橘子不同部位活性成分含量及其體外抗氧化能力研究

劉仙俊，李文華*，孫紅艷，尤金美，張紅陽，張?zhí)煊?，郝春燕，衛(wèi)樂

（1.太原科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，山西 太原 030024；2.山東省臨沂市第十八中學(xué)，山東 臨沂 276000）

橘子，蕓香科柑橘屬（Citrus reticulata Blanco）植物[1]，不僅具有豐富的營養(yǎng)價值更具有抗氧化、抗癌、抗菌、抗炎、保護(hù)神經(jīng)、預(yù)防糖尿病和心血管疾病等重要的醫(yī)學(xué)價值[2-3]。橘肉香氣清爽，口感酸甜，富含營養(yǎng)成分，是人們的常食部位，橘皮、橘絡(luò)具有化痰止咳、健脾和胃、順氣活血的功效，經(jīng)常入藥使用[3-5]。橘子各部位的營養(yǎng)價值和其富含多酚類、黃酮類、多糖、礦物質(zhì)、維生素等生物活性物質(zhì)是分不開的[2，6-10]，這些天然活性物質(zhì)大多具有抗氧化的作用，能夠清除人體內(nèi)多余的自由基，使機(jī)體免受活性氧自由基傷害而導(dǎo)致的蛋白質(zhì)和核酸受損、酶失活、脂質(zhì)過氧化等不良后果[11-21]。目前對橘子生物活性物質(zhì)的研究主要集中在橘皮，孫紅彥[3]研究表明橘子皮提取物可以保護(hù)機(jī)體免疫器官、提高機(jī)體免疫水平、抑制體內(nèi)實(shí)體瘤的生長從而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用；劉存芳等[5]研究發(fā)現(xiàn)橘皮多糖對羥基自由基具有較強(qiáng)的清除作用且存在一定量效關(guān)系，但對橘皮、橘肉和橘絡(luò)的生物活性成分含量及其抗氧化性的比較研究很少有報道。

本文以橘皮、橘肉、橘絡(luò)作為研究對象，分別對其總酚、總黃酮和多糖含量及體外抗氧化性能進(jìn)行檢測和比較分析，旨在為橘皮、橘肉、橘絡(luò)的深加工提供充足的參考依據(jù)，為橘子各部位相關(guān)產(chǎn)品在抗氧化功效方面的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橘子：市售，臨海涌泉蜜橘，新鮮優(yōu)質(zhì)且無壞果。

沒食子酸、蘆丁、葡萄糖（均為色譜純）：美國Sigma公司；福林酚、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（均為色譜純）：上海源葉生物科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、七水硫酸亞鐵（均為分析純）：上海生工生物工程股份有限公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、正丁醇、乙醚、氯仿、抗壞血酸、水楊酸、濃鹽酸、過氧化氫、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

臺式離心機(jī)（D-37520型）：德國賽默飛世爾科技公司；紫外可見分光光度計(jì)（UV-5200型）：上海元析儀器有限公司；高速萬能粉碎機(jī)（FW-200型）、電熱恒溫水浴鍋（HH-2A型）：北京科偉永興儀器有限公司；電子分析天平（FA1004型）：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；酸度計(jì)（PHS-3C型）：上海佑科儀器儀表有限公司；真空冷凍干燥箱（Pilot5-8M型）：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料預(yù)處理及樣品溶液制備

將橘子去灰洗凈，分離出橘皮、橘肉、橘絡(luò)，分別切碎后擺在凍干盤內(nèi)真空冷凍干燥，粉碎后過篩（60目）備用。稱取2 g凍干粉末樣品，加入70%的乙醇溶液，使料液比達(dá)到 1∶10(g/mL)，60℃下，以 250 r/min振蕩2 h后，7 000 r/min離心10 min，緩慢吸取上清液，剩余殘?jiān)谕葪l件下再提一次，兩次上清液合并且定容備用，所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 測定橘子不同部位的總酚含量

1.3.2.1 繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，得到具有良好線性關(guān)系的回歸方程：Y=106.25X+0.0243，回歸系數(shù)R2=0.9909（X為沒食子酸標(biāo)液濃度，mg/mL；Y為吸光度）[22]。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of gallic acid

1.3.2.2 測定總酚含量

取25 mL容量瓶，加入樣品溶液1 mL、Na2CO3溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%）2 mL、福林酚1 mL，定容至刻度，避光反應(yīng)2 h，測765 nm處吸光度，根據(jù)公式（1）計(jì)算橘皮、橘肉、橘絡(luò)的總酚含量。

式中：P為樣品總酚含量，mg/g；C為經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的反應(yīng)液總酚濃度，mg/mL；V為反應(yīng)液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為樣品干重，g。

1.3.3 測定橘子不同部位的總黃酮含量

1.3.3.1 繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，得到線性關(guān)系良好的回歸方程：Y=10.602X+0.015 9，回歸系數(shù) R2=0.994 9（X 為蘆丁標(biāo)液濃度，mg/mL；Y 為吸光度）[9]。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of rutin

1.3.3.2 測定總黃酮含量

取10 mL容量瓶，加入樣品液2.0 mL、70%的乙醇3 mL、質(zhì)量濃度5%的NaNO2溶液0.3 mL，混勻，靜置6 min后，取質(zhì)量濃度10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL加入其中，混勻，再靜置6 min；取4%的NaOH溶液（質(zhì)量濃度）4 mL加入其中，最后用70%的乙醇定容到10 mL，混勻，12 min靜置結(jié)束后立即測510 nm處吸光度，根據(jù)公式（2）計(jì)算橘皮、橘肉、橘絡(luò)的總黃酮含量。

式中：P為樣品總黃酮含量，mg/g；C為經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的反應(yīng)液總黃酮濃度，mg/mL；V為反應(yīng)液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為樣品干重，g。

1.3.4 測定橘子不同部位的多糖含量

1.3.4.1 繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

參照文獻(xiàn)[22]，繪制苯酚-硫酸法測樣品多糖含量所用的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示。得到線性關(guān)系良好的回歸方程：Y=73.103X+0.032 1，回歸系數(shù)R2=0.994（X為葡萄糖濃度，mg/mL；Y為吸光度）。

圖3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of glucose

1.3.4.2 測定多糖含量

準(zhǔn)確稱取樣品凍干粉末300 mg于10 mL離心管，加蒸餾水定容至10 mL，混勻后水浴（85℃）并振蕩2 h，8 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至另一潔凈離心管，加 10 mL 的 Sevage試劑[正丁醇:氯仿=1∶4（體積比）]，振蕩 5 min，8 000 r/min 離心 10 min，將水相轉(zhuǎn)移到3倍體積80%的乙醇中，搖勻，靜置2 h后離心15 min（5 000 r/min），所得沉淀干燥即為粗多糖，其用蒸餾水溶解定容到25 mL，吸取1 mL定容液，按參考文獻(xiàn)[23]測吸光度，根據(jù)公式（3）計(jì)算橘皮、橘肉、橘絡(luò)的多糖含量（以葡萄糖計(jì)）。

式中：P為樣品多糖含量，mg/g；C為經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的反應(yīng)液多糖濃度，mg/mL；V為反應(yīng)液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為樣品干重，g。

1.3.5 測定DPPH自由基（DPPH·）清除率

取3支潔凈試管，分別準(zhǔn)確吸取0.5 mL樣品溶液（樣品組）、抗壞血酸溶液（陽性對照組）和蒸餾水（空白組），然后分別加入0.004%的DPPH溶液2.5 mL，輕輕混勻后于37℃避光反應(yīng)30 min，冷卻至室溫（25℃），測515 nm處吸光度，根據(jù)公式（4）計(jì)算橘子不同部位的DPPH·清除率。

式中：Ai為樣品吸光度；Aj為陽性對照吸光度；A0為空白對照吸光度。

1.3.6 測定超氧陰離子自由基（O2-·）清除率

3支空試管中分別移取0.5 mL樣品溶液（樣品組）、抗壞血酸溶液（陽性對照組）和蒸餾水（空白組），再分別加入4.0 mL的Tris-HCl緩沖液（0.2 mol/L，pH 8.2），混勻，靜置4 min，加入2滴8 mol/L鹽酸立即終止反應(yīng)，測420 nm處吸光度，根據(jù)公式（4）計(jì)算樣品的O2-·清除率。

1.3.7 測定羥基自由基（·OH）清除率

取3支空試管，分別準(zhǔn)確移取0.5 mL的樣品溶液（樣品組）、抗壞血酸溶液（陽性對照組）和蒸餾水（空白組），再分別加入2 mmol/L的水楊酸0.4 mL、6 mmol/L的 H2O2溶液 1 mL、0.15 mmol/L的 FeSO4溶液 1 mL及蒸餾水0.4 mL，混勻，37℃下水浴1 h，冷卻至室溫（25℃）后于510 nm處測吸光度，根據(jù)公式（4）計(jì)算樣品的·OH清除率。

1.3.8 測定過氧化氫（H2O2）清除率

向3支空試管中各吸取3.4 mL樣品溶液（樣品組）、抗壞血酸溶液（陽性對照組）和蒸餾水（空白組），再分別加入40 mmol/L的H2O2溶液（用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液配制）0.6 mL，混勻，測230 nm處吸光度，根據(jù)公式（4）計(jì)算樣品H2O2清除率。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0進(jìn)行相關(guān)性、顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 橘子不同部位的活性成分含量

分別對橘皮、橘肉、橘絡(luò)中的總酚、總黃酮和多糖含量進(jìn)行了測定，結(jié)果見表1。

表1 橘子不同部位中活性成分含量Table 1 The contents of active components in different parts of tangerine

如表1所示，橘子不同部位各活性成分含量均存在顯著差異（P＜0.05）。橘皮、橘肉、橘絡(luò)中總酚含量最高的是橘肉，為（10.51±0.36）mg/g，其次是橘皮，橘絡(luò)總酚含量最低，為（6.38±0.27）mg/g。橘子不同部位的總黃酮含量也有顯著差異，在（1.54±0.05）mg/g～（6.13±0.23）mg/g的范圍內(nèi)，其總黃酮含量最高是橘皮，為（6.13±0.23）mg/g，其次是橘肉，橘絡(luò)總黃酮含量最低。從表1可以看出，橘子不同部位的總黃酮含量都低于其總酚含量，這可能是由于大多數(shù)的黃酮類化合物都屬于多酚類物質(zhì)。橘皮、橘肉、橘絡(luò)中的多糖含量在（18.05±0.24）mg/g～（36.40±0.11）mg/g 的范圍內(nèi)，其中橘皮多糖含量最高，為（36.40±0.11）mg/g，其次是橘肉，橘絡(luò)多糖含量最低。橘子不同部位的多糖含量都高于其總酚和總黃酮含量，橘皮和橘肉的總酚、總黃酮和多糖含量都高于橘絡(luò)。

2.2 橘子不同部位抗氧化能力比較

各種抗氧化成分具有不同的抗氧化機(jī)理[24-25]，且橘子各部位的活性成分及含量也具有差異，所以需要綜合不同的檢測方法分析其抗氧化能力，本研究通過對 DPPH·、O2-·、·OH 和 H2O2的清除率來分析橘子不同部位的抗氧化能力，具體結(jié)果見表2。

表2 橘子不同部位的自由基清除率Table 2 Free radical scavenging rate of different parts in tangerine

由表2可知，橘子不同部位對4種自由基的清除率均存在明顯差異，這可能是由于橘子不同部位所含的抗氧化活性成分及含量不同。

DPPH·是一種穩(wěn)定性較好的自由基，被廣泛用于天然活性物質(zhì)的抗氧化能力研究[26]，由表2可見，橘皮、橘肉、橘絡(luò)的DPPH·清除率存在顯著差異（P＜0.05），其中橘皮DPPH·清除率最高，為（82.99±0.91）%，其次是橘肉和橘絡(luò)，DPPH·清除率分別為（76.60±0.73）%和（56.90±1.26）%。

O2-·是一種性質(zhì)活潑的自由基，可致衰老、機(jī)體脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞損傷，并誘發(fā)多種皮膚病、心血管疾病和癌癥等[25]，從表2可以看出，橘皮、橘肉、橘絡(luò)的O2-·清除率也有顯著差異（P＜0.05），但相比其它3種自由基的清除率來說相對較低，其中O2-·清除率最高是橘肉，為（58.27±0.98）%，其次是橘皮和橘絡(luò)，O2-·清除率分別為（49.83±0.82）%和（36.34±0.47）%。

·OH是一種氧化性極強(qiáng)的自由基，具有強(qiáng)大的得電子能力，使其對生物體有強(qiáng)毒害，常導(dǎo)致人體產(chǎn)生各種復(fù)雜疾病[25]。如表2所示，橘子不同部位·OH清除率具有一定差異，其中清除率最高的為橘肉，高達(dá)（89.83±0.96）%，其次是橘皮和橘絡(luò)，二者之間的·OH清除率差異不顯著（P＞0.05），分別為（70.00±1.62）%和（69.58±1.12）%。

H2O2也是造成人體疾病和衰老的重要原因之一，雖然從結(jié)構(gòu)看并不同于一般自由基，但其對人體的傷害與自由基類似，主要損害人體內(nèi)生物大分子[25]。由表2可以看出，橘皮、橘肉、橘絡(luò)的H2O2清除率差異顯著（P＜0.05），其中橘皮的H2O2清除率最高，為（69.61±0.75）%，其次是橘肉，H2O2清除率為（63.27±0.45）%，清除率最低的是橘絡(luò)，為（46.72±0.61）%。

2.3 橘子不同部位活性成分含量與抗氧化能力之間的相關(guān)性

通過SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對橘子不同部位活性成分含量及其 DPPH·、O2-·、·OH 和 H2O2清除率之間進(jìn)行相關(guān)性分析，所得各變量間的Pearson相關(guān)系數(shù)以及顯著性（雙側(cè)）檢驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 橘子不同部位活性成分含量與其抗氧化活性之間的相關(guān)性Table 3 The coefficients among the contents of active components and antioxidant capacity of different parts in tangerine

從表3可以看出，橘子不同部位的總酚、總黃酮和多糖含量之間都呈現(xiàn)正相關(guān)，其中多糖含量和總酚、總黃酮含量間的相關(guān)性都較高（相關(guān)系數(shù)分別為0.698和 0.933）；橘子各部位總酚含量與 DPPH·、O2-·、·OH和H2O24種自由基清除率都呈正相關(guān)，其中與O2-·清除率相關(guān)性顯著（P＜0.05，相關(guān)系數(shù)為0.999）；總黃酮含量與DPPH·、O2-·和H2O23種自由基清除率呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)分別為0.883、0.438和0.899）；橘子不同部位多糖含量與4種自由基清除率之間也都呈正相關(guān)，其中與DPPH·和H2O2清除率相關(guān)性較高（相關(guān)系數(shù)分別為0.993和0.996）；橘子4種自由基清除率之間都呈正相關(guān)，其中DPPH·和H2O2清除率相關(guān)性顯著（P＜0.05，相關(guān)系數(shù)為 0.999）。

3 結(jié)論

橘子不同部位的總酚、總黃酮和多糖含量均存在顯著差異（P＜0.05），其中總酚含量以橘肉為最高，為（10.51±0.36）mg/g，橘皮中總黃酮和多糖含量均最高，分別為（6.13±0.23）mg/g 和（36.40±0.11）mg/g，橘子各部位的多糖含量都高于其總酚含量，其總酚含量都高于其總黃酮含量，橘皮和橘肉的總酚、總黃酮和多糖含量都高于橘絡(luò)。

橘子不同部位清除各種自由基的能力都比較強(qiáng)，但也存在明顯差異，其中橘皮對DPPH·和H2O2清除率最高，分別為（82.99±0.91）%和（69.61±0.75）%，橘肉對O2-·和·OH清除率最高，分別為（58.27±0.98）%和（89.83±0.96）%。橘皮和橘肉對4種自由基清除率都高于橘絡(luò)。

相關(guān)性分析表明橘子不同部位的總酚含量、總黃酮含量及多糖含量之間都呈正相關(guān)，且橘子總酚含量、多糖含量與4種自由基清除率之間也都呈正相關(guān)，其O2-·清除率與總酚含量間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05，相關(guān)系數(shù)為0.999），總黃酮含量與DPPH·、O2-·和H2O2這3種自由基清除率之間也呈正相關(guān)。

總之，橘皮、橘肉和橘絡(luò)中都含有豐富的多酚、黃酮和多糖類物質(zhì)，且具有比較強(qiáng)的抗氧化能力，該研究可為橘子不同部位的深加工及天然抗氧化產(chǎn)品的開發(fā)提供理論參考。