miR-146a-3p在胃癌患者血清中的表達及臨床意義

王宗艷，劉 倩

陜西省人民醫(yī)院消化內(nèi)二科，陜西西安 710068

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1]。胃癌在中國的發(fā)病率和病死率均較高，每年新增病例約40萬例，死亡約30萬例[2]。近年來，雖然外科手術(shù)設(shè)備和輔助治療方法取得了顯著的發(fā)展，但由于胃癌患者發(fā)現(xiàn)時多為中晚期，手術(shù)后復發(fā)率較高，且總體5年生存率仍不高，低于30%，預(yù)后較差[3]。進一步識別胃癌預(yù)后的危險因素，探索新的藥物治療靶點，對于控制胃癌發(fā)生和復發(fā)至關(guān)重要。microRNAs(miRNAs)是一類進化保守的非編碼RNA，通過與靶向mRNA的互補位點結(jié)合，抑制翻譯進程，在轉(zhuǎn)錄水平負調(diào)控基因表達[4]。miRNAs在癌癥中異常表達，可作為癌癥診斷和判斷預(yù)后的指標[5]。陸玉等[6]發(fā)現(xiàn)miR-146a-3p在多種胃癌細胞中表達下調(diào)，具有較高的預(yù)測患者預(yù)后價值。本研究探討miR-146a-3p在胃癌患者血清中的水平及其對預(yù)后的預(yù)測價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2015年3月至2017年9月收治的64例胃癌患者作為胃癌組，男37例，女27例；年齡22～79歲，平均(53.38±8.47)歲；腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(TNM)分期Ⅰ期9例，Ⅱ期18例，Ⅲ期19例，Ⅳ期18例；低分化38例，中分化15例，高分化11例。納入標準：(1)所有患者均符合胃癌臨床診斷標準[7]；(2)經(jīng)胃鏡和病理學檢查證實為胃癌；(3)首次確診；(4)病灶無壞死；(5)患者自愿簽署該項研究的知情同意書。排除標準：(1)合并其他消化系統(tǒng)惡性腫瘤；(2)合并血液病、免疫系統(tǒng)疾病、結(jié)締組織疾??；(3)合并原發(fā)性肝腎損傷；(4)有3個月內(nèi)手術(shù)史，或急慢性感染；(5)合并心肌梗死、心臟病。另選取同期本院體檢健康者28例作為健康組，男15例，女13例；年齡24～80歲，平均(52.96±8.54)歲。本研究獲得本院醫(yī)學倫理委員會批準后進行。

1.2方法

1.2.1臨床資料的收集 收集所有研究對象的性別、年齡信息，患者的TNM分期、腫瘤最大徑、局部浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、分化程度等資料。

1.2.2血液標本的采集 患者入院后，于次日清晨采集空腹靜脈血約8 mL，健康組于體檢時采集靜脈血，置于無抗凝劑的采血管中。3 000 r/min離心15 min。收集上層血清，分裝至兩支離心管中，—20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3血清miR-146a-3p的檢測 取1份血清標本，加入1 mL TRIzol提取劑，提取總RNA，并進行檢測。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司產(chǎn)品)說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測血清中miR-146a-3p水平。miR-146a-3p上游引物：5′-GCGCGACCTGTGAAGTTCAG-3′；下游引物：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。以U6為內(nèi)參，U6上游引物：5′-CTCGCATCGCGTAAGGCACA-3′；下游引物：5′-AACGCTACTCGAATTAGCGT-3′(引物由上海金唯智生物科技有限公司合成)。嚴格依據(jù)qRT-PCR試劑盒說明書進行操作，配制反應(yīng)物體系。設(shè)置qRT-PCR儀器(美國MJ Research公司產(chǎn)品)程序：96 ℃預(yù)變性5 min，96 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸，進行35個循環(huán)，上機進行PCR擴增。2—ΔΔCt法對miR-146a-3p進行定量。

1.2.4生化指標檢測 取另外1份血清標本，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測血清中糖類抗原72-4(CA72-4)水平。嚴格按照人CA72-4 ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司產(chǎn)品)說明書進行操作，采用酶標儀(美國Thermo公司產(chǎn)品)檢測標本在450 nm處吸光度值(A)，制作標準曲線，計算CA72-4水平。

1.2.5隨訪 通過電話方式對患者進行隨訪，每半年進行1次隨訪，隨訪終點為患者發(fā)生胃癌相關(guān)死亡。隨訪截止時間為2020年10月1日。根據(jù)3年內(nèi)，患者預(yù)后情況，將患者分為存活組(n=14)和死亡組(n=50)。

1.3觀察指標 (1)比較胃癌組和健康組血清中miR-146a-3p、CA72-4水平；(2)分析胃癌組患者miR-146a-3p、CA72-4水平與性別、年齡、臨床資料的關(guān)系；(3)分析胃癌組血清miR-146a-3p水平與CA72-4水平之間的相關(guān)性；(4)比較存活組和死亡組miR-146a-3p、CA72-4水平；(5)分析胃癌組血清miR-146a-3p、CA72-4水平對胃癌患者預(yù)后的預(yù)測價值。

2 結(jié) 果

2.1健康組與胃癌組血清miR-146a-3p、CA72-4水平比較 胃癌組血清miR-146a-3p水平低于健康組，血清CA72-4水平高于健康組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 健康組與胃癌組血清中miR-146a-3p、CA72-4水平比較

2.2不同特征胃癌患者血清miR-146a-3p、CA72-4水平比較 不同TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、局部浸潤深度、腫瘤最大徑、分化程度胃癌患者的血清miR-146a-3p、CA72-4水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；不同性別、年齡、病理類型胃癌患者血清miR-146a-3p、CA72-4水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同特征胃癌患者血清miR-146a-3p、CA72-4水平比較

2.3胃癌患者血清miR-146a-3p水平與CA72-4水平的相關(guān)分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，胃癌患者血清miR-146a-3p水平與CA72-4水平呈負相關(guān)(r=—0.474，P<0.001)。

2.4存活組和死亡組miR-146a-3p、CA72-4水平比較 死亡組血清miR-146a-3p水平低于存活組，血清CA72-4水平高于存活組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 存活組和死亡組血清miR-146a-3p、CA72-4水平比較

2.5血清miR-146a-3p、CA72-4水平對胃癌患者預(yù)后的預(yù)測價值 血清miR-146a-3p、CA72-4預(yù)測胃癌患者預(yù)后的AUC分別為0.864(0.764～0.963)、0.769(0.652～0.885)；血清miR-146a-3p的AUC大于血清CA72-4，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1、表4。

表4 血清miR-146a-3p、CA72-4水平對胃癌患者預(yù)后的預(yù)測價值

圖1 血清miR-146a-3p、CA72-4水平對胃癌患者預(yù)后的預(yù)測價值的ROC曲線

3 討 論

miRNAs與靶基因的3′非翻譯區(qū)不完全結(jié)合，通過誘導翻譯沉默或mRNA降解負調(diào)控多個基因的表達[8]。超過50%的miRNAs基因位于癌癥相關(guān)基因組區(qū)域或染色體的脆性位點，是人類癌癥發(fā)病的重要因素[9]。miR-146a在前列腺癌、胃癌、乳腺癌等多種癌癥中發(fā)揮腫瘤抑制因子作用，參與腫瘤細胞增殖、分化和凋亡。在高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞株中，miR-146a表達下調(diào)，外源性過表達miR-146a削弱細胞的侵襲、遷移能力[10]。miR-146a-3p是miR-146a家族成員之一，研究表明，miR-146a-3p在胃癌中低表達，且與患者預(yù)后存在較強的相關(guān)性，可能成為預(yù)測胃癌預(yù)后的生物標志物[11]。在乳腺癌組織和細胞中過表達miR-146a-3p通過靶向垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因(PTTG1)抑制乳腺癌細胞遷移、侵襲、增殖，從而抑制乳腺癌的進展[12]。

本研究結(jié)果顯示，胃癌組血清miR-146a-3p水平低于健康組，表明胃癌的發(fā)生和發(fā)展可能與miR-146a-3p的表達量降低，相關(guān)靶基因水平升高相關(guān)。大量研究表明，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部浸潤深度、腫瘤最大徑、分化程度是影響胃癌患者臨床結(jié)局的重要因素[13-14]。由于胃癌在分子水平上存在異質(zhì)性，僅依靠TNM分期等指標預(yù)測胃癌患者的預(yù)后準確性欠佳，因此，在TNM分期、腫瘤最大徑等基礎(chǔ)上，尋找預(yù)測胃癌患者預(yù)后的分子標志物，有助于制訂合理的治療方案，可能提高患者生存率。本研究發(fā)現(xiàn)，不同TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、局部浸潤深度、腫瘤最大徑、分化程度胃癌患者的miR-146a-3p水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且死亡組血清miR-146a-3p水平低于存活組，表明血清miR-146a-3p低表達可能與胃癌患者預(yù)后不良有關(guān)。CA72-4是一種相對分子質(zhì)量較高的黏蛋白類抗原，其水平與腫瘤最大徑、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，是婦科相關(guān)癌癥和消化系統(tǒng)常見腫瘤的標志物[15]。雷振宇[16]報道，胃癌患者血清CA72-4水平與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)，并且其高表達預(yù)示患者預(yù)后不良，臨床上常采用CA72-4聯(lián)合其他指標預(yù)測患者臨床結(jié)局。本研究通過ROC曲線分析血清miR-146a-3p對胃癌患者預(yù)后的預(yù)測價值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當血清miR-146a-3p<0.88時，靈敏度和特異度分別為94.0%和71.4%，AUC為0.864，明顯高于CA72-4的AUC(0.769)，表明血清miR-146a-3p水平對胃癌患者預(yù)后的預(yù)測價值較高，具有較高的靈敏度和特異度，血清miR-146a-3p可作為預(yù)測胃癌患者預(yù)后的潛在標志物。

綜上所述，血清miR-146a-3p水平在胃癌患者中下調(diào)，可作為評估胃癌患者預(yù)后的標志物，特異度和靈敏度較高。