沙棘葉不同溶劑提取物活性物質(zhì)含量及抗氧化性研究

辛燕花，趙三虎，王瑜，陳柯文，梁雅婷，閆娜，趙春艷，張建華，吳承甍

（1.忻州師范學院，山西 忻州 034000；2.廣州萬物生健康產(chǎn)業(yè)有限公司，廣東 廣州 510642；3.中國科學院煙臺海岸帶研究所，山東 煙臺 264003）

沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）原產(chǎn)于歐亞大陸，在海拔2 500 m～4 300 m的許多國家都有栽培[1]。沙棘中含有豐富的維生素、胡蘿卜素、微量元素、氨基酸等生物活性物質(zhì)[2-4]。因此，沙棘已被臨床用于治療輻射損傷、燒傷、口腔炎癥、胃潰瘍等疾病[5-7]。沙棘葉含有豐富的活性物質(zhì)[8]，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)[9]、抗應(yīng)激和炎癥[10]的活性功能。目前，針對沙棘葉中的活性成分提取分離研究較多，不同的提取劑對沙棘葉中的活性物質(zhì)及抗氧化性的影響尚未見報道。

本文采用羥基自由基、超氧陰離子自由基和還原力3種體外抗氧化模型對沙棘葉甲醇提取物以及水相、丙酮相、乙醇相和乙酸乙酯相等5個極性部位的抗氧化活性進行研究，并測定其總多糖、總黃酮、總有機酸、抗壞血酸和氨基酸含量，進行相關(guān)性分析，為沙棘葉資源開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘葉：采摘于山西龐泉溝風景區(qū)。蘆丁標準品、谷氨酸標準品、沒食子酸標準品、抗壞血酸標準品：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-10N真空冷凍干燥機：北京亞星儀科科技發(fā)展有限公司；YZH-92A水浴恒溫振蕩器：江西省生物儀器制造有限公司；752紫外分光光度計：上海精研電子科技有限公司；LH-4035低速離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 沙棘葉處理

將沙棘嫩葉放置在真空冷凍干燥機中，冷阱溫度-40℃，真空度20 Pa、加熱板溫度10℃。冷凍干燥10 h至質(zhì)量不變，粉碎備用。

1.3.2 樣液制備

稱取沙棘葉 2.0 g，按照料液比 1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40（g/mL）加入一定體積雙蒸水，50 ℃恒溫水浴1 h，3 000 r/min離心10 min，取上清液，獲得沙棘葉的水提取溶液。按照同樣的方法，制備甲醇提取溶液、乙醇提取溶液、乙酸乙酯提取溶液和丙酮提取溶液，備用。

1.3.3 總黃酮含量的測定

總黃酮含量的測定參照文獻[11]進行，以蘆丁標準液的質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，在510 nm處測定吸光值，繪制標準曲線，其回歸方程為y=0.92x+0.0218，R2=0.9915。

1.3.4 總多糖含量的測定

總多糖含量的測定參照文獻[12]進行，以葡萄糖標準液的質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，在489 nm處測定吸光值，繪制標準曲線，其回歸方程為y=3.446 4x-0.001 6，R2=0.999 7。

1.3.5 氨基酸含量的測定

氨基酸含量的測定參照文獻[13]進行，以谷氨酸標準液的質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，在570 nm處測定吸光值，繪制標準曲線，其回歸方程為y=4.498 9x-0.034 9，R2=0.999 2。

1.3.6 總有機酸含量的測定

總有機酸含量的測定參照文獻[14]進行，以沒食子酸標準液的質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，在730 nm處測定吸光值，繪制標準曲線，其回歸方程為y=1.987x+0.005 2，R2=0.999 7。

1.3.7 抗壞血酸含量的測定

抗壞血酸含量的測定參照文獻[15]進行，以抗壞血酸標準液的質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，在244 nm處測定吸光值，繪制標準曲線，其回歸方程為 y=0.061 5x-0.015 3，R2=0.999 8。

1.3.8 抗氧化能力測定

超氧陰離子自由基清除能力、羥基自由基清除能力、還原能力測定參照文獻[16-18]進行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPPS Statistics 21軟件對數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑提取物含量分析

2.1.1 總黃酮含量分析

不同提取劑對沙棘葉總黃酮含量的影響見圖1。

圖1 不同提取劑對沙棘葉中總黃酮含量的影響Fig.1 Effects of different extracts on the content of total flavonoids in seabuckthorn leaves

由圖1可以看出，用不同的提取劑提取沙棘葉中的總黃酮，總黃酮含量差異性較大，同一種提取劑在不同的料液比下，總黃酮含量也呈現(xiàn)出明顯的差異。從圖1可以看出，相比其它4種提取劑，用甲醇作為提取劑，提取出沙棘葉中的總黃酮含量最高，其次是水>丙酮>無水乙醇>乙酸乙酯。

提取劑相同時，隨著提取溶劑體積的增加，5種提取劑提取出的總黃酮含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中，當以甲醇作為提取劑，在料液比為1∶10（g/mL）時，總黃酮的含量最高，為（64.26±1.38）mg/g。

2.1.2 總多糖含量分析

對沙棘葉的總多糖含量進行測定分析，結(jié)果見圖2。

圖2 不同提取劑對沙棘葉中總多糖含量的影響Fig.2 Effects of different extracts on the content of total polysaccharide in seabuckthorn leaves

由圖2可以看出，用不同的提取劑提取沙棘葉中的總多糖，總多糖含量差異性較大，同一種提取劑在不同的料液比下，總多糖含量也呈現(xiàn)出明顯的差異。相比其它4種提取劑，用甲醇作為提取劑，提取出沙棘葉中的總多糖含量最高。

提取劑相同時，隨著提取溶劑體積的增加，5種提取劑提取出的總多糖含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中，當以甲醇作為提取劑，在料液比為1∶10（g/mL）時，總多糖含量為（19.84±0.64）mg/g。

2.1.3 氨基酸含量分析

不同提取劑對沙棘葉氨基酸含量的影響見圖3。

圖3 不同提取劑對沙棘葉中氨基酸含量的影響Fig.3 Effects of different extracts on the content of amino acids in seabuckthorn leaves

由圖3可知，沙棘葉中氨基酸含量受提取劑的影響也較大，用不同的提取劑提取沙棘葉中的氨基酸，氨基酸含量差異明顯。其中，同一種提取劑采用不同的料液比，得到的氨基酸含量也呈現(xiàn)出明顯的差異。相比其它4種提取劑，用甲醇作為提取劑，提取出沙棘葉中的氨基酸含量最高，其次是水>丙酮>無水乙醇>乙酸乙酯。

提取劑相同時，隨著提取溶劑體積的增加，5種提取劑提取出的氨基酸含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中，當以甲醇作為提取劑，在料液比為1∶10（g/mL）時，氨基酸含量為（7.41±0.07）mg/g。

2.1.4 總有機酸含量分析

對沙棘葉總有機酸含量進行測定，結(jié)果見圖4。

圖4 不同提取劑對沙棘葉中總有機酸含量的影響Fig.4 Effects of different extracts on the content of total organic acids in seabuckthorn leaves

沙棘葉總有機酸含量的變化隨著提取劑的不同，呈現(xiàn)出明顯的差異。從圖4可以看出，提取劑對沙棘葉總有機酸含量的變化有很大的影響。呈現(xiàn)出的大致規(guī)律是甲醇>水>丙酮>無水乙醇>乙酸乙酯。其中，同一種提取劑采用不同的料液比，得到的總有機酸含量也呈現(xiàn)出明顯差異。

提取劑相同時，隨著提取溶劑體積的增加，5種提取劑提取出的總有機酸含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中，當以甲醇作為提取劑，在料液比為1∶10（g/mL）時，總有機酸含量為（3.45±0.05）mg/g。

2.1.5 抗壞血酸含量分析

對沙棘葉中的抗壞血酸含量進行測定，結(jié)果見圖5。

圖5 不同提取劑對沙棘葉中抗壞血酸含量的影響Fig.5 Effects of different extracts on the content of ascorbic acid in seabuckthorn leaves

沙棘葉中抗壞血酸含量隨著不同提取劑及料液比的不同而呈現(xiàn)出顯著的變化。其中，同一種提取劑采用不同的料液比，得到的抗壞血酸含量也呈現(xiàn)出顯著性的差異。

提取劑相同時，隨著提取溶劑體積的增加，5種提取劑提取出的抗壞血酸含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在料液比為 1∶5（g/mL）和 1∶10（g/mL）時，以甲醇作為提取劑得到的抗壞血酸含量較高，隨著提取溶劑的增加，以水作為提取劑得到的抗壞血酸含量較高。其中，當以甲醇作為提取劑，在料液比為1∶10（g/mL）時，抗壞血酸含量為（95.55±0.18）mg/g。

2.2 不同溶劑提取物抗氧化能力分析

2.2.1 羥基自由基清除能力測定

提取劑對沙棘葉羥基自由基清除能力的影響見圖6。

圖6 不同提取劑對沙棘葉中羥基自由基清除率的影響Fig.6 Effects of different extracts on the hydroxyl radical scavenging in seabuckthorn leaves

如圖6所示，不同提取劑對沙棘葉羥基自由基清除能力的影響不同。羥基自由基清除能力呈現(xiàn)出的大致規(guī)律是甲醇>水>丙酮>無水乙醇>乙酸乙酯。其中，同一種提取劑采用不同的料液比，羥基自由基清除能力也呈現(xiàn)出顯著性的差異。

提取劑相同時，隨著提取溶劑體積的增加，5種提取劑對羥基自由基清除能力影響呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中，當以甲醇作為提取劑，在料液比為1∶10（g/mL）時，羥基自由基清除率為（89.37±0.10）%。

2.2.2 超氧陰離子自由基清除能力測定

提取劑對超氧陰離子自由基的清除能力的影響見圖7。

圖7 不同提取劑對沙棘葉中超氧陰離子自由基清除率的影響Fig.7 Effects of different extracts on the superoxide anion radical scavenging in seabuckthorn leaves

如圖7所示，不同提取劑對沙棘葉超氧陰離子自由基清除能力的影響不同。超氧陰離子自由基清除能力呈現(xiàn)出的大致規(guī)律是丙酮>水>甲醇>無水乙醇>乙酸乙酯。其中，同一種提取劑采用不同的料液比，超氧陰離子自由基清除能力也呈現(xiàn)出明顯的差異。

提取劑相同時，隨著提取溶劑體積的增加，5種提取劑對超氧陰離子自由基清除能力的影響呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中，當丙酮作為提取劑，在料液比為 1∶10（g/mL）時，超氧陰離子自由基清除率為（98.28±0.00）%。

2.2.3 還原力測定

還原力受提取劑的影響見圖8。

從圖8可以看出，沙棘葉提取物還原力的大小隨著提取劑的不同而不同。其中，以甲醇和水作為提取劑時，還原力較為接近。在料液比1∶5（g/mL）和1∶10（g/mL）時，以丙酮作為提取劑，測定得到的還原力與甲醇和水作為提取劑時較為相近，隨著料液比的增加，還原力逐漸下降，低于以水和甲醇作為提取劑測定得到的還原力。

提取劑相同時，隨著提取溶劑體積的增加，5種提取劑對還原力大小的影響呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在沙棘葉原料與提取劑的比值為1∶10（g/mL）處達到最高。其中，當丙酮作為提取劑，在料液比為1∶10（g/mL）時，還原力為 0.85±0.01。

2.3 提取物含量與抗氧化性相關(guān)性分析

對提取物與抗氧化相關(guān)性進行分析，結(jié)果見表1。

表1 沙棘葉抗氧化性與活性物質(zhì)含量相關(guān)系數(shù)Table 1 Correlation coefficient between antioxidant capacity and active components of seabuckthorn leaves

續(xù)表1 沙棘葉抗氧化性與活性物質(zhì)含量相關(guān)系數(shù)Continue table 1 Correlation coefficient between antioxidant capacity and active components of seabuckthorn leaves

由表1可見，沙棘葉各極性部位對還原力、羥基自由基、超氧陰離子自由基清除能力與提取物中不同物質(zhì)含量均顯示正相關(guān)。

各極性部位還原力與總多糖、總黃酮、抗壞血酸和總有機酸含量顯示相關(guān)性較高。各極性部位羥基自由基清除能力與總黃酮和總有機酸的含量顯示相關(guān)性較高。各極性部位超氧陰離子自由基清除能力與抗壞血酸的含量顯示相關(guān)性較高。綜合提取物不同物質(zhì)和抗氧化性結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇、水和丙酮部位抗氧化活性最好，總多糖、總黃酮、抗壞血酸和總有機酸等含量也較高。由此表明，沙棘葉抗氧化的物質(zhì)基礎(chǔ)可能是總多糖、總黃酮、抗壞血酸和總有機酸等物質(zhì)。

3 討論與結(jié)論

沙棘葉活性物質(zhì)的含量受到不同提取劑及料液比的影響，本研究結(jié)果表明，沙棘葉中的總黃酮、總多糖、總有機酸、抗壞血酸和氨基酸含量都是在料液比為1∶10（g/mL）時達到最大值。這可能是由于料液比為1∶10（g/mL）時，溶劑對沙棘葉中活性物質(zhì)的溶解已基本達到飽和，繼續(xù)增加溶劑的用量，并不能顯著提高活性物質(zhì)的提取量。有研究者研究菠蘿蜜果皮總黃酮的提取時發(fā)現(xiàn)，料液比對黃酮得率的影響很大，隨料液比增大，黃酮提取率逐漸增大，持續(xù)增大料液比，黃酮提取率反而降低。因為在一定范圍內(nèi)，料液比增大利于增加溶劑和原料的接觸效果，增大濃度差，加快溶劑擴散，從而提高黃酮浸出率；而當料液比過大時，黃酮溶出量達到飽和，而其它雜質(zhì)溶出增多，反而降低了黃酮提取率[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)溶劑對沙棘葉活性物質(zhì)有明顯的影響，多數(shù)研究文獻也證實了活性物質(zhì)的提取率受提取劑的影響較大。有研究者指出，沙棘葉中的蘆?。S酮類物質(zhì)）含量受到不同溶劑的影響，沙棘葉中水提物蘆丁的提取量和提取率都低于醇提物[20]。沙棘葉中粗多糖提取率隨著提取劑的不同，得率也不相同，有文獻報道，采用乙酸乙酯、甲醇、蒸餾水提取沙棘粗多糖，得率分別為1.52%、1.71%和2.41%，比水提取得到的多糖得率要高[21]，與本試驗研究結(jié)果有區(qū)別。趙玉琪等研究者[22]對沙棘葉黃酮的提取研究發(fā)現(xiàn)，甲醇水溶液的提取率高于乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯和水等溶劑，并且抗氧化能力強，與本研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同提取劑及料液比對沙棘葉的抗氧化活性也有顯著影響。有文獻報道，用氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇4種不同溶劑對沙棘籽分別進行8 h萃取,甲醇作為萃取劑的提取物具有最高的抗氧化活性[23]。有研究者采用不同濃度的丙酮、甲醇、酸化甲醇、乙酸乙酯對沙棘籽提取物抗氧化活性進行評估發(fā)現(xiàn)，70%丙酮提取物具有最強的還原力[24]，本試驗結(jié)果表明，當丙酮作為提取劑，在料液比為1∶10（g/mL）時，還原力達到最大值為0.85，該報道與本研究結(jié)果較為相似。

試驗進一步對不同提取物中活性物質(zhì)含量與抗氧化活性進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)活性物質(zhì)的含量與抗氧化性呈現(xiàn)顯著正相關(guān)。尤其是抗壞血酸、總多糖、總黃酮的含量與抗氧化活性的相關(guān)系數(shù)較高，由此證明抗壞血酸、多糖、黃酮化合物可能是沙棘葉抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。