檸條錦雞兒CkPHB基因調(diào)控木質(zhì)部發(fā)育增強植物抗旱性的功能分析

李佳陽，謝麗芳，任潔潔，龔春梅*

(1 西北農(nóng)林科技大學 生命科學學院，陜西楊陵 712100；2 西北農(nóng)林科技大學 園藝學院，陜西楊陵 712100)

檸條錦雞兒(Caraganakorshinskii)是豆科(Leguminosae)錦雞兒屬(Caragana)植物。廣泛分布于中國西北荒漠及半荒漠地區(qū)的沙地，具有抗旱、抗寒、耐高溫等多種優(yōu)良性狀，是一種兼具生態(tài)和經(jīng)濟效益的灌木[1-2]。干旱脅迫作為世界范圍內(nèi)影響作物產(chǎn)量的重要制約因素之一，極大地影響了植物的生長發(fā)育及分布區(qū)域[3-4]。干旱半干旱地區(qū)分布的植物經(jīng)過長期適應，也表現(xiàn)出諸多抗旱特性。對檸條錦雞兒的研究發(fā)現(xiàn)，Ckγ-ECS基因通過調(diào)節(jié)CkFAMA和CkSTOMAGEN基因的表達影響氣孔密度提高植物的抗旱性[5]。同時，檸條錦雞兒葉片中 C4光合酶表達量同樣隨著干旱程度的加劇而增加，逐步表現(xiàn)出向 C4特征的轉(zhuǎn)變[6]。除此之外，在干旱脅迫下，檸條錦雞兒CkWRKY家族成員CkWRKY2、CkWRKY4、CkWRKY75通過促進滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累及抗氧化酶系統(tǒng)的表達增強了植物的抗旱性，其轉(zhuǎn)基因植株葉片失水率、丙二醛含量均低于野生型，表現(xiàn)出更好的生存狀態(tài)[7]。鑒于檸條錦雞兒對保護生態(tài)環(huán)境、完成生態(tài)修復等方面具有的重要作用，以及應對干旱的多種抗逆特性，成為研究植物抗逆機制的理想材料。

目前與檸條錦雞兒相關(guān)的研究主要集中在其生物學特性、生理變化以及解剖結(jié)構(gòu)等方面，而檸條錦雞兒在不同的干旱響應模式下，通過形成更發(fā)達的葉脈應對干旱脅迫的表型明顯，但關(guān)注較少。擬南芥HD-ZIP Ⅲ家族成員PHB被認為參與了葉片近軸面特征的建立以及頂端分生組織的發(fā)育[8-9]。擬南芥中PHB和PHV基因功能獲得型突變體phb-d和phv-d株系擬南芥以及玉米rld1突變體均產(chǎn)生了葉片黃化及上卷的表型[8, 10]。此外，葉原基從莖頂端分生組織向外生長的過程中，近軸端和遠軸端的位置分別形成成熟葉片的上表面和下表面。phb-d和phv-d突變導致葉片遠軸面向近軸面特征轉(zhuǎn)變，受影響最嚴重的葉脈維管束表現(xiàn)出徑向?qū)ΨQ的方式發(fā)育，并在其周圍表現(xiàn)出正面特征[11]。

本研究通過免疫組織化學染色對CkPHB蛋白在檸條錦雞兒葉片中組織水平定位進行分析，后將CkPHB基因在擬南芥中過表達功能驗證，通過熒光定量PCR的方法分析了轉(zhuǎn)基因擬南芥中相關(guān)基因的表達量，同時對轉(zhuǎn)基因擬南芥干旱處理表型進行觀察，為豐富檸條錦雞兒抗旱機制提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本實驗所用材料為西北農(nóng)林科技大學實驗場自然生長大約10年的檸條錦雞兒，挑選健康飽滿的檸條錦雞兒種子用清水沖洗干凈，濕紗布包裹后置于黑暗環(huán)境中室溫萌發(fā)3～5 d，待種子萌發(fā)后移栽入盆。用于轉(zhuǎn)化的野生型擬南芥為哥倫比亞型擬南芥(Col-0)，擬南芥種子置于無菌水中4 ℃避光春化2 d，經(jīng)10%次氯酸鈉清洗滅菌5 min，無菌水潤洗6～8次，鋪于相應的1/2 MS固體培養(yǎng)基上，正常培養(yǎng)5～7 d，后將擬南芥幼苗移栽入盆。

1.2 主要實驗試劑

普通反轉(zhuǎn)錄酶MMLV(TaKaRa，2641A)，植物總RNA提取試劑盒(鄭州貝貝生物科技有限公司，Cat# 082002)，去基因組cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，RR047A)，熒光定量試劑盒(TaKaRa，RR820A)，高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase(TaKaRa，R045B)，通用型DNA凝膠回收試劑盒(天根，DP209)、SP Rabbit HRP Kit(康為世紀，CW2035S)。

1.3 方 法

1.3.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄選取生長適宜的植物葉片，具體步驟參照RNA提取試劑盒說明書進行提取。通過Nanodrop 2000測定RNA提取濃度，選用OD260/280為1.9～2.1且OD260/230>2的RNA。吸取1～2 μL RNA溶液與DNA上樣緩沖液混勻，用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA提取質(zhì)量，高質(zhì)量RNA應為3條帶，且28S RNA亮度約為18S RNA的2倍。

去基因組反轉(zhuǎn)錄(用于qRT-PCR)。吸取1 μg總RNA，加入基因組DNA清除溶液42 ℃反應2 min，去除RNA溶液中殘余的基因組DNA干擾，之后參照說明書步驟將剩余試劑依次加入上一步反應溶液中，37 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min，85 ℃反應5 s將反轉(zhuǎn)錄酶滅活，所得溶液即為cDNA溶液，使用時將cDNA溶液稀釋3～5倍作為qRT-PCR的模板。

普通MMLV反轉(zhuǎn)錄單酶反轉(zhuǎn)錄(用于基因擴增)。MMLV單酶的反轉(zhuǎn)錄效率更高，適用于長鏈RNA反轉(zhuǎn)。本實驗使用時略作修改，將反轉(zhuǎn)錄RNA的總量由1 μg提升為3 μg，減少無酶水的體積，增加MMLV單酶的用量至1.5 μL，但不增加總反應體系，使cDNA濃度大大增加，有利于微量或復雜基因的克隆。

1.3.2 檸條錦雞兒CkPHB全長cDNA克隆以普通MMLV反轉(zhuǎn)錄單酶反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，設計擴增引物CkPHB-F及CkPHB-R(表1)，使用高保真酶PrimeSTAR Max 按照56 ℃、58 ℃、60 ℃梯度退火擴增。具體反應擴增條件：98 ℃ 預變性2 min，98 ℃變性15 s，梯度退火10 s，72 ℃延伸20 s，72 ℃后延伸5 min，總計35個循環(huán)。

1.3.3 生物信息學分析通過pfam(http://pfam.xfam.org/)對其蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行分析；利用Mega[12-13]進行系統(tǒng)進化分析，算法采用鄰接法，Bootstrap值設置為1 000。

1.3.4 CkPHB抗體制備及免疫組化分析通過人工合成CkPHB蛋白上具有免疫原性的肽段，對生長健康的新西蘭大白兔進行皮下注射。經(jīng)4次免疫后進行心臟采血，恒溫靜置收集血清即可作為CkPHB蛋白多克隆抗體使用。取檸條錦雞兒葉脈石蠟切片脫蠟復水，經(jīng)乙醇梯度復水至純水后，將玻片浸入抗原修復液(A液：二水枸櫞酸三鈉29.41 g+蒸餾水1 000 mL；B液：枸櫞酸21 g+蒸餾水1 000 mL；工作液：A液82 mL+B液18 mL+蒸餾水900 mL)中進行微波修復，待玻片自然冷卻至室溫，通過SP法進行免疫組化染色，之后通過DAB進行顯色，明場下采集照片[14]。免疫組化所用部分試劑由SP Rabbit HRP Kit試劑盒提供，結(jié)合自制CkPHB一抗對檸條錦雞兒葉片制備的石蠟切片中CkPHB蛋白的組織水平表達模式進行觀測。

1.3.5 擬南芥轉(zhuǎn)化及表型分析將確認無誤的CkPHB表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，28 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，離心收菌，用重懸液(5%蔗糖溶液、0.04%表面活性劑silwet)重懸至OD6000.6～1.0。采用蘸花法對擬南芥進行侵染[15]，將擬南芥未開放的花浸入侵染液中30～60 s，之后洗去殘留的菌液，避光保濕培養(yǎng)12 h后改為正常培養(yǎng)。通過潮霉素對采集得到的種子進行篩選，轉(zhuǎn)基因擬南芥能夠正常生長，野生型擬南芥無法正常生長。

1.3.6 相關(guān)基因?qū)崟r定量PCR利用Premier Primer 5.0設計相關(guān)基因的定量引物(表1)，反應體系參照說明書體系進行。實時定量PCR條件如下：95 ℃預變性30 s，然后95 ℃變性5 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，總計進行40個循環(huán)，然后進行熔解曲線分析，通過2-ΔΔCt的方法對相關(guān)基因的相對表達量進行計算[16]。每個樣品設置3個生物學重復和3個技術(shù)重復。

表1 檸條錦雞兒相關(guān)基因定量及克隆所用引物

1.3.7 生理指標測定丙二醛含量的測定。稱取植物材料0.2～0.3 g(根據(jù)材料的受傷害程度)，剪碎，加入2 mL 10% TCA溶液和少量的石英砂研磨至勻漿。加入3 mL TCA溶液進一步研磨，勻漿轉(zhuǎn)移至試管中，4 000 r/min離心15 min，取上清液2 mL加入2 mL TBA溶液將試管放入沸水浴中煮沸15 min(自試管內(nèi)溶液中出現(xiàn)小氣泡開始計時)，取出試管并冷卻，再次離心取上清，測定450、532、600 nm的吸光度值[17]。

相對電導率的測定。取大小相當?shù)闹参锶~片(盡量保證葉片的完整性，少含莖節(jié))，用自來水沖洗后再用蒸餾水沖洗干凈，用濾紙吸凈表面水分。避開主脈將葉片切割成大小一致的葉塊，盡快稱量0.1 g放入10 mL去離子水中不斷抽氣，直至葉片完全沉入水底處理3 h。用電導儀測定浸提液電導率(R1)，然后沸水浴加熱30 min，冷卻至室溫后搖勻，再次測定浸提液電導率(R2)，重復3次。相對電導率(%)=(R1/R2)×100%[18]。

脯氨酸含量的測定。每個樣品均取0.2～0.3 g，分別置于大試管中，加入5 mL 3%磺基水楊酸溶液，于沸水浴中浸提10 min，冷卻至室溫，3 000 r/min離心10 min，取上清2 mL待測。同時配制脯氨酸標準曲線濃度梯度為0、1、2、4、6、8、10 μg/mL，各取2 mL，并加入2 mL冰醋酸、4 mL酸性茚三酮溶液和2 mL 3%磺基水楊酸溶液，搖勻，沸水浴加熱顯色1 h，冷卻至室溫，加入4 mL甲苯，充分振蕩萃取紅色產(chǎn)物，靜置分層，取紅色甲苯溶液520 nm處測吸光度[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸條錦雞兒CkPHB基因克隆及保守結(jié)構(gòu)域分析

以檸條錦雞兒幼嫩葉片提取出來的RNA經(jīng)MMLV單酶反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，通過PrimeSTAR Max高保真酶設計溫度梯度PCR擴增，得到了大小為1 200 bp左右的DNA片段(圖1，A)。連接到TOPO載體后挑取陽性克隆(圖1，B)鑒定。測序結(jié)果顯示，實驗克隆得到了CkPHB的編碼序列共計1 170 bp。從NCBI獲得擬南芥HD-ZIP Ⅲ家族成員ATHB8、AtPHV、AtPHB、AtREV及ATHB15的蛋白序列，與檸條錦雞兒對應HD-ZIP Ⅲ家族成員蛋白序列一起通過pfam網(wǎng)站進行蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析(圖2，A)。同時將檸條錦雞兒與鷹嘴豆(Cicerarietinum)、毛果楊(Populustrichocarpa)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)等的PHB蛋白進行了系統(tǒng)發(fā)育分析(圖2，B)。相比于其余成員，CkPHB蛋白結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了較大變化。

A.CkPHB基因克隆(M為marker；1-3. 3個溫度梯度)；B.菌落PCR檢測(M為marker；1-4. 不同單菌落檢測結(jié)果)圖1 檸條錦雞兒CkPHB基因克隆A. CkPHB gene clone (M is marker; 1-3. 3 temperature gradients); B. Colony PCR detection (M is marker;1-4. Detection results of different single colonies)Fig.1 Cloning of CkPHB gene from C. korshinskii

A.檸條錦雞兒HD-ZIP Ⅲ家族蛋白保守結(jié)構(gòu)與分析；B.不同物種PHB蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析；CaPHB. Cicer arietinum PHB；PtPHB. Populus trichocarpa PHB；AtPHB. Arabidopsis thaliana PHB；CkPHB. Caragana korshinskii PHB；GmPHB. Glycine max PHB；CcPHB. Cajanus cajan PHB圖2 CkPHB蛋白結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育分析A. Conservative structure and analysis of HD-ZIP Ⅲ family proteins of C. korshinskii; B. Phylogenetic analysis of PHB proteins in different species; CaPHB. Cicer arietinum PHB; PtPHB. Populus trichocarpa PHB; AtPHB. Arabidopsis thaliana PHB; CkPHB. Caragana korshinskii PHB; GmPHB. Glycine max PHB; CcPHB. Cajanus cajan PHBFig.2 Structure and phylogenetic analysis of CkPHB protein

2.2 檸條錦雞兒CkPHB功能驗證及相關(guān)基因表達分析

通過人工合成CkPHB蛋白序列上具有免疫原性的小肽，制備檸條錦雞兒CkPHB多克隆抗體。選取適宜大小的檸條錦雞兒幼嫩葉片制備石蠟切片，脫蠟后經(jīng)過一系列乙醇梯度復水及抗原修復處理，通過SP法對CkPHB蛋白的組織水平表達模式進行觀察(圖3)。結(jié)果表明，CkPHB蛋白特異定位于檸條錦雞兒葉脈維管束木質(zhì)部區(qū)域，為其調(diào)控木質(zhì)部的發(fā)育提供了空間基礎。為了驗證其是否可以調(diào)控木質(zhì)部的發(fā)育，把p35S∷CkPHB-GFP融合載體轉(zhuǎn)化進農(nóng)桿菌GV3101，鑒定無誤后通過蘸花法侵染擬南芥，并經(jīng)含有潮霉素的1/2 MS培養(yǎng)基篩選3代，最終獲得了擬南芥CkPHB過表達株系(CkPHB-OE)T3代轉(zhuǎn)基因植株3株。

A.實驗組；B.對照組；xy. 木質(zhì)部；標尺=50 μm圖3 檸條錦雞兒CkPHB蛋白定位于木質(zhì)部導管周圍A. Experiment; B. Control; xy. Xylem; Scale = 50 μmFig.3 The CkPHB protein of C. korshinskii is located around the xylem vessel

采集擬南芥野生型(WT)和CkPHB-OE株系的葉片，經(jīng)過乙醇脫色及NaOH處理去除葉肉后，通過番紅對擬南芥葉脈進行染色觀察(圖4)。相較于野生型擬南芥，擬南芥CkPHB-OE株系葉脈更為發(fā)達。除此之外，對擬南芥野生型和CkPHB-OE株系的葉片石蠟切片進行番紅-固綠二重染色觀察(圖5)。結(jié)果表明，擬南芥CkPHB-OE株系比野生型擬南芥維管束體積增大，木質(zhì)部導管數(shù)量增加。對擬南芥CkPHB-OE株系中與導管發(fā)育相關(guān)的基因表達水平進行定量分析，與細胞凋亡相關(guān)的XCP2、纖維素合成酶及木質(zhì)素合成途徑關(guān)鍵酶基因在過表達CkPHB基因植株中均上調(diào)表達(圖6)。

CkPHB-OE. 擬南芥轉(zhuǎn)CkPHB基因過表達株系T3代植株；WT. 擬南芥野生型。下同圖4 擬南芥CkPHB-OE株系與野生型葉脈密度比較CkPHB-OE. A. thaliana transgenic CkPHB gene overexpression line T3 generation plant; WT. A. thaliana wild type. The same as belowFig.4 Comparison of leaf vein density between A. thaliana CkPHB-OE Strain and wild type

TE. 導管元件；標尺=50 μm圖5 擬南芥CkPHB-OE株系與野生型葉脈木質(zhì)部結(jié)構(gòu)特征比較TE. Tracheary element; Scale = 50 μmFig.5 Comparison of leaf vein xylem structure between CkPHB-OE strain and wild type of A. thaliana

*. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001圖6 擬南芥導管發(fā)育相關(guān)基因的表達分析*. P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001Fig.6 Expression analysis of genes related to vessel development in A. thaliana

2.3 擬南芥CkPHB-OE株系抗旱性分析

轉(zhuǎn)基因擬南芥種子置于4 ℃避光春化2 d后，經(jīng)含有潮霉素的1/2 MS培養(yǎng)基篩選，將陽性植株與野生型擬南芥幼苗移栽至土里，約15 d左右開始進行干旱處理。相比于野生型擬南芥，轉(zhuǎn)基因擬南芥在干旱脅迫條件下的生存率顯著提高，相比于擬南芥野生型具有明顯更好的生長狀態(tài)，抗旱能力明顯提高(圖7，A)。采集相應處理植物樣本進行生理指標測定，結(jié)果顯示，擬南芥CkPHB-OE株系相比于野生型，在干旱條件下具有更低的丙二醛含量以及相對電導率，同時積累了相對更多的脯氨酸。表明，CkPHB-OE株系比野生型擬南芥具有顯著更輕的脅迫水平(圖7，B)，進一步驗證了上述結(jié)論。

A. 擬南芥干旱處理表型觀察，Line 1-3表示轉(zhuǎn)CkPHB基因擬南芥不同株系; B. 不同小寫字母表示處理間在0.05水平差異顯著圖7 轉(zhuǎn)CkPHB基因擬南芥株系的抗旱能力及其生理特性A. The phenotype observation of A. thaliana under drought treatment, Line1-3 represented different lines of CkPHB transgenic A. thaliana; B. There was a significant difference at the level of 0.05 between different normal lettersFig.7 Drought resistance and physiological characteristics of CkPHB transgenic A. thaliana strains

3 討 論

干旱脅迫作為世界范圍內(nèi)影響作物產(chǎn)量的重要制約因素之一，極大地影響了植物的生長發(fā)育[3]。植物在長期應對干旱并產(chǎn)生適應性進化的過程中，逐步形成一系列迅速感知外界環(huán)境變化并隨之主動應答的適應機制，從而能夠緩解干旱脅迫造成的損傷[15]。葉脈維管系統(tǒng)主要通過木質(zhì)部運輸水分和無機鹽，并通過韌皮部輸出光合產(chǎn)物。植物在干旱脅迫下形成更加發(fā)達的葉脈從而提高水分運輸效率，加強對水分的吸收，這種應對干旱脅迫的表型已經(jīng)引起了更多的關(guān)注[27-29]。本研究發(fā)現(xiàn)擬南芥CkPHB-OE株系葉脈密度趨于發(fā)達，與前人報道一致，在干旱脅迫條件下，發(fā)達的葉脈顯著提高了擬南芥CkPHB-OE株系的抗旱能力。

HD-ZIP Ⅲ家族在胚胎模式形成、分生組織維持、葉片發(fā)育、維管系統(tǒng)發(fā)育、花序結(jié)構(gòu)以及對環(huán)境信號的響應和衰老調(diào)節(jié)中發(fā)揮著廣泛的調(diào)控作用[20-24]。PHB是HD-ZIP Ⅲ轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，被認為參與了葉片近軸面特征的建立和頂端分生組織的發(fā)育[8-9]。盡管phbphv單突變體及雙突變體沒有產(chǎn)生明顯的表型變化，但revphbphv三重突變體加劇了rev單突的表型，表現(xiàn)出導管的數(shù)量和體積顯著減少。雖然phbphv突變體沒有觀察到表型的變化，但與擬南芥野生型相比，擬南芥phb-d和phv-d株系表現(xiàn)出葉片遠軸面特征向近軸面特征轉(zhuǎn)變，木質(zhì)部趨于發(fā)達，同時擬南芥revphbphv三重功能獲得型突變體進一步加強了rev-10d的表型，木質(zhì)部導管數(shù)量顯著增多[8-11, 25-26]。對擬南芥CkPHB-OE株系葉脈切片進行番紅-固綠二重染色，相比于擬南芥野生型株系，轉(zhuǎn)基因擬南芥葉脈維管束木質(zhì)部趨于發(fā)達，且轉(zhuǎn)基因擬南芥中與導管發(fā)育相關(guān)的基因表達量均被CkPHB上調(diào)，與先前phb-d株系擬南芥表型結(jié)果一致[11]，表明CkPHB蛋白結(jié)構(gòu)的改變并未使其功能受到顯著影響。

本研究以廣泛生長于中國西北干旱半干旱地區(qū)的耐旱植物檸條錦雞兒為研究對象，克隆得到了檸條錦雞兒中HD-ZIP Ⅲ家族成員CkPHB基因，其全長序列1 170 bp，并對其蛋白結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)以及調(diào)控功能做了初步的探究。免疫組化結(jié)果表明，CkPHB定位于檸條錦雞兒葉脈木質(zhì)部區(qū)域，與水稻HD-ZIP Ⅲ家族成員OsHB3及OsHB4具有相同組織定位[30]。在擬南芥中進行功能驗證發(fā)現(xiàn)，擬南芥CkPHB-OE株系相比于野生型擬南芥，維管束體積增大，木質(zhì)部導管數(shù)量同樣增加。對轉(zhuǎn)基因擬南芥進行干旱處理發(fā)現(xiàn)，相比于野生型擬南芥，具有更加發(fā)達木質(zhì)部導管的CkPHB-OE株系擬南芥的抗性生理指標顯著提高導致抗旱能力增強。本研究證實CkPHB在促進葉脈發(fā)育提高植物抗旱性中發(fā)揮重要作用，但其具體的調(diào)控機制還有待進一步研究。