血清miR-219水平與急性缺血性腦卒中后輕度認(rèn)知功能障礙的關(guān)系

李雪媛，常 紅，邢惠娟，劉曉琳

遼寧省大連市第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科一病房，遼寧大連 116033

急性缺血性腦卒中(AIS)是最常見的卒中類型，占我國腦卒中的69.6%～70.8%[1]。輕度認(rèn)知功能障礙是介于正常衰老和癡呆(AD)之間的一種中間狀態(tài)，其發(fā)病率隨年齡增長而升高[2]。AIS常伴有認(rèn)知功能障礙甚至癡呆。miRNAs是一類由內(nèi)源基因編碼的由22～25個核苷酸組成的單鏈非編碼小分子RNA，在體內(nèi)發(fā)揮多種生物學(xué)功能，可作為進(jìn)行性疾病診斷與預(yù)后判斷的重要生物標(biāo)志物。研究表明，miRNAs與AIS患者認(rèn)知功能障礙嚴(yán)重程度有關(guān)[3]。miR-219是一種常見的miRNAs，研究表明，腎臟纖維化患者血清中 miR-219 水平明顯降低[4]。miR-219在AIS患者中的研究報道不多，本研究采用實時熒光定量PCR檢測185例AIS患者血清中miR-219 情況，探討miR-219與AIS患者輕度認(rèn)知功能障礙的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年11月至2019年10月在本院神經(jīng)內(nèi)科住院的185例AIS患者為研究對象，其中男100例，女85例；年齡46～69歲，平均(55.6±7.9)歲。AIS患者按照認(rèn)知功能評價分為輕度認(rèn)知功能障礙組和無認(rèn)知功能障礙組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[1]中AIS的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)發(fā)病至入院就診時間<24 h；(3)進(jìn)行1.5T或3.0MRI檢查；(4)患者自愿參與本研究，并簽署知情同意書，能完成臨床記錄者。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)有重度認(rèn)知功能障礙；(2)合并其他心血管疾??；(3)有惡性腫瘤；(4)臨床資料不全。另選取體檢健康者170例作為對照組，其中男92例，女78例；年齡46～69歲，平均(60.1±8.8)歲。

1.2儀器與試劑 Trizol 抽提試劑盒購自美國 Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；AceQ qPCR SYBR?Green Mix購自南京Vazyme生物科技股份有限公司；miR-219及U6引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計與合成。實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 血清樣品：采集AIS患者與健康體檢者空腹靜脈血5 mL，常溫3 000 ×g離心10 min后收集血清，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2認(rèn)知功能的判斷 由神經(jīng)科醫(yī)生對所有研究對象進(jìn)行認(rèn)知功能評價。輕度認(rèn)知功能障礙判斷標(biāo)準(zhǔn)：參考田金洲主編的《中國癡呆診療指南(2017年)》中有關(guān)輕度認(rèn)知障礙的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并運用簡易精神狀態(tài)檢查表(MMSE)、蒙特利爾認(rèn)知評估量表(MoCA)[5]、日常生活功能量表(ADL)等進(jìn)行認(rèn)知功能測評。根據(jù)認(rèn)知功能評價將AIS患者分為輕度認(rèn)知功能障礙組和無認(rèn)知功能障礙組。

1.3.3實時熒光定量PCR檢測血清miR-219 水平 采用 Trizol抽提試劑盒提取血清中總RNA,采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。采用實時熒光定量PCR檢測各組研究對象血清中miR-219 水平。采用實時熒光定量PCR儀對miR-219進(jìn)行擴增。miR-219正向引物：5′-CCGCCCCGGGCCGCGGCUCC-3′，反向引物：5′-GCCCCCAAACCUCGAGCGGG-3′；內(nèi)參U6正向引物：5′-GCAGTGCTTAGCTGGTTGT-3′，反向引物：5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系共20 μL：AceQ qPCR SYBR?Green Mix 8 μL，cDNA(50 ng/μL)2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 45 s，95 ℃ 45 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法對血清miR-219水平進(jìn)行定量分析，重復(fù)3次取平均值。

1.3.4其他臨床資料收集 對所有研究對象進(jìn)行三酰甘油(TG)、總膽固醇 (TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、空腹血糖(FPG)檢測，并收集高血壓病史、飲酒史、吸煙史等臨床資料。中國缺血性腦卒中亞型(CISS)分型參考文獻(xiàn)[6]。

2 結(jié) 果

2.1各組研究對象一般情況比較 185例AIS患者中有輕度認(rèn)知功能障礙95例，無認(rèn)知功能障礙組90例。輕度認(rèn)知功能障礙組中糖尿病比例明顯高于無認(rèn)知功能障礙組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；輕度認(rèn)知功能障礙組和無認(rèn)知功能障礙組性別，年齡，有吸煙、飲酒史比例，有高血壓、冠心病、腦卒中、心肌梗死基礎(chǔ)疾病比例，CISS 分型比例比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組研究對象一般情況比較

組別n基礎(chǔ)疾病[n(%)]高血壓糖尿病冠心病腦卒中心肌梗死CISS分型[n(%)]大動脈粥樣硬化心源性卒中穿支動脈病變其他原因不明原因有輕度認(rèn)知功能障礙組9554(56.8)40(42.1)32(33.7)28(29.5)7(7.4)55(57.9)15(15.8)17(17.9)6(6.3)2(2.1)無認(rèn)知功能障礙組9042(46.7)25(32.2)23(25.6)21(23.3)3(3.3)50(55.6)16(17.8)21(23.3)2(2.2)1(1.1)對照組170——————————χ2/F1.9174.1631.4620.8981.4722.892P0.1660.0410.2270.3440.2250.576

2.2各組研究對象血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C、FPG、miR-219 水平比較 輕度認(rèn)知功能障礙組、無認(rèn)知功能障礙組血清中miR-219水平明顯高于對照組，且輕度認(rèn)知功能障礙組血清中miR-219 水平明顯高于無認(rèn)知功能障礙組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而3組間血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C、FPG水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組研究對象血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C、FPG、miR-219 水平比較

2.3AIS患者發(fā)生輕度認(rèn)知功能障礙的影響因素分析 將單因素分析中P<0.2的變量進(jìn)一步納入二分類Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，糖尿病、血清miR-219水平高是AIS患者發(fā)生輕度認(rèn)知功能障礙的獨立危險因素，見表3。

表3 AIS患者發(fā)生輕度認(rèn)知功能障礙的影響因素分析

2.4血清miR-219水平對AIS患者發(fā)生輕度認(rèn)知功能障礙的預(yù)測價值 血清miR-219水平預(yù)測AIS患者發(fā)生輕度認(rèn)知功能障礙的ROC曲線下面積為0.818(95%CI：0.755～0.871)，最佳截斷值為1.34，靈敏度為68.42%，特異度為82.22%，見圖1。

圖1 血清miR-219水平預(yù)測AIS患者發(fā)生輕度認(rèn)知功能障礙的ROC曲線分析

3 討 論

AIS患者認(rèn)知功能障礙主要與血管閉塞或血流量減少導(dǎo)致腦細(xì)胞缺乏氧氣和營養(yǎng)有關(guān)。AIS患者認(rèn)知功能障礙是受多基因調(diào)控的過程，涉及多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、多種細(xì)胞因子的變化[7-8]。miRNAs 是一類真核生物內(nèi)源性小分子單鏈 RNA，通過與靶基因mRNA的3′端非編碼區(qū)特異性結(jié)合，參與神經(jīng)系統(tǒng)不同信號通路基因調(diào)控，在學(xué)習(xí)與記憶功能中起重要作用，也用于血管性癡呆患者早期診斷[9]。袁梅等[10]研究結(jié)果表明，AIS 患者血清 miR-335水平明顯下降，與腦卒中后患者病情密切相關(guān)。謝尊椿等[11]研究表明，AIS患者血漿miR-124水平明顯降低，其水平與腦梗死面積及美國國立衛(wèi)生研究所腦卒中評分(NIHSS)呈負(fù)相關(guān)。由此可見，多種miRNAs與AIS病情進(jìn)展有關(guān)。

miR-219是常見的miRNA之一，廣泛存在于各種細(xì)胞、組織中。多項研究表明，miR-219在多種病變組織、腫瘤中均異常表達(dá)，參與多種信號通路，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，可作為多種疾病早期診斷、治療靶點或預(yù)后監(jiān)測的指標(biāo)[12-13]。本研究結(jié)果表明，miR-219在AIS患者血清中高表達(dá)，提示 miR-219可能與AIS發(fā)病有關(guān)。本研究結(jié)果表明，輕度認(rèn)知功能障礙組AIS患者血清中miR-219水平明顯高于無認(rèn)知功能障礙組，表明miR-219水平可能與AIS患者發(fā)生輕度認(rèn)知功能障礙有關(guān)。

AIS患者認(rèn)知功能障礙發(fā)生機制較復(fù)雜，但血清中一些標(biāo)志物的變化可為早期診斷及治療提供參考。一般認(rèn)為，血液循環(huán)中的 miRNA 主要來源于體內(nèi)凋亡或壞死的細(xì)胞，或者來源于細(xì)胞的主動釋放及循環(huán)細(xì)胞的裂解等。miRNA可以通過血腦屏障，腦組織中miRNA水平與血清中miRNA水平變化是一致的。miR-219可能來源于受損的腦組織，有望通過檢測血清中 miR-219水平預(yù)測AIS的發(fā)生與進(jìn)展。缺血性腦卒中是腦卒中最常見的類型，不健康的生活方式，如吸煙、飲酒等因素，以及高血壓、糖尿病等基礎(chǔ)疾病因素可能均影響腦卒中的發(fā)生、發(fā)展。本研究分析發(fā)現(xiàn)，糖尿病、血清miR-219水平高是AIS患者發(fā)生輕度認(rèn)知功能障礙的獨立危險因素，提示有上述因素AIS患者發(fā)生輕度認(rèn)知功能障礙風(fēng)險較高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-219水平預(yù)測AIS患者發(fā)生輕度認(rèn)知功能障礙的ROC曲線下面積為0.818，最佳截斷值為1.34，提示血清miR-219水平對于AIS患者發(fā)生輕度認(rèn)知功能障礙有一定預(yù)測價值。

綜上所述，miR-219在AIS患者血清中高表達(dá)，且在有輕度認(rèn)知功能障礙的AIS患者血清中表達(dá)更高，對AIS患者發(fā)生輕度認(rèn)知功能障礙有一定預(yù)測價值。由于本研究臨床資料少，miR-219在AIS患者認(rèn)知功能障礙發(fā)生過程中的具體作用機制尚未明確，仍需進(jìn)一步研究。