大棗果酒發(fā)酵劑的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

韓希鳳，姜子濤，2*，蓋旭，王俊全，李書啟，魏萌，陳柳

（1.天津天獅學院食品工程學院，天津 301700；2.天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津 300134）

大棗作為我國特有果品，除含有大量的糖類、氨基酸，還富含維生素，如 VC、VP、VB等，具有護肝養(yǎng)腎、生津補血等多種功能作用[1-4]；棗樹因適應性強，種植面積大，產量高，遍布山東、河南、陜西、甘肅等省，覆蓋面極廣[5]。目前，大棗精深加工產品少，以干制品為主，如何豐富大棗精深加工品的數量和質量提升其附加值，成為大棗走向產業(yè)化的重要課題[6]。大棗果酒是發(fā)酵型果酒，是利用酵母菌繁殖代謝將大棗中的糖轉化為酒精的過程，得到的棗香濃郁、口感清爽的產品[7]。大棗中豐富的營養(yǎng)物質，為大棗果酒的制作提供了物質基礎，且發(fā)酵后的大棗果酒具有一定的營養(yǎng)、藥用價值且風味獨特，在市場上的需求量日益增多。

釀酒工業(yè)的“四個轉變”中的一個方面就是從糧食酒向果類酒的轉化說明果酒的研制已成為今后果品精深加工品的研究的重點。市場上的棗酒主要有兩種，一種是棗汁與酒精的勾兌酒，一種是經發(fā)酵劑釀制的發(fā)酵棗酒[9]。經發(fā)酵后的大棗果酒營養(yǎng)豐富，口味獨特而備受人們的關注。釀造大棗果酒的發(fā)酵劑主要采用葡萄酒釀造用的品種，對適宜大棗果酒釀造的專用釀酒酵母研究較少。在釀造過程中，釀酒酵母種類與果酒的口感和風味有著直接的關系，這也是果酒品質形成的關鍵因素，因此，選擇適合大棗果酒發(fā)酵的釀酒酵母種類顯得尤為重要[10]。

本文以大棗果漿為原料，選取6種釀酒酵母（BO2B、X16、F33、EC-118、帝伯士、FX10）進行大棗果酒的釀制，通過比較發(fā)酵結束時大棗果酒中的總酸、抗氧化性以及感官評分等指標，篩選適合大棗果酒釀制的酵母菌。在此基礎上，對篩選出的適宜酵母菌的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得到該酵母菌發(fā)酵大棗果酒的最佳工藝條件，以期為提高大棗果酒的加工提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大棗：市售，表皮無損傷，色澤明亮的干棗，果肉豐滿、堅韌，皺紋淺細；FX10、BO2B、X16、EC-118、F33、帝伯士（均為葡萄酒專用酵母，食品級）：煙臺帝伯士商貿有限公司；果膠酶[（EC3.2.1.15）>40 0000 AJDU/g，食品級]：煙臺帝伯士自釀機有限公司；1，1-二苯-2-苦基肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH，分析純）：北京索萊寶有限公司；水楊酸（分析純）：成都科龍化工試劑廠；沒食子酸（分析純）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

紫外分光光度計（UV2550）：日本島津公司；高溫滅菌鍋（MJ-78A）：施都凱儀器設備有限公司；阿貝折射儀（WYA-ZT型）：上海儀電物理光學儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱（SHX-150）：浙江金壇市萬華實驗儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 大棗果酒工藝流程

大棗→挑選→清洗→瀝干→剪碎→烘烤（200℃、1.5 h）→浸泡 12 h→料液比 1∶3（g/mL）加水打漿→果膠酶酶解（果膠酶用量3%、3 h）→成分調整→滅菌（沸水浴15 min）→冷卻→酵母菌活化（2%蔗糖水、28℃、15 min）→接種→發(fā)酵→陳釀→澄清→過濾→灌裝→殺菌→成品[11-13]

1.3.2 主要指標測定及感官評價

1.3.2.1 可溶性固形物（soluble solid content，SSC）

SSC的測定參照NY/T 2637—2014《水果和蔬菜可溶性固形物含量的測定 折射儀法》[14]。

1.3.2.2 總酸

總酸采用酸堿滴定法測定[15]。

1.3.2.3 酒精度

酒精度采用酒精計法[16]測定。

1.3.2.4 DPPH·清除率

DPPH·清除率參照王杰等[17-18]的方法測定。

1.3.2.5 羥基自由基（·OH）清除率

羥基自由基清除率參照曹力等[19]的方法測定。

1.3.2.6 超氧陰離子自由基（O2-·）清除率

O2-·清除率參照李安等[20]的方法測定。

1.3.2.7 感官評分

大棗果酒感官評分標準如表1所示。

表1 大棗果酒感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standard of Chinese jujube wine

該標準由14名專業(yè)人員組成的感官評分小組成員參照NY/T 1508—2017《綠色食品果酒》[21]。感官評價小組成員對果酒進行評價打分（滿分為100），取平均值作為試驗結果。

1.4 大棗果酒發(fā)酵劑的篩選

分別稱取制備好的大棗果漿100 g，調整初始pH4.0，6 種發(fā)酵劑（FX10、BO2B、X16、EC-118、F33、帝伯士）均按照接種量0.5 g/L、24℃下連續(xù)發(fā)酵8 d，每天測酒精度、SSC；發(fā)酵第8天時，測定DPPH·、·OH、超氧陰離子自由基（O2-·）清除率、總酸及感官評分。

1.5 大棗果酒發(fā)酵條件的單因素試驗設計

1.5.1 初始pH值

分別稱取制備好的大棗果漿50 g，按0.5 g/L接種，調整 pH 值分別為 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，24 ℃下發(fā)酵7 d后，測酒精度及感官評分。

1.5.2 發(fā)酵溫度

分別稱取制備好的大棗果漿50g，調整初始pH4.0，接種量 0.5 g/L，在 16、20、24、28、32 ℃下發(fā)酵 7 d 后，測酒精度及感官評分。

1.5.3 酵母接種量

分別取制備好的大棗果漿50 g，調整初始pH4.0，分別按 0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 g/L 接種，在 24 ℃下發(fā)酵7 d后，測酒精度及感官評分。

1.5.4 發(fā)酵時間

大棗果酒適宜的發(fā)酵時間由酵母菌的篩選試驗中獲得，因此在單因素試驗中不再進行。

1.6 F33酵母菌發(fā)酵條件的正交試驗設計

根據大棗果酒發(fā)酵條件的單因素試驗的結果，選擇發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、酵母接種量（C）和初始pH值（D）進行正交試驗，因素與水平如表2所示。

表2 因素水平Table 2 Design of factors and levels

2 結果與分析

2.1 大棗果酒發(fā)酵劑的篩選

2.1.1 不同發(fā)酵劑對大棗果酒酒精度的影響

不同發(fā)酵劑對大棗果酒酒精度的影響見圖1。

圖1 不同發(fā)酵劑對大棗果酒酒精度的影響Fig.1 Effects of different starters on alcohol content of Chinese jujube wine during fermentation

由圖1可知，隨發(fā)酵時間的延長，6種酵母菌釀制的大棗果酒，其酒精度均呈上升趨勢，但發(fā)酵劑不同，上升速率隨發(fā)酵時間有所不同。發(fā)酵前4 d，6種酵母菌發(fā)酵的大棗果酒中，EC-118發(fā)酵的果酒其酒精度增加最慢，F33菌種發(fā)酵的大棗果酒雖然前4 d酒精度增加不明顯，4 d后，酒精度急劇上升，7 d后，酒精度上升平穩(wěn)。且發(fā)酵第7天時，F33發(fā)酵大棗果酒的酒精度高于其它5種菌種處理的，高達8.6%vol。就發(fā)酵速度及酒精度來說，F33菌種是比較適合大棗果酒發(fā)酵的發(fā)酵劑。

2.1.2 不同發(fā)酵劑對大棗果酒可溶性固形物的影響

在發(fā)酵過程中，酵母菌利用生長代謝中分泌的酶將大棗果漿中的糖轉化為酒精。不同發(fā)酵劑對大棗果酒可溶性固形物的影響見圖2。

圖2 不同發(fā)酵劑對大棗果酒可溶性固形物含量的影響Fig.2 Effects of different starters on SSC of Chinese jujube wine during fermentation

由圖2可知，隨著發(fā)酵時間延長，6種發(fā)酵劑處理的大棗果酒中，可溶性固形物含量均呈下降趨勢，但F33處理的大棗果酒下降最明顯，說明F33酵母菌對糖的利用率高，發(fā)酵能力強。發(fā)酵結束后，測得F33發(fā)酵的大棗果酒中可溶性固形物最低為8.0%，FX10發(fā)酵的9.0%，僅次于F33發(fā)酵。因此，F33酵母菌是大棗果酒發(fā)酵能力最強的發(fā)酵劑。

2.1.3 不同發(fā)酵劑對大棗果酒總酸的影響

不同發(fā)酵劑對大棗果酒總酸的影響見圖3。

圖3 不同發(fā)酵劑對大棗果酒總酸的影響Fig.3 Effects on the total acidity of Chinese jujube wine by different starters after fermentation

由圖3可知，6種發(fā)酵劑發(fā)酵果酒的總酸與最初大棗果汁的總酸0.32%相比，均呈上升趨勢，發(fā)酵8 d后，BO2B菌種發(fā)酵的大棗果酒總酸最低為1.47%，FX10發(fā)酵的最高為2.01%，F33發(fā)酵的為1.69%，居中，即6種發(fā)酵劑產酸能力有差異，其產酸能力由低到高的順序為 BO2B＜X16＜F33＜EC-118＜帝伯士＜FX10。

2.1.4 不同發(fā)酵劑對大棗果酒抗氧化性的影響

不同發(fā)酵劑對大棗果酒抗氧化性的影響見圖4。

圖4 不同發(fā)酵劑對大棗果酒抗氧化性的影響Fig.4 Effects of different starters on the antioxidation of Chinese jujube wine after fermation

由圖4可知，6種發(fā)酵劑發(fā)酵8 d后的大棗果酒對·OH、DPPH·、超氧陰離子自由基（O2-·）均有一定的清除作用，發(fā)酵8 d后，3種發(fā)酵劑的大棗果酒清除DPPH·能力均最強，清除超氧陰離子自由基（O2-·）能力最弱，清除·OH能力居中。X16酵母發(fā)酵的大棗果酒對3種自由基的清除能力是最弱的，F33、EC-118、帝伯士3種酵母發(fā)酵的大棗果酒對3種自由基的清除能力相差不大，均比較高；其中F33、EC-118、帝伯士3種酵母發(fā)酵的大棗果酒DPPH·清除能力均在98%以上。由此可見，經6種酵母菌發(fā)酵的大棗果酒因含有多酚及類黃酮化合物，可以看作是一種相對較強的自由基清除劑。

2.1.5 不同發(fā)酵劑對大棗果酒感官品質的影響

不同發(fā)酵劑對大棗果酒感官品質的影響見表3。

表3 不同發(fā)酵劑對大棗果酒感官品質的影響Table 3 Sensory evaluation of Chinese jujube wine fermented by different fermentation starters

由表3可知，感官評分總分最高的是由F33酵母發(fā)酵的大棗果酒，為88.6分，果酒棗香濃郁，無苦味，酒體透亮，呈琥珀色，無懸浮物，酒味酸甜適口，品質佳。FX10酵母發(fā)酵的大棗果酒感官評價得分最低為62.9分，且酒體苦味較重，酒質粗糙，有異味，不太適合飲用。6種發(fā)酵劑發(fā)酵的大棗果酒中，EC-118、BO2B、FX10發(fā)酵的外觀得分都在20分左右，所得果酒顏色偏暗；FX10發(fā)酵的果酒棗香味最淡，F33發(fā)酵的果酒棗香濃郁，得分最高為27.2分；就滋味來說，帝伯士和FX10發(fā)酵的果酒均因苦味較重，得分偏低，X16發(fā)酵的果酒滋味較好，苦味輕，無異味，F33發(fā)酵的得分最高為35.2分，酸甜可口，無苦味。

綜上所述，酵母菌種類與大棗果酒的口感及風味有直接關系，均成為大棗果酒品質形成的關鍵因素。通過比較6種發(fā)酵劑的發(fā)酵能力，比較發(fā)酵結束時，果酒中的總酸、抗氧化性以及感官評分，表明接種F33酵母的果漿中糖轉化率高，發(fā)酵能力較強，發(fā)酵后果酒中的各項指標均優(yōu)于其它5種發(fā)酵劑發(fā)酵的大棗果酒，因此，選擇F33酵母制作大棗果酒。

2.2 F33酵母發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 初始pH值

初始pH值對大棗果酒品質的影響見圖5。

圖5 初始pH值對大棗果酒品質的影響Fig.5 Effect on the quality of Chinese jujube wine by initial pH

由圖5可知，初始pH值在3.0～4.0范圍內時，大棗果酒的酒精度隨著pH值的增加而升高，說明F33酵母菌的生長繁殖在pH值過低時會受阻，導致F33因生長緩慢而不能占據優(yōu)勢，降低酒精的生成量，而且雜菌所分泌的酶不能使糖類轉化成乙醇，而導致大棗果酒酒精度較低（初始pH值為3.0時，酒精度為6.8%vol），酸味較重，感官評分低[22]。隨初始pH值的升高，F33酵母菌的生長速度逐漸加快，pH值為4.0時，果酒酒精度達最大值8.8%vol；pH值再上升，大棗果酒的酒精度開始下降。初始pH值為4.0時，發(fā)酵得到的大棗果酒感官評分最高為70.8分，后隨初始pH值上升，F33酵母菌的生長繁殖受到抑制，大棗果酒口感清淡，酸味增加，感官品質下降。由此，選取適宜的初始pH值為4.0。

2.2.2 酵母接種量

F33酵母接種量對大棗果酒品質的影響見圖6。

圖6 F33酵母接種量對大棗果酒品質的影響Fig.6 Effect of F33 yeast inoculation amount on the quality of Chinese jujube wine

由圖6可知，F33酵母接種量在0.1 g/L～0.5 g/L范圍內，大棗果酒酒精度逐漸上升，說明接種量越高，越有利于糖轉化為酒精產物[23]；但高于0.5 g/L后，酒精度開始下降，這可能是接種量過高，酵母菌間競爭加劇，造成營養(yǎng)物質缺乏，而抑制了其生長繁殖[24]。當酵母接種量為0.5 g/L時，大棗果酒感官評分最高為80.2分，酒香味濃郁，品質最好，后隨酵母接種量的增加，果酒感官品質下降，棗香、酒味變弱，有異味。由此，選取適宜的酵母接種量為0.5 g/L。

2.2.3 發(fā)酵溫度

發(fā)酵溫度對大棗果酒品質的影響見圖7。

圖7 發(fā)酵溫度對大棗果酒品質的影響Fig.7 Effect on the quality of Chinese jujube wine by temperature

發(fā)酵溫度過低時，發(fā)酵周期會因酵母菌生長緩慢而延長，且易染菌，致使產酒率降低，甚至發(fā)酵失??；發(fā)酵溫度升高時，酵母菌生長繁殖隨之加快，當酵母菌濃度逐步升高，產酒率能力隨之提高；但過高的溫度，會導致菌體衰老加快、喪失活力甚至過早死亡，產酒率大幅度降低，并可能對果酒的品質產生不利影響[25]。由圖7可知，隨發(fā)酵溫度上升，大棗果酒的酒精度和感官評分均呈先升后降趨勢，24℃時二者均達最高，即酒精度8.8%vol，感官80.4分。因發(fā)酵溫度越高，能源消耗就越大，因此，綜合酒精度和感官評分結果，選取適宜的發(fā)酵溫度為24℃。

2.3 正交試驗

正交試驗結果見表4。

表4 正交試驗結果Table 4 Orthogonal experiment results

由表4可知，4個試驗因素對大棗果酒感官品質影響順序為B＞A＞C＞D，即發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞酵母接種量＞初始pH值，方差分析見表5。

表5 方差分析Table 5 Analysis of variance

由表5可知，酵母接種量和初始pH值的影響不顯著，發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間的影響顯著。得到的最佳的工藝組合為A2B3C3D2（方案1），即接種量0.6 g/L、發(fā)酵溫度為26℃、發(fā)酵時間7 d、初始pH4.0，未出現在列表中；通過驗證試驗將方案1與列表中感官評分最高的A2B2C3D1（方案2，即接種量0.6 g/L、發(fā)醇溫度為24℃、發(fā)醇時間7 d、初始pH3.5）的試驗結果進行對比分析，發(fā)現經方案2發(fā)酵的大棗果酒酒精度為8.7%vol，感官評分為89.8分，均低于方案1發(fā)酵的大棗果酒；說明F33最佳發(fā)酵工藝條件與正交結果（方案1）一致，即F33在接種量0.6 g/L、初始pH4.0時，在26℃下發(fā)酵7 d得到的大棗果酒感官評分為90.2分，酒精度9.0%vol，符合優(yōu)化結果。

2.4 大棗果酒的成品質量指標檢測

感官指標：大棗果酒口感好、品質佳、無異味；酒體清澈、琥珀色，棗香和酒香濃郁、舒服。

理化指標：微生物指標（菌落總數40個/mL＜50個/mL，大腸桿菌（CFU/g）未檢出；酒精度為 9.0%vol；透光率為90.8%，還原糖（以葡萄糖計）為3.93 g/L）；pH值3.8；可溶性固形物為5.4%，總酸（以酒石酸計）4.8 g/L，均符合國家農業(yè)部標準NY/T 1508—2017《綠色食品果酒》。

3 結論

以大棗果漿為原料，采用6種釀酒酵母（BO2B、X16、F33、EC-118、帝伯士、FX10）進行大棗果酒的釀制，對發(fā)酵過程中大棗果酒的酒精度和可溶性固形物變化以及發(fā)酵后的大棗果酒總酸，抗氧化性和感官評分進行比較分析，發(fā)現F33酵母發(fā)酵能力強，發(fā)酵后果酒中的各項指標均優(yōu)于其它5種發(fā)酵劑發(fā)酵的大棗果酒，適合于制作大棗果酒。

在以上試驗的基礎上，以感官評價為指標，通過正交試驗法得到了F33最佳發(fā)酵條件，對大棗果酒感官品質的影響順序為B＞A＞C＞D，即發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞酵母接種量＞初始pH值，且接種量和初始pH值的影響不顯著，發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間的影響顯著。經驗證試驗，酵母接種量0.6 g/L，初始pH4.0，26℃下發(fā)酵7 d，所得大棗果酒感官評分為90.2分，酒精度9.0%vol，且果酒品質佳，口感好，各項指標符合國家農業(yè)部標準（NY/T 1508—2017《綠色食品 果酒》），說明此條件為F33酵母菌的最佳發(fā)酵條件。