青藏高原鉆葉龍膽的遺傳分化與種群動(dòng)態(tài)歷史研究

付鵬程，劉玉玉，史明艷

(洛陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471934)

青藏高原地區(qū)是全球生物多樣性熱點(diǎn)地區(qū)之一[1]，孕育了大量特有物種，是研究植物遺傳分化與適應(yīng)性進(jìn)化的熱點(diǎn)地區(qū)[2-4]。大量生物地理學(xué)研究[5-7]和譜系地理學(xué)研究[4, 8]均表明，青藏高原地區(qū)植物遺傳分化受到了造山運(yùn)動(dòng)和冰川運(yùn)動(dòng)及其引發(fā)的環(huán)境與氣候變化的深刻影響[4, 8-10]。然而，不同物種對(duì)環(huán)境與氣候變化的響應(yīng)模式存在較大的差異。例如，不同植物具有不同類型的冰期避難所與擴(kuò)張模式[10]，高山植物對(duì)全球氣候變化的響應(yīng)有別于低海拔植物[11]。因此，探討青藏高原地區(qū)植物尤其是特有物種的遺傳分化及其對(duì)過(guò)去環(huán)境與氣候變化的響應(yīng)模式，可以為深入理解全球氣候變化背景下的植物進(jìn)化與多樣性形成提供參考。

龍膽屬植物是典型的高山植物，以青藏高原及其周邊地區(qū)為分布中心和分化中心，不僅是中國(guó)植物多樣性的重要組成部分，還具有很高的藥用和觀賞價(jià)值[12]。龍膽屬共分為14個(gè)組，其中小龍膽組(sectionChondrophyllaes.l.)是龍膽屬中最大的類群，大多數(shù)為一年生草本，共有168種，占龍膽屬物種總數(shù)的46.41%[12-14]。已有的進(jìn)化研究表明，小龍膽組是一個(gè)快速分化類群[15-16]，起源于青藏高原地區(qū)，隨后擴(kuò)散到東亞、歐洲和美洲等地[17]。目前已對(duì)少量龍膽屬物種開(kāi)展了遺傳分化和譜系地理學(xué)研究[18-22]，對(duì)龍膽屬的物種形成及其對(duì)氣候變化的響應(yīng)模式等科學(xué)問(wèn)題有了初步認(rèn)識(shí)，但無(wú)一涉及小龍膽組這一龐大的類群，對(duì)小龍膽組在青藏高原的遺傳分化及其對(duì)氣候變化的響應(yīng)缺乏了解。

鉆葉龍膽(GentianahaynaldiiKanitz)是小龍膽組中的常見(jiàn)物種之一，一年生草本，二倍體(2n = 18、20)[23-25]，是青藏高原特有植物。鉆葉龍膽曾隸屬于柱果組(sectionDolichocarpa)[12]，但由于柱果組在分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中不是一個(gè)單系群[13,17,26]，在最新的龍膽屬分類系統(tǒng)中，柱果組已合并到小龍膽組中[14]。葉綠體基因組的比較研究表明，鉆葉龍膽的葉綠體基因組發(fā)生了大量基因缺失和序列缺失，變異模式與小龍膽組其他物種類似，可能與適應(yīng)青藏高原的氣候變化有關(guān)[17]。

本研究以青藏高原地區(qū)的鉆葉龍膽種群為研究對(duì)象，結(jié)合母系遺傳和雙親遺傳的分子標(biāo)記探討鉆葉龍膽的種群遺傳分化和種群動(dòng)態(tài)歷史，以期為龍膽以及高山植物的進(jìn)化研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

在青藏高原地區(qū)采集鉆葉龍膽11個(gè)種群共135個(gè)個(gè)體，基本覆蓋該物種的地理分布范圍，種群內(nèi)每個(gè)個(gè)體間距至少10 m。由于鉆葉龍膽植株矮小，選取整株用干燥硅膠快速干燥，密封保存于-20 ℃中。憑證標(biāo)本存于洛陽(yáng)師范學(xué)院標(biāo)本館。詳細(xì)的采樣信息見(jiàn)表1。

1.2 方 法

1.2.1 分子數(shù)據(jù)獲取用CTAB法[25]提取總DNA，用1%瓊脂糖檢測(cè)。選用通用的ITS1a-ITS4引物[27]和葉綠體trnS-trnG引物[28]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和擴(kuò)增反應(yīng)參見(jiàn)文獻(xiàn)[21]。將PCR產(chǎn)物純化后用ABI3730xl(Applied Biosystems, USA)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 遺傳分化與種群動(dòng)態(tài)分析使用軟件GENEIOUS PRO 3.5.6[29]查看測(cè)序結(jié)果，并進(jìn)行序列比對(duì)。在軟件DnaSP 5.1[30]中統(tǒng)計(jì)單倍型個(gè)數(shù)，對(duì)于有雜合位點(diǎn)的ITS序列，用PHASE[31]按默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行基因分型。在ARLEQUIN 3.5[32]中計(jì)算基因多態(tài)性(h)與核苷酸多態(tài)性(π)，并通過(guò)分子變異分析(AMOVA)[33]檢測(cè)遺傳變異在居群內(nèi)和居群間的分布情況。用PERMUT[34]計(jì)算居群遺傳分化系數(shù)GST和NST，并對(duì)算得的GST和NST做1 000次重復(fù)的置換檢驗(yàn)，以檢測(cè)單倍型的分布是否具有顯著的地理結(jié)構(gòu)。在ARLEQUIN 3.5[32]進(jìn)行歧點(diǎn)分布(mismatch distribution)分析和中性檢測(cè)分析，計(jì)算Fu’sFs[35]和Tajima’sD值[36]。

采用最大似然法，在IQ-TREE[37]中基于單倍型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，核苷酸替換模型由IQ-TREE自動(dòng)計(jì)算，設(shè)置Bootstrap為1 000。用最大簡(jiǎn)約法在軟件NETWORK 4.6[38]中構(gòu)建單倍型的中央網(wǎng)絡(luò)連接圖。

用軟件BEAST 1.7.5[39]，基于貝葉斯馬爾科夫鏈-蒙特卡洛鏈方法(Bayesian MCMC)估算鉆葉龍膽各支系的分化時(shí)間。選用Yule process、嚴(yán)格分子鐘模型進(jìn)行計(jì)算。由于龍膽屬已發(fā)現(xiàn)的化石非常少，加之本研究中未包含龍膽屬全部主要類群，因此采用兩種方法對(duì)分化時(shí)間估算進(jìn)行校正。首先，選用龍膽屬僅有的秦艽化石來(lái)標(biāo)定外類群的共同祖先時(shí)間[17]；其次，依據(jù)Favre等[17]的結(jié)果，約束龍膽屬冠群時(shí)間的中位數(shù)為29.76個(gè)百萬(wàn)年(Ma)。分析時(shí)做3次獨(dú)立運(yùn)算，每次運(yùn)算10 000 000代，每隔1 000代取一棵樹(shù)，去掉前20%的預(yù)熱樹(shù)(burn-in)。用Tracer 1.5(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/tracer/)查看有效采樣規(guī)模(effective sample size, ESS),保證所有指標(biāo)均大于200。采用TreeAnnotator 1.7.5[40]基于有效樹(shù)產(chǎn)生一棵分支分化時(shí)間樹(shù)。

1.2.3 物種分布模型從GBIF(Global Biodiversity Information Facility)中下載鉆葉龍膽的分布記錄，結(jié)合本研究記錄的物種分布記錄，在ArcGIS 10.2中移除間距小于10 km的分布點(diǎn)。從WorldClim下載目前、中全新世(mid-Holocene，～6 kya)、末次盛冰期(LGM，～22 kya)和末次間冰期(LIG，～120-140 kya)的19個(gè)生物氣候因子。為了避免多重共線性的影響，在SPSS 2.0中計(jì)算生物氣候因子間的皮爾森相關(guān)系數(shù)，去掉皮爾森相關(guān)系數(shù)顯著大于0.9的生物氣候因子。用軟件MaxEnt 3.4.1[41]預(yù)測(cè)鉆葉龍膽在不同時(shí)期的物種分布范圍。將75%的分布數(shù)據(jù)用作訓(xùn)練集，剩下的25%用作測(cè)試集，用AUC值對(duì)模型進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳分化與遺傳結(jié)構(gòu)

葉綠體分子標(biāo)記在鉆葉龍膽中共有4處堿基替換和一處缺失/插入，共鑒定7個(gè)單倍型(cH1—cH7；GenBank登錄號(hào)MT492502—MT492508)。香格里拉(XGLL)和玉樹(shù)(YS2)種群包含的單倍型較多，分別是4個(gè)和3個(gè)，而有4個(gè)種群僅包含1種單倍型(表1，圖1)。核分子標(biāo)記在鉆葉龍膽中共有30處堿基替換，共鑒定78個(gè)基因型(H1—H78；GenBank登錄號(hào)MT483797—MT483859)，其中大部分基因型為單個(gè)種群所獨(dú)有(表1，圖1)。葉綠體數(shù)據(jù)和核基因數(shù)據(jù)均表明，香格里拉(XGLL)、道孚(DF)和甘孜(GZ)種群的遺傳多樣性最高?；谌~綠體數(shù)據(jù)計(jì)算得到的遺傳分化系數(shù)GST和NST分別是0.178和0.574(P<0.05)，基于核基因數(shù)據(jù)算得的遺傳分化系數(shù)GST和NST分別是0.511和0.630(P<0.01)，均表明鉆葉龍膽具有顯著的譜系地理結(jié)構(gòu)。分子變異分析的結(jié)果表明，鉆葉龍膽中發(fā)生在種群間的遺傳變異略高于發(fā)生在種群內(nèi)的變異；其中種群間的遺傳變異在葉綠體數(shù)據(jù)中占比53.14%，在ITS數(shù)據(jù)中占比51.12%(表2)。遺傳分化系數(shù)FST在葉綠體數(shù)據(jù)和ITS數(shù)據(jù)中分別為0.531和0.511。

表1 本研究中鉆葉龍膽的樣品信息與遺傳多樣性指數(shù)

鉆葉龍膽葉綠體單倍型間沒(méi)有清晰的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，分化時(shí)間分析表明鉆葉龍膽葉綠體單倍型的分化發(fā)生在1.6 Ma(95%置信區(qū)間: 0.66-2.65 Ma)(圖2，A)，在地質(zhì)時(shí)間上處于第四紀(jì)更新世。中央網(wǎng)絡(luò)連接圖表明單倍型cH2位于網(wǎng)絡(luò)中央，表明鉆葉龍膽種群大小在近期發(fā)生過(guò)擴(kuò)張(圖2，B)。

表2 鉆葉龍膽種群分子變異分析

A.枝上數(shù)值表示貝葉斯后驗(yàn)概率，主要節(jié)點(diǎn)的分化時(shí)間用箭頭表示，灰條表示95%的置信區(qū)間；B. 圖中圓圈大小表示單倍型數(shù)量圖2 基于葉綠體數(shù)據(jù)的鉆葉龍膽單倍型(cH1-cH7)分化時(shí)間(A)與中央網(wǎng)絡(luò)連接圖(B)A. Numbers on the branches indicate Bayesian posterior probabilities; node age estimates are marked with black arrows; grey bars represent 95% highest posterior densities； B. Pie charts display number of each haplotypeFig.2 Results of divergence time and median-joining network among chloroplast haplotypes (cH1-cH7) in Gentiana haynaldii

2.2 種群動(dòng)態(tài)歷史與物種歷史分布范圍

基于葉綠體和ITS數(shù)據(jù)的分析結(jié)果表明，鉆葉龍膽的歧點(diǎn)分布圖均為多峰曲線(圖3)，說(shuō)明在較長(zhǎng)時(shí)間段內(nèi)種群大小相對(duì)穩(wěn)定?；谌~綠體數(shù)據(jù)的中性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)u’sFs為-2.247(P=0.154)，Tajima’sD為-0.533(P=0.389)；ITS數(shù)據(jù)顯示Fu’sFs為-24.532(P=0)，Tajima’sD為1.229(P=0.909)。

A. 葉綠體數(shù)據(jù)；B. nrITS數(shù)據(jù)圖3 鉆葉龍膽歧點(diǎn)分布分析曲線圖A. Plastid data; B. nrITS dataFig.3 Result of mismatch distribution analysis of Gentiana haynaldii

通過(guò)泊松相關(guān)性分析，保留了9個(gè)生物氣候因子(bio1-bio4，bio7，bio12-bio15)用于鉆葉龍膽的歷史分布區(qū)重建。結(jié)果表明，鉆葉龍膽從末次間冰期到現(xiàn)在的歷史分布范圍比較穩(wěn)定，僅在全新世中期有小幅度的收縮，隨后向北小幅擴(kuò)張到現(xiàn)今的分布范圍(圖4)。

A.現(xiàn)在; B. 中全新世(～6 kya); C. 末次盛冰期(～22 kya); D. 末次間冰期(～120-140 kya)圖4 基于物種分布模型模擬鉆葉龍膽的潛在適宜分布區(qū)A. Current; B. Mid Holocene (～6 kya); C. Last Glacial Maximum (～22 kya); D. Last Interglacial (～120-140 kya); The value of predicted habitat suitability is indicated by the bars in each panelFig.4 Estimated climatic niches for distribution of Gentiana haynaldii

3 討 論

本研究表明，小龍膽組鉆葉龍膽經(jīng)歷了近期的種內(nèi)遺傳分化，遺傳多樣性較高。鉆葉龍膽的遺傳分化系數(shù)FST在葉綠體數(shù)據(jù)和ITS數(shù)據(jù)中分別為0.532和0.511，高于龍膽屬其他多年生物種，如阿墩子龍膽(G.atuntsiensisW.W. Smith，F(xiàn)ST= 0.232，AFLP數(shù)據(jù))[42]、多花龍膽(G.striolataT.N. Ho，F(xiàn)ST= 0.226，AFLP數(shù)據(jù))[42]、何氏秦艽(G.hoaeP.C. Fu & S.L. Chen,FST= 0.185，葉綠體數(shù)據(jù)；FST= 0.423，ITS數(shù)據(jù))[21]、線葉龍膽[G.lawrenceivar.farreri(Balf. f.) T. N. Ho,FST= 0.488，葉綠體數(shù)據(jù)；FST= 0.175，SSR數(shù)據(jù)][19]。雖然目前已對(duì)青藏高原地區(qū)植物開(kāi)展了大量遺傳分化與進(jìn)化研究，但絕大多數(shù)以多年生植物為研究對(duì)象，以一年生植物為對(duì)象的進(jìn)化研究較少，僅見(jiàn)于一年生植物星葉草(CircaeasteragrestisMaxim，F(xiàn)ST= 0.128-0.891，基因組數(shù)據(jù))[43]和二年生植物羽葉點(diǎn)地梅(PomatosacefiliculaMaxim.，F(xiàn)ST= 0.560，葉綠體數(shù)據(jù))[44]等，二者種內(nèi)遺傳分化程度均很高，與鉆葉龍膽相似。雖然不同研究所用分子標(biāo)記的遺傳方式和分辨率有所不同，遺傳分化系數(shù)FST絕對(duì)值不能簡(jiǎn)單進(jìn)行直接比較，但這些結(jié)果也足以表明鉆葉龍膽種內(nèi)遺傳分化程度高，且普遍高于多年生龍膽屬植物。

鉆葉龍膽的高遺傳分化程度可能有四方面的原因。第一，鉆葉龍膽是一年生草本植物，由于世代周期短，進(jìn)化速率快[15-16]，加速了遺傳變異的積累。第二，自花授粉植物由于基因流減弱，利于遺傳分化的發(fā)生。雖然目前缺乏詳細(xì)的鉆葉龍膽傳粉生態(tài)學(xué)資料，但由于小龍膽組植物多為自花授粉，鉆葉龍膽也具備自花授粉的形態(tài)特征[12]，因此，其傳粉生態(tài)學(xué)特征也是鉆葉龍膽遺傳分化程度高的成因之一。第三，鉆葉龍膽分布地區(qū)多為山脈峽谷地貌，易于形成片段化生境，起到了降低居群間基因流的作用，從而促進(jìn)了種內(nèi)的遺傳分化。第四，過(guò)去環(huán)境與氣候變化對(duì)種群動(dòng)態(tài)的影響?；诜肿隅娔Ｐ偷墓浪惚砻縻@葉龍膽的種內(nèi)分化發(fā)生在第四紀(jì)冰期以來(lái)。該時(shí)間段的青藏高原地區(qū)無(wú)劇烈的造山運(yùn)動(dòng)，以反復(fù)的冰川運(yùn)動(dòng)為主[3, 5]，因此，第四紀(jì)冰期以來(lái)的環(huán)境與氣候變化是鉆葉龍膽遺傳分化的主要外部誘因。由于鉆葉龍膽是典型的高山植物，分布海拔范圍為2 100～4 200 m[12]，因此在氣候變冷時(shí)其分布范圍在青藏高原地區(qū)傾向于增大，而在氣候變暖時(shí)其分布范圍縮小，這與本研究的物種分布模型結(jié)果以及其他高山植物相一致[11]。在應(yīng)對(duì)環(huán)境與氣候變化過(guò)程中的生境片段化和天空島效應(yīng)(sky island)[45-46]可能是鉆葉龍膽遺傳分化的主要機(jī)制。

葉綠體數(shù)據(jù)顯示鉆葉龍膽種群的遺傳多樣性水平在云南與四川西部較高。雖然該地區(qū)是眾多高山植物的冰期避難所[8-10, 47]，由于鉆葉龍膽分化時(shí)間較短，本研究中單倍型間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系不夠明確，無(wú)法確定種內(nèi)單倍型的進(jìn)化歷程，因而基于現(xiàn)有數(shù)據(jù)尚無(wú)法鑒定出一個(gè)明顯的冰期避難所。此外，核基因數(shù)據(jù)顯示鉆葉龍膽沒(méi)有明顯的遺傳多樣性中心與分化中心，大部分單倍型為種群所獨(dú)有。這種分布式樣與一些高山植物和冰緣植物類似[10, 48]。

種群進(jìn)化歷史分析結(jié)果中，中性檢驗(yàn)和中央網(wǎng)絡(luò)圖表明鉆葉龍膽發(fā)生整體擴(kuò)張，但歧點(diǎn)分布分析結(jié)果表明其近期種群大小穩(wěn)定。不同種群進(jìn)化歷史分析方法的結(jié)果不一致在基于DNA片段數(shù)據(jù)分析時(shí)比較多見(jiàn)，如青藏高原一些冰緣植物[48]等。這種不一致可能有多種原因，包括復(fù)雜遺傳結(jié)構(gòu)和有限的變異位點(diǎn)均可能對(duì)歧點(diǎn)分布分析產(chǎn)生影響。因此，鉆葉龍膽的種群進(jìn)化歷史還有待進(jìn)一步研究。