天然檸檬汁催化人參須根粉制備20（S,R）-Rg3和Rg5工藝研究

葉安琪，趙迅，張躍偉*，李玲，成樂琴*

（1.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022；2.吉林省彩森仁生物科技有限責(zé)任公司，吉林 吉林 132022）

五加科人參屬草本植物人參，藥用部位為其干燥根，在亞洲作為一種傳統(tǒng)中藥已有數(shù)千年的歷史[1-2]。目前，人參在中草藥市場上仍然占有突出的地位，被認(rèn)為是世界上使用最廣泛的藥食同源食品之一[3-5]。2012年人參被列為新資源食品，自此人參行業(yè)在中國進(jìn)入了快速發(fā)展的時(shí)期[6]。人參內(nèi)含有多種人體所必需的營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，如人參皂苷、多糖、揮發(fā)油等，具有較高的價(jià)值[7-8]。人參皂苷是人參中功效作用較為豐富的一種主要活性成分，其分離方法及生理活性研究一直是人們廣泛討論的話題。人參皂苷主要由 Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1 組成，占人參總皂苷含量的90%[9]。然而，研究表明，通過對原人參皂苷進(jìn)行糖基修飾而得到的稀有人參皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5具有更大的功效潛力[10-11]，稀有人參皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5在諸多藥理活性試驗(yàn)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗癌、抗炎、抗糖尿病等功效[12-16]。

目前，將人參中的人參皂苷轉(zhuǎn)化成稀有人參皂苷主要采用兩種方法，即先提取分離人參皂苷，再進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾[17]；或先進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，再提取分離[18]，但這些方法存在制備時(shí)間長、專一性差、得率低、溶劑消耗大、耗能高等缺點(diǎn)[19-22]。本文利用多功能改進(jìn)型索氏提取器，以人參須根粉為原料，研究檸檬汁催化制備稀有人參皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5 的工藝條件，探索綠色、高效、簡便的稀有皂苷制備方法。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

檸檬、人參須根粉：市售；甲醇（色譜純）、無水乙醇（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純）：美國Tedia公司；純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品：成都曼斯特生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能改進(jìn)型索氏提取器（專利號CN2017-20660247.5）：吉林化工學(xué)院自制；P230P型高效液相色譜 （high performance liquid chromatography，HPLC）儀：大連依利特分析儀器有限公司；PinnacleⅡC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：RESTEK 公司；RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 人參皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5的 HPLC 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱量人參皂苷對照品20（S）-Rg3 1.926 mg、20（R）-Rg3 1.940 mg、Rg5 2.032 mg，用甲醇定容至10 mL，配成人參皂苷單體對照品儲備液，從中分別準(zhǔn)確移取2.5、1.0、0.5、0.25 mL溶液用甲醇定容至 10 mL，配制成5種不同質(zhì)量濃度的人參皂苷對照品溶液。人參皂苷對照品溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，進(jìn)行高效液相色譜分析，并以人參皂苷濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 人參皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5 的制備方法

在多功能改進(jìn)型索氏提取器的提取筒中放入過100目篩人參須根粉2 g，在提取筒和圓底燒瓶中分別加入20 mL不同濃度的乙醇水溶液，取新鮮的檸檬汁[23]加至圓底燒瓶中并放入攪拌轉(zhuǎn)子，安裝索氏提取裝置。將裝置中的圓底燒瓶置于不同溫度的油浴中，并在提取筒中通入預(yù)先加熱到特定溫度的導(dǎo)熱液，200 r/min下加熱攪拌提取。當(dāng)提取筒出現(xiàn)回流液時(shí)打開提取筒下端活塞，并保持液面至提取達(dá)到動態(tài)平衡。提取結(jié)束，提取液冷卻，離心，取上清液，固體殘?jiān)?0 mL的甲醇分兩次洗滌，離心，與上清液合并。上清合并液經(jīng)充分混合，移取1/25合并液，小心滴加飽和碳酸鈉至pH6，旋蒸至干。殘留物中加入4 mL的甲醇，超聲溶解，用0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)行HPLC分析，并計(jì)算人參皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5 的總得率，計(jì)算公式如下。

Y/%=m/M×100

式中：Y為總得率，%；m為所提稀有人參皂苷質(zhì)量，g；M為人參須根粉質(zhì)量，g。

稀有人參皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5的制備原理見圖1。

圖1 稀有人參皂苷20(S，R)-Rg3和Rg5的制備原理Fig.1 Preparation principle of rare ginsenosides 20(S，R)-Rg3 and Rg5

1.3.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取制備20（S，R）-Rg3、Rg5的工藝條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)條件，在檸檬汁用量2 mL、油浴溫度135℃的條件下，選取乙醇濃度（A）、提取時(shí)間（B）、提取筒溫度（C）3個(gè)因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，確定最優(yōu)試驗(yàn)方案。因素與水平見表1。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平Table 1L9（34）orthogonal experimental factors and levels

1.3.5 HPLC分析方法

本試驗(yàn)按照文獻(xiàn)[24]的色譜條件進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

將 1.3.2 配制的人參皂苷的 20（S）-Rg3、20（R）-Rg3、Rg5的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液進(jìn)行HPLC定量分析，以人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X（μg/mL），以峰面積為縱坐標(biāo) Y（mV）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得 20（S）-Rg3、20（R）-Rg3和Rg5的回歸方程及R2值如下。

Y20（S）-Rg3＝7.425 8X＋0.861，R2＝0.999 9

Y20（R）-Rg3＝8.376 0X-6.340 2，R2＝0.999 9

YRg5＝16.883 0X-40.53，R2＝0.999 6

結(jié)果顯示 20（S）-Rg3、20（R）-Rg3 和 Rg5 的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，可信度較高。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對人參皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5 得率的影響

分別以20%、30%、40%、50%、60%的乙醇水溶液為提取溶劑，在提取筒溫度65℃，油浴溫度125℃下提取3 h，考察乙醇濃度對人參皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 乙醇濃度對人參皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on yield of ginsenoside 20（S，R）-Rg3 and Rg5

圖2表明，乙醇濃度為20%時(shí)，人參皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5的總得率最低，30%時(shí)總得率最高。而當(dāng)乙醇濃度進(jìn)一步升高時(shí)，20（S，R）-Rg3和Rg5的總得率呈整體下降的趨勢。分析原因，可能是由于多功能改進(jìn)型索氏提取器在循環(huán)提取過程中，同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)動態(tài)的梯度提取。乙醇溶液汽化時(shí)氣相組分中醇濃度會增大，導(dǎo)致提取過程中提取溶劑的極性由高逐漸轉(zhuǎn)低，根據(jù)“相似相溶”原理，不同極性溶劑的梯度提取可能更有助于多種極性的人參皂苷通過結(jié)構(gòu)修飾轉(zhuǎn)化為 20（S，R）-Rg3 和 Rg5。與文獻(xiàn)[25-26]中報(bào)道的人參皂苷最佳提取乙醇濃度（70%～80%）相比，該工藝所需乙醇濃度僅為30%，因此可以節(jié)省乙醇溶劑的使用。

2.2.2 檸檬汁用量對人參皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影響

檸檬汁中含有豐富的檸檬酸，此外還含有酒石酸和蘋果酸，均可以在水中解離質(zhì)子催化人參皂苷的結(jié)構(gòu)修飾反應(yīng)。以30%的乙醇水溶液為提取溶劑，分別加入 0.5、2.0、3.5、5.0、6.5 mL 檸檬汁，在提取筒溫度65℃，油浴溫度125℃下提取3 h，考察不同檸檬汁用量對人參皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5 得率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 檸檬汁用量對人參皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影響Fig.3 Effect of lemon juice dosage on yield of ginsenoside 20（S，R）-Rg3 and Rg5

圖 3 表明，人參皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5 的總得率在0.5 mL～2.0 mL范圍內(nèi)隨著檸檬汁用量的增加而增加，2.0 mL～5.0 mL范圍內(nèi)幾乎保持不變，進(jìn)一步提高檸檬汁用量，總得率有所下降。這說明檸檬汁用量為2.0 mL～5.0 mL 時(shí)比較適合人參皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5的制備，如果過少，酸催化能力下降，總得率低；若過多，會導(dǎo)致人參皂苷Rg5部分分解，使總得率下降。

2.2.3 油浴溫度對人參皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影響

以濃度30%的乙醇水溶液為提取溶劑，在提取筒溫度 65℃下，分別在 105、115、125、135、145℃油浴溫度下提取3h，考察不同油浴溫度對人參皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 油浴溫度對人參皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影響Fig.4 Effect of oil bath temperature on yield of ginsenoside 20（S，R）-Rg3 and Rg5

由圖 4可見，油浴溫度為 105℃時(shí)，20（S，R）-Rg3和Rg5的總得率只有0.14%，這是因?yàn)?05℃油浴溫度下提取溶劑較難進(jìn)行汽化，無法完成動態(tài)循環(huán)提取，致使所提人參皂苷少，故20（S，R）-Rg3和Rg5的總得率也隨之減少。隨著油浴溫度的提高，提取溶劑循環(huán)速度加快，20（S，R）-Rg3和Rg5的總得率也逐漸增加，當(dāng)油浴溫度為135℃時(shí)，其總得率達(dá)到最大值3.03%；而進(jìn)一步提高油浴溫度，皂苷總得率反而下降。

2.2.4 提取筒溫度對人參皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影響

以濃度為30%的乙醇水溶液為提取溶劑，提取筒溫度分別設(shè)置為 35、45、55、65、75℃，在油浴溫度 135℃下提取3h，考察不同提取筒溫度對人參皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 提取筒溫度對人參皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影響Fig.5 Effect of extraction cylinder temperature on yield of ginsenosides 20（S，R）-Rg3 and Rg5

隨著提取筒溫度從35℃到75℃不斷升高，人參皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5 的總得率也隨之增加，這是因?yàn)樘崛⊥矞囟壬?，人參皂苷在提取溶劑中的溶解度增加，在相同時(shí)間內(nèi)可以提取更多人參皂苷，這就可以使較多的人參皂苷轉(zhuǎn)化成稀有人參皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5。

2.2.5 提取時(shí)間對人參皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影響

以濃度為30%的乙醇水溶液為提取溶劑，在提取筒溫度75℃，油浴溫度135℃下分別提取1、2、3、4、5h，考察不同提取時(shí)間對人參皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 提取時(shí)間對人參皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影響Fig.6 Effect of extraction time on yield of ginsenosides 20（S，R）-Rg3 and Rg5

在提取時(shí)間 1 h～4 h 范圍內(nèi)，20（S，R）-Rg3、Rg5的總得率隨著提取時(shí)間的增加呈增長趨勢，當(dāng)提取時(shí)間進(jìn)一步延長至5 h時(shí)，人參皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5的總得率略有下降，可能是持續(xù)高溫會導(dǎo)致副反應(yīng)發(fā)生?？紤]到實(shí)際操作及能源節(jié)約的角度，選擇3 h為皂苷最佳提取時(shí)間。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

由表2可知，乙醇濃度（A）、提取時(shí)間（B）和提取筒溫度（C）的極差R分別為0.81、0.99和0.27，說明影響20（S，R）-Rg3和Rg5總得率的因素主次順序?yàn)锽（提取時(shí)間）>A（乙醇濃度）>C（提取筒溫度）。最優(yōu)組合方案為A2B3C1，即乙醇濃度30%、提取時(shí)間4 h、提取筒溫度75℃。按最優(yōu)方案進(jìn)行3次重復(fù)性驗(yàn)證試驗(yàn)，所得稀有人參皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5的總得率分別為3.69%、3.71%和3.72%，表明工藝穩(wěn)定可行。

圖7是優(yōu)化條件下不加入檸檬汁和加入檸檬汁提取人參皂苷時(shí)人參提取物的HPLC分析圖。

圖7 人參須根粉提取物的HPLC分析圖Fig.7 HPLC analysis chart of fine ginseng root powder extract

由圖7可知，無檸檬汁加入時(shí)，提取得到的是原人參二醇組皂苷 Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 以及原人參三醇組皂苷 Rg1 和 Re，而加入檸檬酸提取時(shí)，Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd以及Rg1和Re的吸收峰明顯變小或消失，而在保留時(shí)間約65 min～67 min和80 min時(shí)，出現(xiàn)明顯的稀有人參皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5的吸收峰，這說明檸檬汁的加入可以很好地通過結(jié)構(gòu)修飾將提取皂苷轉(zhuǎn)化成目標(biāo)產(chǎn)物稀有皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5。

結(jié)果表明，當(dāng)人參須根粉中的原人參二醇組皂苷完全轉(zhuǎn)化成20（S，R）-Rg3和Rg5時(shí)，理論計(jì)算得率在2.86%～2.93%之間，而在相同提取條件下 20（S，R）-Rg3和Rg5的實(shí)測總得率為3.68%，明顯高于理論計(jì)算值。分析原因，可能是因?yàn)槿藚⒅胁粌H含有常見的原人參二醇組皂苷，還含有極性更大的丙二酸單?；藚⒃碥?，當(dāng)利用多功能改進(jìn)型索氏提取器對人參須根粉進(jìn)行提取時(shí)，提取桶內(nèi)乙醇濃度不斷變化，可以實(shí)現(xiàn)對不同極性人參皂苷和丙二酸單?；藚⒃碥盏奶荻忍崛?，而丙二酸單酰基人參皂苷在檸檬汁作用下會水解生成相應(yīng)的人參皂苷，進(jìn)而提高稀有人參皂苷20（S，R）-Rg3和 Rg5的總得率。

3 結(jié)論

本文利用多功能改進(jìn)型索氏提取器，在檸檬汁催化下從人參須根粉中提取制備稀有人參皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5。試驗(yàn)過程具有溶劑循環(huán)提取、溶劑梯度提取、連續(xù)動態(tài)提取、綠色催化、固液分離等特點(diǎn)，可以有效提高稀有人參皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5的制備效率。利用多功能改進(jìn)型索氏提取器，既能對不同極性的人參皂苷進(jìn)行高效梯度提取和轉(zhuǎn)化，又能減少醇類提取劑的使用，同時(shí)試驗(yàn)操作簡單，環(huán)境友好，實(shí)現(xiàn)了提取和結(jié)構(gòu)修飾的有機(jī)結(jié)合，這對于高附加值稀有人參皂苷的大量制備以及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)具有重要借鑒意義。