釀酒酵母與球擬酵母混合發(fā)酵對白酒風(fēng)味物質(zhì)的影響

周鈺涵，崔丹瑤，閆昕，林良才，張翠英

（省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

白酒是我國著名的蒸餾酒，其主要成分包括水、乙醇及微量風(fēng)味物質(zhì)。白酒中的風(fēng)味物質(zhì)占比雖然只有2%～3%，但卻決定了白酒的香型與品質(zhì)。白酒的風(fēng)味物質(zhì)包括酯類、醇類、酸類、醛類、縮醛類、酮類、酚類、吡嗪類等，其中酯類物質(zhì)是占比最大的香味物質(zhì)，包括乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯[1]。乙酸乙酯能夠提供果香氣味，是白酒中最常見的風(fēng)味物質(zhì)之一，同時也是清香型白酒的主體風(fēng)味物質(zhì)，在清香型白酒中一般具有較高的含量[2]。

白酒中乙酸乙酯的合成途徑主要分為化學(xué)合成和生物合成[3]?；瘜W(xué)合成是指乙醇和乙酸的化學(xué)反應(yīng)，生成的乙酸乙酯含量較少且生成速度較慢。生物合成是指酒曲微生物中的酶利用原料中的營養(yǎng)成分，通過自身的代謝途徑進(jìn)行產(chǎn)酯，是白酒乙酸乙酯的主要來源[4]。白酒中的功能性微生物主要包括酵母菌、細(xì)菌、霉菌等[5-6]。球擬酵母（Torulopsis globosa）屬于非釀酒酵母（non-Saccharomyces），具有良好的產(chǎn)酯能力，是白酒生產(chǎn)應(yīng)用中最廣泛的生香酵母之一。包括球擬酵母在內(nèi)的大部分生香酵母所產(chǎn)的酯類生香物質(zhì)都是乙酸乙酯，也有少量酵母產(chǎn)己酸乙酯、丁酸乙酯[7]。邢爽等[8]證明了在自然pH值條件下，球擬酵母的產(chǎn)酯能力要優(yōu)于卡特多菲畢赤酵母、克魯斯假絲酵母和漢遜酵母，酯分解能力要比其他產(chǎn)酯酵母低。呂磊等[9]發(fā)現(xiàn)在相同的培養(yǎng)條件下，發(fā)酵過程中的球擬酵母的總生物量要高于異漢遜酵母、釀酒酵母和意大利酵母。

如何有效提高白酒中乙酸乙酯含量，提高白酒品質(zhì)一直是研究熱點之一。吳軒德等[10]證明了釀酒酵母與巴氏醋桿菌混合發(fā)酵時，同步接種能夠顯著提高乙酸乙酯生成量。唐潔等[11]證明了釀酒酵母與異常畢赤酵母兩種菌株混合發(fā)酵時，不僅能生成更多的酯類物質(zhì)，還有效降低了總酸和高級醇的含量。

前期通過分子生物學(xué)方法，選育出了一株高產(chǎn)乙酸乙酯，同時產(chǎn)乙醇能力不變的釀酒酵母菌株[12-13]。張華東等[14]將醋酸菌的菌懸液添加到高產(chǎn)酯釀酒酵母菌懸液中，乙酸乙酯含量提高了12%。高產(chǎn)酯釀酒酵母與球擬酵母都具有高產(chǎn)乙酸乙酯的能力，但二者在白酒發(fā)酵過程中的相互作用尚不明確。本研究將工業(yè)釀酒酵母、高產(chǎn)酯釀酒酵母分別以不同接種體積比、不同接種順序與球擬酵母進(jìn)行混合發(fā)酵，研究球擬酵母對這兩株酵母的影響，揭示球擬酵母對高產(chǎn)酯釀酒酵母產(chǎn)酯能力的強(qiáng)化作用，為高產(chǎn)酯釀酒酵母在清香型白酒發(fā)酵中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

工業(yè)釀酒酵母菌株AY15、高產(chǎn)酯釀酒酵母菌株MY15、球擬酵母WY2：天津市工業(yè)微生物重點實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

玉米粉、高粱粉：市售；酵母膏（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；葡萄糖（分析純）：天津光復(fù)精細(xì)化工有限公司；乙酸乙酯、乙酸異戊酯、正丙醇、異丁醇、異戊醇、苯乙醇（均為色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；耐高溫淀粉酶（2.9×105U/mL）、糖化酶（1×105U/mL）：諾維信生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

1）酵母提取物蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone eextrose medium,YEPD）：10 g蛋白胨、10 g葡萄糖、5 g酵母浸粉，定容至500 mL，自然pH值，固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂粉，115℃滅菌20 min。

2）酵母種子培養(yǎng)基：首先將500g玉米粉與1500 mL溫水按料液比 1∶3（g/mL）混合，60 ℃處理 20 min。然后加入耐高溫淀粉酶（20 U/g原料），90℃水浴處理1.5 h，降溫并轉(zhuǎn)移至60℃水浴鍋中，加入糖化酶（200 U/g原料）處理20 h。將水解液過濾后，調(diào)整糖度至8°Bx與12°Bx，分別為一級種子培養(yǎng)基與二級種子培養(yǎng)基。最后在種子培養(yǎng)基中加入0.5%酵母浸粉，105℃滅菌20 min。

3）高粱半固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取80 g高粱粉放置于500 mL錐形瓶中，加入熱水200 mL，加入耐高溫淀粉酶（20 U/g原料），90℃水浴處理1 h。將培養(yǎng)基121℃滅菌20 min，隨后迅速冷卻至60℃，加入糖化酶（200 U/g原料）水浴30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

GC 7890B氣相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；MS204S電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；XMTB型電熱恒溫水浴鍋：天津市中環(huán)實驗器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高粱半固態(tài)發(fā)酵接種方式

首先挑取酵母菌株一環(huán)，接種至裝有5 mL一級種子培養(yǎng)基的試管中，30℃靜置培養(yǎng)24 h。將一級種子液傾倒至裝有45 mL二級種子培養(yǎng)基的錐形瓶中，8層紗布封口后，30℃靜置培養(yǎng)16 h，確保二級種子液中的細(xì)胞數(shù)達(dá)到5×106CFU/mL。將釀酒酵母工業(yè)菌株AY15和高產(chǎn)酯釀酒酵母菌株MY15以同步接種和順序接種的方式，分別與球擬酵母進(jìn)行混合發(fā)酵試驗。

1）同步接種：釀酒酵母與球擬酵母分別按照1∶1、1:2、2:1的不同體積比接種，將二級種子液同時接種到高粱半固態(tài)培養(yǎng)基中 （A∶W=1∶1、1∶2、2∶1 分別代表AY15 與 WY2 以 1∶1、1∶2、2∶1 的接種體積比進(jìn)行發(fā)酵；M∶W=1∶1、1∶2、2∶1 分別代表 MY15 與 WY2 以 1∶1、1∶2、2∶1的接種體積比進(jìn)行發(fā)酵）。

2）順序接種：先將釀酒酵母或球擬酵母中的一種接種于高粱半固態(tài)培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)1 d后，再接種相同數(shù)量的另一種酵母（AW和MW分別代表先接種AY15或MY15，發(fā)酵1 d后再接種WY2；WA和WM分別代表先接種WY2，發(fā)酵1 d后再接種AY15與MY15）。

接種后將錐形瓶靜置于30℃培養(yǎng)箱中，每隔12 h檢測CO2失重，失重小于0.5 g時視為發(fā)酵終止，對發(fā)酵液進(jìn)行蒸餾，檢測風(fēng)味物質(zhì)生成量。

1.3.2 風(fēng)味物質(zhì)生成量的檢測

乙酸酯及高級醇等微量風(fēng)味物質(zhì)通過氣相色譜進(jìn)行檢測。氣相色譜儀的色譜柱采用AgilentHP-INNOWAX（30 m×320 μm×0.25 μm），載氣為高純氮氣，柱流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣口溫度200℃，檢測器溫度150℃。升溫程序：起始溫度50℃，保持8 min，以5℃/min升至150 ℃，保持 15 min；分流進(jìn)樣，分流比為 10∶1。

1.3.3 分析方法

釀酒酵母和球擬酵母采用血球計數(shù)板的方法進(jìn)行計數(shù)；CO2釋放量采用稱重法；發(fā)酵液中剩余還原糖含量采用斐林試劑法[15]；酒精度的測定采用酒精計比重法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖分析，數(shù)據(jù)代表3個獨立重復(fù)數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，統(tǒng)計學(xué)分析由SPSS 19.0軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單菌發(fā)酵對風(fēng)味物質(zhì)的影響

利用釀酒酵母菌株AY15、高產(chǎn)酯酵母MY15與球擬酵母WY2進(jìn)行單菌發(fā)酵，發(fā)酵過程中的CO2總失重、酒精度、發(fā)酵周期和發(fā)酵液中剩余還原糖含量如表1所示。

表1 菌株單獨發(fā)酵對發(fā)酵特征的影響Table 1 Effect of separate fermentation of strain on fermentation characteristics

由表1可知，3株菌株純種發(fā)酵時，CO2總失重在26.1 g～26.2 g之間，酒精度均為9.4%vol，均無明顯差異。但是AY15和MY15的發(fā)酵周期為5 d，而球擬酵母則需要7 d才能完成發(fā)酵過程。

白酒香味成分有醇類、酯類、酸類和醛類等，每種成分都對白酒的風(fēng)味有不同的貢獻(xiàn)[16-17]。本試驗檢測了酒樣中乙酸乙酯、乙酸異戊酯、正丙醇、異丁醇、異戊醇、苯乙醇的含量，結(jié)果如圖1所示。

圖1 菌株單獨發(fā)酵對乙酸酯和高級醇生成量的影響Fig.1 The impact of single fermentation on acetate ester production

由圖1可知，當(dāng)3株菌株進(jìn)行純種發(fā)酵時，釀酒酵母MY15的乙酸乙酯生成量為275.19 mg/L，是野生型菌株AY15的22.3倍，證明醇乙?；D(zhuǎn)移酶編碼基因ATF1的過表達(dá)使產(chǎn)酯能力得到了大幅度的提高。球擬酵母WY2的乙酸乙酯生成量為116.93 mg/L，同樣具有較強(qiáng)的乙酸乙酯生成能力。釀酒酵母MY15純種發(fā)酵時生成了35.16 mg/L的乙酸異戊酯；釀酒酵母AY15和球擬酵母WY2純種發(fā)酵時未檢測到乙酸異戊酯，這可能是由于酒樣中含量過低導(dǎo)致氣相色譜無法檢測出。

球擬酵母WY2的正丙醇和異丁醇生成量分別為24.65 mg/L和124.08 mg/L，比釀酒酵母AY15的正丙醇和異丁醇生成量分別提高了1.76倍和2.48倍；異戊醇和苯乙醇的生成量為189.71 mg/L和60.96 mg/L，與菌株AY15單獨發(fā)酵相比分別降低了19.07%和42.15%。由于高產(chǎn)酯釀酒酵母MY15中的支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶編碼基因BAT2被敲除，阻斷了氨基酸生成α-酮酸的轉(zhuǎn)氨過程，導(dǎo)致異丁醇與異戊醇低于釀酒酵母AY15。

2.2 不同接種體積比對混合發(fā)酵的影響

2.2.1 發(fā)酵性能理化指標(biāo)分析

以不同接種體積比進(jìn)行混合發(fā)酵，發(fā)酵性能相關(guān)指標(biāo)如表2所示。

表2 不同接種體積比對發(fā)酵特征的影響Table 2 The impact of fermentation performance by different inoculation proportion

由表2可知，當(dāng)釀酒酵母與球擬酵母以不同體積比接種進(jìn)行發(fā)酵時，發(fā)酵周期由5 d縮短為4 d。6個試驗組的CO2總失重在26.9 g～27.8 g之間，酒精度在9.5%vol～9.7%vol之間，證明了不同接種體積比對CO2總失重和酒精度沒有顯著影響。

釀酒酵母與非釀酒酵母以同步接種的方式進(jìn)行混合發(fā)酵時，釀酒酵母能夠優(yōu)先利用碳源而迅速增殖，抑制非釀酒酵母的生長；非釀酒酵母可能會受到營養(yǎng)物質(zhì)、乙醇、pH值、酵母代謝物等因素的影響，與釀酒酵母產(chǎn)生競爭抑制，影響發(fā)酵結(jié)果[10，18]。這種抑制效果的強(qiáng)弱與接種量的比例存在著密切的聯(lián)系，F(xiàn)an等[19]將S.cerevisiae和W.anomalus以不同接種菌數(shù)比進(jìn)行混合發(fā)酵，接種菌數(shù)比6∶1時還原糖消耗速度最慢、CO2釋放量最低；接種菌數(shù)比為 1∶1 和 1∶2 時，還原糖消耗量和CO2釋放量是相似的，其效果優(yōu)于6∶1的接種菌數(shù)比。荊雄等[20]將檸檬形克勒克酵母（Klockera apiculata）和東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）與釀酒酵母分別進(jìn)行了混合發(fā)酵，發(fā)酵前期非釀酒酵母和釀酒酵母會相互抑制，但并未影響最終的酒精度。在本研究中，將釀酒酵母AY15、MY15分別與球擬酵母 WY2 以 1∶1、1∶2、2∶1 的體積比接種，并進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵周期不僅沒有延長，與釀酒酵母純種發(fā)酵相比反而縮短至4 d。這可能是因為兩種酵母接種比例相差較小，接種至發(fā)酵培養(yǎng)基后雖然出現(xiàn)了競爭抑制，但并未影響整體的發(fā)酵進(jìn)程。而兩種酵母的同時接種加快了混合發(fā)酵體系中還原糖被消耗的速度，這是發(fā)酵周期縮短的主要原因。

2.2.2 不同接種體積比對乙酸酯生成量的影響

發(fā)酵過程中非釀酒酵母的生長代謝可以提高原料的利用率、合成風(fēng)味成分增加酒體的芳香，但釀酒酵母仍是發(fā)酵過程不可或缺的組分，將不同的非釀酒酵母與釀酒酵母進(jìn)行組合，達(dá)到抑制其不良作用，發(fā)揮優(yōu)良功能的目的[21]。釀酒酵母AY15和MY15分別與菌株 WY2 以不同體積比（1∶1、1∶2、2∶1）接種進(jìn)行混合發(fā)酵對乙酸酯（乙酸乙酯和乙酸異戊酯）的提升效果如圖2所示。

圖2 不同接種體積比對乙酸酯生成量的影響Fig.2 The impact of different inoculation proportion on acetate ester production

由圖2可知，接種體積比為1∶2時生成的乙酸乙酯生成量分別為 75.96 mg/L（A∶W）和 351.65 mg/L（M∶W），明顯高于其他兩種接種體積比。這說明了釀酒酵母的接種量會影響球擬酵母的產(chǎn)酯能力。接種體積比為1∶2時，球擬酵母數(shù)量占優(yōu)勢，減弱了釀酒酵母的抑制效果，促進(jìn)了乙酸酯的生成；接種體積比為2:1時，釀酒酵母生成的乙醇與代謝物限制了球擬酵母的產(chǎn)酯能力，因此乙酸酯生成量較低。在Fan等[22]的研究中證明了S.cerevisiae和W.anomalus接種菌數(shù)比為1∶2時生成的乙酸乙酯是最高的，與本研究結(jié)果相似。釀酒酵母AY15與球擬酵母WY2混合發(fā)酵時同樣未檢測到乙酸異戊酯，這是由于釀酒酵母AY15生成乙酸異戊酯的能力較弱，球擬酵母的加入不能顯著提高乙酸異戊酯的生成能力。

2.2.3 不同接種體積比對高級醇生成量的影響

釀酒酵母AY15和MY15分別與菌株WY2以不同接種體積比（1∶1、1∶2、2∶1）進(jìn)行混合發(fā)酵對高級醇的影響如圖3所示。

圖3 不同接種體積比對高級醇生成量的影響Fig.3 The impact of different inoculation proportion on higher alcohol production

由圖3可知，釀酒酵母菌株AY15與球擬酵母WY2以不同接種體積比進(jìn)行混合發(fā)酵時，異丁醇和異戊醇的生成量與釀酒酵母AY15相比均被提高。但是高產(chǎn)酯釀酒酵母MY15與球擬酵母混合發(fā)酵時，異丁醇和異戊醇生成量沒有發(fā)生變化。這可能是因為MY15菌株具有較高的酯合成酶活性，促使異丁醇和異戊醇轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的乙酸酯，消耗了部分高級醇，因此混合發(fā)酵中的高級醇生成量與MY15純種發(fā)酵時沒有顯著差別。有研究證明，白酒的高級醇含量過高不僅會影響白酒的風(fēng)味，飲用后還會引起“上頭”現(xiàn)象，影響人的健康。利用高產(chǎn)酯釀酒酵母MY15進(jìn)行的混合發(fā)酵將高級醇控制在了較低的范圍內(nèi)，這有助于提升白酒的品質(zhì)。

2.3 不同接種順序?qū)︼L(fēng)味物質(zhì)含量的影響

2.3.1 發(fā)酵性能理化指標(biāo)分析

釀酒酵母與球擬酵母以不同接種順序進(jìn)行混菌發(fā)酵時，發(fā)酵性能如表3所示。

表3 不同接種順序?qū)Πl(fā)酵特征的影響Table 3 The impact of fermentation performance by different sequential culture

從表3中可以看出，各試驗組的CO2總失重在25.5 g～26.2 g之間，酒精度均為9.5%vol，發(fā)酵周期均為5 d，與AY15和MY15純種發(fā)酵相比均沒有顯著差異。這說明以1 d的時間間隔進(jìn)行順序接種時，釀酒酵母和球擬酵母的產(chǎn)酒精能力未受到明顯的影響，這有利于白酒的釀造。楊婕等[23]發(fā)現(xiàn)，將L.thermotolerans菌株與S.cerevisiae以順序接種進(jìn)行發(fā)酵時，混合體系中的酒精度會低于S.cerevisiae純種發(fā)酵。在吳軒德等[10]的研究中，先接種 S.cerevisiae，發(fā)酵 24 h 后再接種A.pasteurianus時，酒精度也出現(xiàn)了明顯降低。這些結(jié)果與本研究結(jié)果有所不同，這可能是由于球擬酵母菌種的發(fā)酵性能不同于L.thermotolerans和A.pasteurianus，在混合發(fā)酵體系中雖然存在競爭關(guān)系，但依舊能保持較好的產(chǎn)酒精能力。

2.3.2 不同接種順序?qū)σ宜狨ド闪康挠绊?/p>

不同的接種順序?qū)旌习l(fā)酵體系中乙酸酯生成量的影響如圖4所示。

圖4 不同接種順序?qū)σ宜狨ド闪康挠绊慒ig.4 Effect of different inoculation sequence on the production of acetate ester

由圖4可知，以“釀酒酵母—球擬酵母”的順序接種時，試驗組AW和MW的乙酸乙酯生成量分別為15.37 mg/L和310.36 mg/L，與AY15和MY15純種發(fā)酵相比分別提高了24.55%和12.78%。這說明先接種釀酒酵母再接種球擬酵母有利于乙酸乙酯的生成。以“球擬酵母—釀酒酵母”的順序接種時，試驗組WA的乙酸乙酯生成量明顯提高，是AY15單獨發(fā)酵的2.05倍，但試驗組WM的乙酸乙酯生成量（189.91 mg/L）卻低于MY15純種發(fā)酵。這意味著球擬酵母的優(yōu)先接種使菌體數(shù)量快速增長，增強(qiáng)了與釀酒酵母的競爭關(guān)系，影響乙酸乙酯的生成。由于釀酒酵母菌株AY15的產(chǎn)酯能力遠(yuǎn)低于球擬酵母，在順序接種發(fā)酵時，球擬酵母能夠發(fā)揮產(chǎn)酯能力，小幅度地提升發(fā)酵體系整體的乙酸乙酯生成量；但高產(chǎn)酯釀酒酵母菌株MY15的產(chǎn)酯能力強(qiáng)于球擬酵母，因此球擬酵母的先接種雖然影響了MY15菌株的生長，但MY15菌株依然保持了其高產(chǎn)酯的發(fā)酵特性。順序接種發(fā)酵結(jié)束后，試驗組WM的乙酸乙酯生成量較球擬酵母單獨發(fā)酵相比，提升1.62倍。

2.3.3 不同接種順序?qū)Ω呒壌忌闪康挠绊?/p>

不同的接種順序?qū)旌习l(fā)酵體系中高級醇生成量的影響如圖5所示。

圖5 不同接種順序?qū)Ω呒壌忌闪康挠绊慒ig.5 Effect of different inoculation sequence on higher alcohol production

由圖5可知，各試驗組的正丙醇生成量和苯乙醇生成量與AY15、MY15和WY2純種發(fā)酵的生成量相似，正丙醇生成量在17.84 mg/L～25.06 mg/L之間，苯乙醇生成量在64.26 mg/L～79.44 mg/L之間，而異丁醇生成量在先接種球擬酵母的試驗中提升了一倍。試驗組AW和WA異戊醇生成量比釀酒酵母AY15純種發(fā)酵生成量低，高于球擬酵母WY2純種發(fā)酵，而試驗組MW和WM異戊醇生成量低于AY15和WAY2純種發(fā)酵。因此，混合發(fā)酵體系中的高級醇終生成量決定于先接種菌株的高級醇生成量，后接種球擬酵母的方法，對高級醇生成量沒有太大的影響，甚至可以少量降低高級醇生成量。

3 結(jié)論

以工業(yè)釀酒酵母菌株AY15、高產(chǎn)酯釀酒酵母菌株MY15、球擬酵母WY2為出發(fā)菌株，分別通過單菌發(fā)酵、不同接種體積比的混菌發(fā)酵和不同接種順序的混菌發(fā)酵，檢測其發(fā)酵過程中發(fā)酵性能、乙酸酯及高級醇生成量的變化。結(jié)果表明，不同接種體積比以及不同接種順序?qū)湍赴l(fā)酵性能和高級醇生成量沒有顯著影響。當(dāng)高產(chǎn)酯釀酒酵母MY15和球擬酵母WY2接種體積比為1∶2時生成的乙酸乙酯含量最高，為351.65mg/L。近幾年，非釀酒酵母的研究成為釀酒領(lǐng)域的熱點，但是對球擬酵母研究比較少。因此，將高產(chǎn)酯釀酒酵母與球擬酵母進(jìn)行單獨和混菌發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵優(yōu)于單獨接種釀酒酵母或球擬酵母，在保證酵母發(fā)酵性能不變的前提下,能有效地利用發(fā)酵液中的酸類物質(zhì)和高級醇,合成更多的酯類化合物，明顯提高了發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味特征，揭示了球擬酵母對高產(chǎn)酯釀酒酵母產(chǎn)酯能力的強(qiáng)化作用，為高產(chǎn)酯釀酒酵母在清香型白酒發(fā)酵中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。