基于數(shù)據(jù)融合的細(xì)菌素發(fā)掘及類別判定模型

楊慧慧，李柏林，李航，陳昊，劉程國，王玉堂

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，哈爾濱150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 分析測試中心，哈爾濱150030)

0 引言

細(xì)菌素是由細(xì)菌在代謝過程中通過核糖體合成機制產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的多肽或蛋白質(zhì)類物質(zhì)，對其他細(xì)菌具有抗菌活性[1]。細(xì)菌素是一種無抗藥性、無殘留的天然蛋白類抗菌劑，具有成本低、生產(chǎn)快、廣譜殺菌等優(yōu)點，而且能安全有效地抑制病原體生長，是一種極具潛力的食品防腐劑[2]。近年來，科學(xué)家挑選少數(shù)的細(xì)菌素進(jìn)行了深入的研究，開辟出細(xì)菌素新的研究領(lǐng)域，并拓寬了其應(yīng)用范圍。隨著遺傳學(xué)和納米技術(shù)的快速發(fā)展，細(xì)菌素極有可能發(fā)展成為下一代新型抗生素[3]、新型載體分子[4]、腫瘤治療的藥物[5]等。因此，如何發(fā)現(xiàn)更多的新型細(xì)菌素成為如今研究的熱點。

1925年首次命名細(xì)菌素以來，科研人員主要通過多種實驗手段研究細(xì)菌素、確定抑菌譜以及評價抑菌能力[6]，這種方法耗費大量的時間、精力及費用。細(xì)菌素具有多種獨特的序列和結(jié)構(gòu)特征，因此，采用生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌素并進(jìn)行進(jìn)一步研究逐漸成為一個趨勢。通過生物信息技術(shù)發(fā)掘細(xì)菌素主要分為兩種方法。一種是序列比對，最常見的是蛋白質(zhì)序列之間和核酸序列之間的兩兩比對。比對工具有FASTA[7]、CLUSTALW[8]、HMMER[9]、BLAST[10]等。基 于這種方法發(fā)現(xiàn)了一系列細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)特征，可以用來識別細(xì)菌素。Yount等[11]在細(xì)菌素中發(fā)現(xiàn)了一個保守的“GXC”序列基序，這段基序在蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中形成特定的結(jié)構(gòu)域。Schutte等[12]利用BLAST等分析工具在能表達(dá)細(xì)菌素的細(xì)菌的染色質(zhì)區(qū)域發(fā)現(xiàn)了防御素基因。由于細(xì)菌素的抗菌作用不取決于單一的蛋白質(zhì)序列信息、結(jié)構(gòu)信息及相應(yīng)氨基酸的理化信息，而是這些信息的綜合反映，因此這種方法準(zhǔn)確度一直不夠高[13]。另一種方法是基于細(xì)菌素氨基酸的理化性質(zhì)、三維結(jié)構(gòu)與空間特征進(jìn)行預(yù)測，通過建立氨基酸理化性質(zhì)數(shù)據(jù)庫[14]，計算細(xì)菌素的數(shù)學(xué)描述符，利用數(shù)學(xué)模型進(jìn)行細(xì)菌素的識別和預(yù)測。這種方法更常見于二肽和三肽數(shù)學(xué)模型的構(gòu)建[15]，在肽鏈長度較長且氨基酸數(shù)量相差較多的細(xì)菌素的研究中，模型準(zhǔn)確度也不高。

缺少建立生物大分子數(shù)學(xué)描述符的方法和數(shù)學(xué)模型選擇不準(zhǔn)確是導(dǎo)致上述研究準(zhǔn)確度不高的主要原因。本研究利用數(shù)據(jù)融合技術(shù)，對細(xì)菌素氨基酸序列的排列信息、物理化學(xué)性質(zhì)、蛋白質(zhì)同源模型的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)等進(jìn)行篩選整合，作為細(xì)菌素的數(shù)學(xué)描述符；利用機器學(xué)習(xí)方法建立了一種從細(xì)菌分泌的類細(xì)菌素蛋白片段中發(fā)掘細(xì)菌素并進(jìn)行類型判別的數(shù)學(xué)模型。此方法能夠極大提高細(xì)菌素的發(fā)現(xiàn)速度，為細(xì)菌素在食品、畜牧業(yè)養(yǎng)殖、醫(yī)療健康等多個領(lǐng)域的應(yīng)用提供幫助。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集的構(gòu)建

細(xì)菌素數(shù)據(jù)主要來源于研究細(xì)菌素的相關(guān)文獻(xiàn)和公開發(fā)表的細(xì)菌素數(shù)據(jù)庫，包括AMPs from Bacteria(http://bacteriocins.cpu-bioinfor.org/)[16]和BCAIBASE(http://bactibase.hammamilab.org/main.php)[17]。數(shù)據(jù)庫中細(xì)菌素的基本信息包括細(xì)菌素的氨基酸序列、英文名稱、細(xì)菌素分類、細(xì)菌素抑菌譜及相應(yīng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)文件等信息。從Uniprot(https://www.uniprot.org/)和PDB(http://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)中，篩選出來自細(xì)菌或真菌、氨基酸序列長度介于5～100之間[18]、經(jīng)研究不具抗菌抑菌能力的蛋白質(zhì)，加入非細(xì)菌素蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)集。從Uniprot數(shù)據(jù)庫和PDB數(shù)據(jù)庫中，篩選出來自細(xì)菌、氨基酸序列長度介于5～100之間、未經(jīng)抗菌抑菌能力研究的蛋白質(zhì)，加入細(xì)菌分泌的類細(xì)菌素蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)集。所有數(shù)據(jù)通過人工交叉復(fù)查，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可信性。

1.2 描述符的生成和篩選

將細(xì)菌素氨基酸序列通過MOE(Molecular Operating Environment)(v2015.10)和Swiss-Model[19-20]進(jìn)行蛋白質(zhì)同源建模，得到細(xì)菌素蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。一般情況下，模板序列和靶序列相似性大于30%就可以用于同源建模，序列的同源性越高則結(jié)構(gòu)模型的準(zhǔn)確性越高[21]，本研究以細(xì)菌素氨基酸序列與模板序列之間的相似性大于50%為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，將得到細(xì)菌素的三級結(jié)構(gòu)與非細(xì)菌素蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)相結(jié)合。將細(xì)菌素的氨基酸序列與所得到的三級結(jié)構(gòu)分別利用MOE軟件和E-Dragon[22]生成2D、3D、pro3種描述符，接著，對描述符進(jìn)行篩選，保留顯著性高的描述符。然后，將保留的描述符進(jìn)行主成分分析，保留貢獻(xiàn)率大的主成分作為本文所構(gòu)建的新型細(xì)菌素描述符（以下稱為Pes描述符）。

1.3 細(xì)菌素發(fā)掘模型的建立

1.3.1 模型構(gòu)建

細(xì)菌素發(fā)掘模型分別是由Pes、2D、3D、pro 4種描述符構(gòu)建的RF模型和支持向量機(Support Vector Machine，SVM)模型[23]，均由R語言實現(xiàn)。SVM可由R中免費的“e1071”包用于實現(xiàn)該功能。RF可由R中Random Forest包（ver 4.6.14）來實現(xiàn)的。

1.3.2 模型評估

評估分類模型的指標(biāo)常采用準(zhǔn)確度。計算公式分別如下：

式中：真正例(True Positive,TP)、真負(fù)例(True Negative,TN)為正確的分類；假正例(False Positive,FP)為非細(xì)菌素蛋白質(zhì)被預(yù)測為細(xì)菌素的情況；假負(fù)例(False Negative,FN)為細(xì)菌素被預(yù)測為非細(xì)菌素蛋白質(zhì)的情況。

1.4 細(xì)菌素類別判定模型的建立

1.4.1 模型構(gòu)建

細(xì)菌素類別判定模型采用KNN和SVM。KNN模型由R語言kernlab包（ver 0.9.29）與kknn包（ver 1.3.1）實現(xiàn)。由于細(xì)菌素三級結(jié)構(gòu)數(shù)量不足，為了增加樣本量，選擇細(xì)菌素氨基酸序列描述符作為細(xì)菌素類別判定模型的變量。數(shù)據(jù)以3:1劃分為訓(xùn)練集和測試集。

1.4.2 模型驗證

測試集用于模型驗證，并比較兩個模型得出的結(jié)果和準(zhǔn)確率。其中，KNN模型是基于歐式距離得到最終的結(jié)果。其計算公式如下：

式中：n為描述符數(shù)量；xi、yi為細(xì)菌素在n維空間內(nèi)的坐標(biāo)。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)菌素/非細(xì)菌素蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)集

本研究建立的細(xì)菌素數(shù)據(jù)集和非細(xì)菌素蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)集用于建模，建立細(xì)菌分泌的類細(xì)菌素蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)集用于發(fā)掘潛在細(xì)菌素。細(xì)菌素數(shù)據(jù)庫中共有405個細(xì)菌素，細(xì)菌素三級結(jié)構(gòu)140個，其中與同源建模模板序列相似性大于50%的三級結(jié)構(gòu)有100個。本文所建立的細(xì)菌素數(shù)據(jù)庫與其他同類型研究相比[16-17]，加入了通過同源建模得到的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，通過軟件計算獲得了共1979種描述符。

將細(xì)菌素與非細(xì)菌素蛋白質(zhì)的2D、3D、pro描述符進(jìn)行主成分分析，由圖1計算得到前三個主成分累計貢獻(xiàn)率分別為71.321%、59.671%、70.382%，能夠較為準(zhǔn)確地表示每種描述符所包含的信息。圖1為細(xì)菌素與非細(xì)菌素蛋白質(zhì)在三維空間內(nèi)的分布情況，可以看出細(xì)菌素分布較為廣泛，細(xì)菌素與非細(xì)菌素蛋白質(zhì)在三維空間內(nèi)的區(qū)分度并不高。但是，細(xì)菌素內(nèi)部存在密集聚集的情況，說明部分細(xì)菌素三級結(jié)構(gòu)極為相似。同時也可以看出現(xiàn)有描述符對細(xì)菌素的區(qū)分效果并不好，通過進(jìn)一步篩選并融合已有的描述符能夠更全面地表達(dá)其中所包含的信息，較為容易地分離細(xì)菌素與非細(xì)菌素蛋白質(zhì)。

圖1 細(xì)菌素-非細(xì)菌素蛋白質(zhì)三維分布散點圖

2.2 描述符生成和篩選

蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)共得到1979種描述符，分為2D、3D、pro3種；細(xì)菌素氨基酸序列得到1806種描述符。經(jīng)過篩選與融合描述符，我們得到氨基酸序列Pes描述符15種，蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)Pes描述符23種，其累積貢獻(xiàn)率分別為94.91%和86.14%。因此本文所構(gòu)建的描述符可以通過更少的數(shù)據(jù)有效表達(dá)細(xì)菌素蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中所包含的信息。與其他描述符篩選方法相比[24]，本文的方法在Frecer[25]、Hilpert[26]等人針對特定類型抗菌肽而建立的描述符基礎(chǔ)上，改進(jìn)了Cherkasov[27-28]等人建立的多肽可通用的描述符，通過計算絕對電負(fù)性、共價半徑、分子間距離、相互作用力等多種物理化學(xué)性質(zhì)和蛋白質(zhì)相關(guān)參數(shù)來全面描述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中所包含的信息，并最終將這些信息整合在所構(gòu)建的描述符中。這樣不僅保留了更多的蛋白質(zhì)信息，同時降低數(shù)據(jù)維度，增加可解釋性。

圖2為PCA得分圖。A圖為氨基酸序列Pes描述符的PCA得分圖，前兩個主成分的累計貢獻(xiàn)率為70.70%。可以觀察到除IID類細(xì)菌素外，其余細(xì)菌素都有較為規(guī)律的分布區(qū)域。由于IID類細(xì)菌素其序列特異性較弱，為提高模型的準(zhǔn)確率，將IID類細(xì)菌素排除在外，只對其他四類細(xì)菌素進(jìn)行模型判定。B圖為蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)Pes描述符的PCA得分圖，前兩個主成分的累計貢獻(xiàn)率為30.91%。通過篩選融合后得到的Pes描述符保留了細(xì)菌素與非細(xì)菌素蛋白質(zhì)中的主要信息，可以較為準(zhǔn)確地區(qū)分細(xì)菌素與非細(xì)菌素蛋白質(zhì)。

2.3 細(xì)菌素發(fā)掘模型

圖3為2種不同算法與4種描述符組合得到的8個模型的準(zhǔn)確率，可以觀察到RF模型準(zhǔn)確率優(yōu)于SVM模型準(zhǔn)確率，通過Pes描述符和RF算法建立的發(fā)掘模型準(zhǔn)確率最高，為0.9187，其余所有RF模型準(zhǔn)確率都保持在0.8000左右，說明Pes描述符能夠更準(zhǔn)確、全面地表征蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)信息。

圖3 模型準(zhǔn)確率

此前，VELTRID[29]利用單詞嵌入的方法來描述細(xì)菌素，發(fā)現(xiàn)通過DNN(Deep Neural Networks)深度學(xué)習(xí)算法建立的識別模型顯著優(yōu)于BLAST比對等其他幾種細(xì)菌素識別方法。其他同類研究中多采用分析蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)和氨基酸的組成等方法[30]，本文通過同源建模，獲得更能代表蛋白質(zhì)真實形態(tài)的三級結(jié)構(gòu)，并從中獲取其物理化學(xué)性質(zhì)等信息，得到了比以往方法更為準(zhǔn)確的模型。說明三級結(jié)構(gòu)內(nèi)包含了更多肽鏈中無法顯示的信息，也表示本文構(gòu)建的描述符可以準(zhǔn)確地用數(shù)字形式全面描述蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。但該方法精確測得的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)數(shù)量較少，而且通大部分機器學(xué)習(xí)的方法仍是黑箱方法，無法對學(xué)習(xí)過程做出合理的解釋，這也是今后研究中需要考慮的問題[31]。

2.4 細(xì)菌素類別判定模型

氨基酸序列描述符建立的細(xì)菌素類別判定模型中，k NN模型準(zhǔn)確率為0.9000，SVM模型準(zhǔn)確率為0.8269。因此說明kNN模型更適用于細(xì)菌素類別判定模型的構(gòu)建。圖4為測試集結(jié)果得到的混淆矩陣，可以觀察到IIB類細(xì)菌素在k NN模型中易于被識別為IIA類細(xì)菌素，在SVM模型中幾乎全部被識別為Lantibiotic類細(xì)菌素，分類效果不理想，有待進(jìn)一步添加更多信息，增加其與其他類別細(xì)菌素的區(qū)分度。

圖4 類別判定模型測試集混淆矩陣

學(xué)術(shù)界基于蛋白質(zhì)翻譯修飾類型、二硫鍵結(jié)構(gòu)、序列相似性以及細(xì)菌素來源等多種因素，提出了許多種對細(xì)菌素的分類標(biāo)準(zhǔn)。我們根據(jù)Kumariya[32]所介紹的細(xì)菌素分類標(biāo)準(zhǔn)，選取數(shù)量較多的細(xì)菌素種類進(jìn)行類別判定模型的構(gòu)建，得到了較高準(zhǔn)確率的類別判定模型，說明氨基酸序列描述符較好地涵蓋了上述分類標(biāo)準(zhǔn)所要求的信息，同時也說明氨基酸序列中除排列順序以外包含著更多有待發(fā)掘的信息。細(xì)菌素發(fā)掘模型的成功建立，表明今后蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)經(jīng)補充豐富后，利用蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中提取的描述符建立起的類別判定模型將會有更高的準(zhǔn)確率。由于IID類細(xì)菌素分類效果不明顯，III類、IV類細(xì)菌素數(shù)量過少等，我們并未對全部細(xì)菌素種類進(jìn)行類別判定模型的構(gòu)建。在今后明確不同細(xì)菌素的作用機理后，通過本文介紹的提取生物大分子描述符的方法進(jìn)行細(xì)菌素的重新分類將更為科學(xué)合理。另外，為了解決數(shù)據(jù)不平衡的問題，對其中幾類進(jìn)行欠采樣后可能會造成數(shù)據(jù)不完整，影響模型的擬合效果[33]。

2.5 細(xì)菌素發(fā)掘

表1是發(fā)掘出的7種細(xì)菌素，根據(jù)細(xì)菌素發(fā)掘模型，判定為細(xì)菌素準(zhǔn)確度＞50%的蛋白質(zhì)極有可能具有細(xì)菌素活性。通過細(xì)菌素類別判定模型預(yù)測了可能的細(xì)菌素種類，預(yù)測結(jié)果中多數(shù)為Class IIB類細(xì)菌素。因此，本文所介紹的方法能夠在大量蛋白質(zhì)中進(jìn)行高效的細(xì)菌素篩選與類別判定，在進(jìn)一步完善后，將成為科研人員進(jìn)行細(xì)菌素發(fā)現(xiàn)與鑒定的有效輔助工具。

表1 細(xì)菌素發(fā)掘表

3 結(jié) 論

本研究采用數(shù)據(jù)融合的方法，建立細(xì)菌素、非細(xì)菌素蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)集，并將數(shù)據(jù)生成數(shù)學(xué)描述符?；赗F算法建立的細(xì)菌素發(fā)掘模型，準(zhǔn)確度最高，為0.9187；k NN算法建立的細(xì)菌素類別判定模型，準(zhǔn)確度最高，為0.9000。另外，發(fā)現(xiàn)了7種可能具有抗菌作用的蛋白質(zhì)，將在后續(xù)的研究中進(jìn)行進(jìn)一步驗證。本文建立的生物大分子描述符生成方法不僅可以用于細(xì)菌素的發(fā)掘，且對研究其他類型蛋白質(zhì)的生物功能也具有一定的借鑒意義。