米、小麥、棉花等各類作物的品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建以及全基因組關(guān)聯(lián)分析等研究工作[20-22]。相對于其他分子標(biāo)記，SNP在基因組上做到了單個核苷酸水平，且具有分布廣泛、數(shù)量多、遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)；其缺點(diǎn)是做到全基因組水平的SNP標(biāo)記的話測序成本較高，易發(fā)生假陽性、錯誤率高等[23]。因此，為了確保獲得高質(zhì)量的SNPs一定要嚴(yán)格把控測序深度、最小等位基因頻率、比對率等過濾標(biāo)準(zhǔn)。本研究中，為了獲得高質(zhì)量的SNPs，148份樣品的平均測序深度為15.12、Q30值為91.77%、最小等位基因頻率高于10%，正是因?yàn)楦邩?biāo)準(zhǔn)的過濾參數(shù)使得低質(zhì)量的SNPs被去除掉，這也許就是導(dǎo)致11號染色體未能檢出高質(zhì)量SNP的原因。

群體結(jié)構(gòu)分析主要是能夠明確該群體的分群合理性及每個個體遺傳組分的多少。本研究中，148份馬鈴薯品種被劃分為6個群組，Q值>0.6的品種有36個，占比24.3%，說明遺傳背景純、來源較單一的品種占比不大，大部分品種遺傳組分混雜程度較高，基因交流較多。這36個品種中來源為華北地區(qū)品種有16個占44.4%，國外品種有13個占36.1%，二者共占80.5%，說明華北區(qū)育成品種及國外品種的遺傳背景純正比例相對高于其他區(qū)域品種。這可能是由于中國馬鈴薯北方一季作區(qū)氣溫較低、降雨量少、無霜期短適宜生長的品種較少，供育種者們選擇的骨干親本較少有關(guān)。聚類分析呈現(xiàn)的是群體樣本DNA序列間的差異，也就是各品種間的親緣遠(yuǎn)近關(guān)系。148份種質(zhì)資源被劃分為3個群，遺傳相似系數(shù)0.784～0.958之間，平均0.842。按照品種來源即育成單位地理位置劃分為8個區(qū)域，各區(qū)域相似值在0.841～0.850之間，區(qū)域間平均相似系數(shù)差距不明顯。從聚類圖上看，西北地區(qū)‘隴薯系列’的7個品種集中在Ⅱ-1亞群，華北地區(qū)的‘中薯系列’6個品種則集中在Ⅱ-2亞群，‘冀張薯系列’的5個品種集中于Ⅱ-3亞群，而‘中薯系列’的3個品種和‘冀張薯系列’的2個品種相鄰于Ⅲ-1亞群，由此看出北方一季作區(qū)育成的部分品種聚在一起有著一定的地理區(qū)域性與段紹光等[24]利用SSR標(biāo)記分析馬鈴薯品種遺傳多樣性結(jié)果相一致。華北區(qū)品種在聚類圖上顯示相鄰的結(jié)果與群體結(jié)構(gòu)分析遺傳組分單一，遺傳背景狹窄相互驗(yàn)證。其他區(qū)域品種總體上看來并無明顯的地理區(qū)域性，不同地理來源的馬鈴薯品種相互交錯分布，說明品種來源的地理差別與親緣關(guān)系并無必然聯(lián)系，此結(jié)果與王艦[11]分析結(jié)果一致。究其原因：首先，各育種單位相互引種頻繁，在長期的選育過程中存在基因交流的情況；其次，不同區(qū)域引種品種為適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境，逐漸減少了遺傳差異所致。

群體結(jié)構(gòu)分析與聚類分析對比發(fā)現(xiàn)，群體結(jié)構(gòu)分析的Pop1(21個品種)與聚類分析的Ⅱ-1亞群(18個品種)有12個品種相同，Pop2(30個品種)和Ⅱ-2亞群(30個品種)有13個品種相同，Pop3(33個品種)與Ⅱ-3亞群(32個品種)的相同品種有13個，Pop4(18個品種)的8個品種聚在Ⅲ-1亞群(22個品種)，Pop5(29個品種)與Pop6(17個品種)共46個品種和Ⅲ-2亞群(40個品種)與Ⅰ群(6個品種)的46個品種相對應(yīng)有15個品種相同，以上結(jié)果說明群體結(jié)構(gòu)分析與聚類分析分群結(jié)果基本吻合，也相互驗(yàn)證了148份種質(zhì)資源分群的合理性。

系譜分析與全基因組SNP標(biāo)記的聚類分析相結(jié)合發(fā)現(xiàn)，同胞關(guān)系的品種基本聚在一起。例如：‘冀張薯14號’、‘冀張薯20號’、‘冀張薯-59’及‘冀張薯-88’為父母本完全相同的同胞關(guān)系，聚類結(jié)果顯示‘冀張薯14號’和‘冀張薯-88’相鄰于Ⅱ-3亞群，‘冀張薯20號’和‘冀張薯-59’相鄰在Ⅲ-1亞群。‘克新23號’與‘克新25號’也是同胞關(guān)系，二者相鄰在Ⅲ-2亞群，‘中薯19號’和‘中薯21號’聚在Ⅱ-2亞群。半同胞關(guān)系的品種也基本聚在同一亞群中，在聚類分析結(jié)果中已舉例說明。由此可見，本次篩選到的SNPs可以揭示馬鈴薯品種資源的遺傳差異以及品種間的親緣關(guān)系。當(dāng)然，系譜信息與聚類結(jié)果不一致的現(xiàn)象是存在的，例如：‘燕子’是‘烏蘭一號’的母本，‘Favorita’是‘蒙薯18號’的母本，‘Innovator’和‘XS-06YH-03’母本相同，‘隴薯8號’與‘冀張薯12號’母本相同，系譜信息顯示以上品種間確實(shí)存在親緣關(guān)系，但并未聚在同一個亞群。出現(xiàn)此類現(xiàn)象可能與以下幾點(diǎn)有關(guān)：一是馬鈴薯普通栽培種為同源四倍體，有48條染色體，形成配子多樣性高，遺傳分離較大；二是育種者往往注重高產(chǎn)、抗病等性狀，長期的定向育種造成某個性狀位點(diǎn)過于集中，從而造成其他性狀位點(diǎn)逐漸丟失；三是往往育種單位種質(zhì)資源品種較多，在引種、繁種、保種時難免會出現(xiàn)系譜或品種名稱記載偏差的可能，導(dǎo)致同物異名、同名異物的結(jié)果。

馬鈴薯有別于其他主糧作物的最大特點(diǎn)是無性繁殖。優(yōu)點(diǎn)在于只要獲得綜合性狀優(yōu)良的個體后，通過無性繁殖的方式可以將其穩(wěn)定下來，從而獲得穩(wěn)定的品種品系；但是，由于無性繁殖的特征也使得現(xiàn)有馬鈴薯普通栽培種處于遺傳雜合狀態(tài)，而這對于新品種選育來說是不利的[25]。馬鈴薯普通栽培種均為同源四倍體材料，四體遺傳和高度雜合的特點(diǎn)提高了性狀分離的復(fù)雜程度，使得馬鈴薯雜交組合必須要有相當(dāng)大的群體，從而提高優(yōu)選率。育種工作中親本的選配對于是否能得到優(yōu)良后代是至關(guān)重要的。父母本的遺傳背景差異大、親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的組合其雜種優(yōu)勢更強(qiáng)，變異類型更多，優(yōu)選幾率也會更高一些。本研究中通過2年部分骨干親本的雜交情況看出，馬鈴薯普通栽培種的雜交成功率很低，349個雜交組合中僅有32個組合雜交成功，占比僅為9.17%，從遺傳學(xué)角度考慮這與近緣雜交形成的雜種優(yōu)勢不強(qiáng)、變異類型不多、遺傳背景狹窄等因素有著密切的關(guān)系。32個成功組合的平均父母本遺傳相似系數(shù)為0.843，因此推斷制定雜交組合選配時可以考慮0.843為父母本的遺傳相似參考值，育種目標(biāo)相同情況下，應(yīng)該考慮遺傳相似值在0.843以下的2個品種作為優(yōu)選，以便提高雜交成功率。

本研究以國內(nèi)外148份四倍體馬鈴薯普通栽培種為群體，通過第三代高通量測序手段進(jìn)行全基因組重測序，以SNP為分子標(biāo)記，遺傳相似系數(shù)為指標(biāo)，利用群體結(jié)構(gòu)分析與聚類分析相結(jié)合的方法，參照系譜信息，初步明確了各品種間的遺傳背景和親緣關(guān)系及群體的遺傳多樣性。旨在現(xiàn)有條件下盡可能避免親緣關(guān)系過近品種間雜交，有助于豐富育成品種的遺傳多樣性，為馬鈴薯普通栽培種育種工作的親本選配提供參考。本研究相對于同類研究，首次采用全基因組重測序技術(shù)，獲得的高質(zhì)量SNP數(shù)量較大、各品種系譜信息較全，為分析結(jié)果的可靠性提供了保障。

研究發(fā)現(xiàn)，以SNP為分子標(biāo)記的遺傳多樣性分析結(jié)果顯示，部分馬鈴薯品種間親緣關(guān)系具有一定的地理區(qū)域性，但并非必然關(guān)系。148份種質(zhì)資源中大部分品種間遺傳相似系數(shù)較高，遺傳背景不夠豐富，雜交成功率低，因此，在育種中亟需引入新型種質(zhì)資源，繼而為種質(zhì)創(chuàng)新提供更豐富的遺傳基礎(chǔ)。