蜂王幼蟲(chóng)凍干粉對(duì)PCPA失眠小鼠的改善作用

唐啟河，廖世群，王佳炫，蕭楊，陳奕霏，曹喆，田文禮，郭軍*

（1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093）

在臨床中，失眠是最常見(jiàn)的疾病之一，也是最常見(jiàn)的睡眠障礙[1]。全球的睡眠調(diào)查顯示，約有4%～22%的歐洲人、18%～23%的日本人、33%的美國(guó)人和42.5%的中國(guó)人受失眠困擾[2]。對(duì)狗、老鼠、蟑螂和蒼蠅等動(dòng)物模型的失眠研究表明，睡眠不足可能導(dǎo)致這些生物過(guò)早死亡；大量的臨床和試驗(yàn)研究都將睡眠不足與認(rèn)知功能損傷、胃腸道、免疫、代謝和循環(huán)系統(tǒng)功能障礙等健康問(wèn)題聯(lián)系在一起[3]。此外，失眠也是焦慮、抑郁、精神分裂癥和自殺等精神疾病的早期臨床指標(biāo)[4]。因此，有效地預(yù)防和治療失眠是當(dāng)今全球的研究熱點(diǎn)之一[5]。目前臨床使用的抗失眠藥物主要為化學(xué)合成的西藥，如苯二氮卓類(lèi)受體激動(dòng)劑[1]。然而，西藥的治療效果并不令人滿意，這些藥物隨著時(shí)間的推移還會(huì)產(chǎn)生副作用、依賴性和耐受性[1，6]。因此，近年來(lái)，研究人員開(kāi)始從天然的材料中尋找具有治療失眠作用的物質(zhì)，如由黃連和肉桂兩種中藥組成的制劑——交泰丸對(duì)失眠具有顯著的治療作用[1]。但現(xiàn)在報(bào)道的具有治療失眠作用的天然物質(zhì)都集中在中藥等植物類(lèi)物質(zhì)[1-2，6]，而對(duì)于其它的天然物質(zhì)還鮮有報(bào)道。

蜂王幼蟲(chóng)，又稱蜂王胎，是蜜蜂的受精卵孵化后取食新鮮的蜂王漿發(fā)育而成的[7]，是蜂王漿生產(chǎn)過(guò)程中的副產(chǎn)品[8]，也是一種重要的天然蜂產(chǎn)品。我國(guó)作為世界第一的養(yǎng)蜂大國(guó)，蜂王幼蟲(chóng)的年產(chǎn)量可達(dá)600 t左右[9]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，蜂王幼蟲(chóng)含有豐富的必需氨基酸和蛋白質(zhì)，其中粗蛋白含量占其干重的50%～60%左右，蛋白質(zhì)含量高于蜂王漿，且其還含有多種維生素和生物活性酶等成分[8，10]。隨著對(duì)蜂王幼蟲(chóng)產(chǎn)品的不斷開(kāi)發(fā)，逐漸地發(fā)現(xiàn)蜂王幼蟲(chóng)具有提高免疫力[7-8]、抗氧化[11]、延緩衰老[12]和抗疲勞[13]等保健功效。研究發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)失調(diào)會(huì)影響睡眠質(zhì)量[14]，蜂王幼蟲(chóng)是否會(huì)通過(guò)增強(qiáng)免疫力來(lái)治療失眠小鼠的睡眠作用還未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究通過(guò)對(duì)氯苯丙氨酸（p-chlorophenylalanine，PCPA）構(gòu)建失眠小鼠模型，探究飼喂蜂王幼蟲(chóng)凍干粉制劑對(duì)失眠小鼠的治療效果，以期尋找到可治療失眠的天然無(wú)副作用的新型抗失眠產(chǎn)品，為進(jìn)一步將蜂產(chǎn)品往功能食品方向研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

小鼠：昆明醫(yī)科大學(xué)。昆明種雄性小鼠30只，SPF級(jí)，體重（20±2）g，將其飼養(yǎng)于昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院動(dòng)物房?jī)?nèi)，環(huán)境溫度為室溫（25±2）℃，相對(duì)濕度為55%～65%，分籠飼養(yǎng)，正常采光。小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)7 d，期間自由攝食與飲水，水源為純凈水，飼料為實(shí)驗(yàn)鼠維持飼料。

1.1.2 材料與儀器

蜂王幼蟲(chóng)凍干粉：云南老滇凰食品有限公司；實(shí)驗(yàn)鼠維持飼料：江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司；小鼠 5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒：江蘇晶美生物科技有限公司；生理鹽水、PCPA：上海源葉生物科技有限公司。

ES2000-2電子天平：沈陽(yáng)德克天平有限公司；RT-6500酶標(biāo)儀：上海雨辰生物技術(shù)有限公司；JK23116小鼠灌胃針：北京精凱達(dá)有限公司。

PCPA注射液：稱取PCPA粉末適量，用弱堿性的生理鹽水（pH 7～8）配成質(zhì)量濃度為50 mg/mL的混懸液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠分組及處置

小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)7 d后，在第8天將小鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組、失眠模型組、低劑量蜂王幼蟲(chóng)凍干粉給藥治療組（0.1 g/kg）、中劑量蜂王幼蟲(chóng)凍干粉給藥治療組（1g/kg）和高劑量蜂王幼蟲(chóng)凍干粉給藥治療組（10g/kg），每組6只。連續(xù)2 d對(duì)失眠模型組和蜂王幼蟲(chóng)凍干粉給藥治療組小鼠腹腔注射PCPA[400 mg/（kg·d）]，空白對(duì)照組小鼠平行注射等體積的弱堿性生理鹽水。在最后一次腹腔注射PCPA混懸液24 h后，對(duì)小鼠的活動(dòng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以尋找建立失眠模型成功的證據(jù)，失眠模型包括晝夜節(jié)律喪失、興奮性增強(qiáng)、攻擊性增強(qiáng)、尿和糞便的產(chǎn)生增多、毛發(fā)散亂和暗沉以及糞便灰白色，模型建立前后用電子天平給小鼠稱重[4]。此外，通過(guò)檢測(cè)小鼠血清中5-HT含量來(lái)判斷造模是否成功，造模小鼠的血清中5-HT的相對(duì)體重含量顯著低于空白對(duì)照組，則造模小鼠被視為失眠小鼠[6]。造模成功后，每日上午9點(diǎn)～10點(diǎn)進(jìn)行灌胃給藥治療，空白對(duì)照組和失眠模型組灌胃等量去離子水，連續(xù)處理7 d，每天灌胃處理后將小鼠放回籠內(nèi)，籠內(nèi)放置鼠糧和水，保證各組小鼠能正常自由飲食。

1.2.2 樣品采集及處理

治療7 d后采用斷頭法處死小鼠，在4℃環(huán)境下立即將每只小鼠的心臟、肝、脾、肺及腎等進(jìn)行解剖并稱重，計(jì)算出小鼠體重和臟器系數(shù)[15]。收集小鼠血清并保存在-80℃?zhèn)溆?，將收集到的小鼠血清按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，測(cè)定小鼠血清中5-HT含量，計(jì)算出血清中5-HT的相對(duì)體重含量，其中血清中5-HT的相對(duì)體重含量/[pg/（mL·g）]=血清中5-HT含量（pg/mL）/小鼠體重（g）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism 8.3.0和SPSS Statistics 18軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析和作圖，P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 失眠模型的驗(yàn)證

造模后小鼠血清中5-HT的相對(duì)體重含量見(jiàn)圖1。

圖1 造模后小鼠血清中5-HT的相對(duì)體重含量Fig.1 Relative body weight content of 5-HT in serum of mice after modeling

如圖1所示，與空白對(duì)照組相比，其余4組造模小鼠血清中5-HT的相對(duì)體重含量明顯下降（P＜0.05）；在連續(xù)2 d造模后，與正常小鼠相比，4組造模小鼠的體重也都明顯下降。此外，造模后通過(guò)對(duì)小鼠行為學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)造模小鼠集中表現(xiàn)為攻擊性增強(qiáng)、毛發(fā)粗糙暗沉、警惕性變高、尿液和糞便增多、晝夜節(jié)律消失等癥狀，符合失眠模型的行為特征。從以上結(jié)果可以得知本研究中失眠小鼠模型構(gòu)建成功。

2.2 蜂王幼蟲(chóng)凍干粉對(duì)失眠小鼠的治療效果

2.2.1 行為學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

不同飼喂條件下小鼠體重變化見(jiàn)圖2。

圖2 不同飼喂條件下小鼠體重變化Fig.2 Body weight changes of mice under different feeding conditions

如圖2所示，第1天～第2天為造模處理時(shí)期，第3天造模處理結(jié)束，同時(shí)從第3天起開(kāi)始飼喂蜂王幼蟲(chóng)凍干粉，從圖2可以看出，由于造模處理，小鼠在最初3 d體重急劇下降，從第4天起，在飼喂治療7 d內(nèi)，所有飼喂蜂王幼蟲(chóng)凍干粉組小鼠的體重均開(kāi)始平穩(wěn)增長(zhǎng)，只有空白對(duì)照組體重一直保持增長(zhǎng)，未出現(xiàn)體重下降的現(xiàn)象。此外，行為學(xué)觀察表明，小鼠在治療期間，攻擊性明顯減弱、皮毛逐漸潔凈、白天睡眠增多、不易驚醒，相對(duì)于失眠模型組尿量減少，大便正常，晝夜節(jié)律恢復(fù)，睡眠時(shí)間也相應(yīng)增加。

2.2.2 蜂王幼蟲(chóng)凍干粉治療后血清中5-HT的相對(duì)體重含量測(cè)定

蜂王幼蟲(chóng)凍干粉治療后小鼠血清中5-HT的相對(duì)體重含量見(jiàn)圖3。

圖3 小鼠血清中5-HT的相對(duì)體重含量Fig.3 Relative body weight content of 5-HT in mouse serum

如圖3所示，與空白對(duì)照組相比，高、中、低劑量蜂王幼蟲(chóng)凍干粉治療組小鼠血清中5-HT的相對(duì)體重含量無(wú)明顯差異，表明經(jīng)蜂王幼蟲(chóng)凍干粉治療后可有效改善失眠小鼠的睡眠；而失眠模型組的小鼠血清中的5-HT相對(duì)體重含量與空白對(duì)照組相比呈顯著降低（P＜0.05），這一結(jié)果也充分表明失眠模型構(gòu)建成功。蜂王幼蟲(chóng)凍干粉灌胃7 d小鼠血清中5-HT的相對(duì)體重含量見(jiàn)表1。

表1 蜂王幼蟲(chóng)凍干粉灌胃7 d小鼠血清中5-HT的相對(duì)體重含量Table 1 Relative body weight content of 5-HT in serum of mice after intragastric admiistration of lyophilized powder of queen bee larvae for 7 days

從表1可以看出，高、中、低劑量蜂王幼蟲(chóng)凍干粉治療組與失眠模型組的小鼠相比，血清中的5-HT相對(duì)體重含量明顯增高（P＜0.05），充分說(shuō)明蜂王幼蟲(chóng)凍干粉對(duì)PCPA失眠小鼠有治療失眠的效果。

2.2.3 蜂王幼蟲(chóng)凍干粉治療對(duì)小鼠五臟的影響

蜂王幼蟲(chóng)凍干粉對(duì)失眠小鼠治療7 d后，小鼠的體重和器官系數(shù)，如表2所示。

表2 蜂王幼蟲(chóng)凍干粉灌胃7 d后的小鼠臟器系數(shù)Table 2 Viscera coefficient of mice fed freeze-dried powder to queen bee larvae for 7 days mg/g

由表2可知，與空白對(duì)照組相比，3個(gè)治療組的肺和腎的臟器系數(shù)并無(wú)顯著差異；失眠會(huì)造成心臟和肝器官的變重，而灌胃蜂王幼蟲(chóng)凍干粉可使這兩個(gè)器官的質(zhì)量趨于正常，尤其是灌胃高劑量蜂王幼蟲(chóng)凍干粉的小鼠，心臟和肝器官質(zhì)量降低更加顯著（P＜0.05）；與失眠模型組相比，灌胃高劑量的蜂王幼蟲(chóng)凍干粉會(huì)造成小鼠脾臟器官的質(zhì)量顯著增加（P＜0.05）。

3 討論與結(jié)論

PCPA被廣泛應(yīng)用于失眠動(dòng)物模型的建立，它是5-HT生物合成中的起始酶和限速酶—色氨酸羥化酶的選擇性和不可逆抑制劑，其會(huì)通過(guò)抑制色氨酸羥基化而阻斷5-HT的合成，可顯著降低腦內(nèi)和外周血中的5-HT含量[16-17]。而5-HT在睡眠-覺(jué)醒調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，5-HT含量降低會(huì)造成動(dòng)物失眠[18]。在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)小鼠連續(xù)2 d注射PCPA進(jìn)行失眠模型的建立，通過(guò)對(duì)血清中5-HT的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)注射過(guò)PCPA組的小鼠血清中5-HT的相對(duì)體重含量都顯著低于空白對(duì)照組的小鼠，說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)中失眠小鼠模型構(gòu)建成功。此外，通過(guò)對(duì)小鼠行為的檢測(cè)，也證實(shí)小鼠失眠模型建立成功。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，PCPA注射后，5-HT含量至少在1周內(nèi)都會(huì)保持較低水平[19]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)失眠模型小鼠連續(xù)7 d灌胃高、中、低劑量的蜂王幼蟲(chóng)凍干粉，進(jìn)一步觀察蜂王幼蟲(chóng)凍干粉對(duì)失眠的治療和改善效果。研究也表明，失眠模型組小鼠的血清中5-HT相對(duì)體重含量與空白對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），而治療后的小鼠血清中的5-HT的相對(duì)體重含量與失眠模型組相比明顯升高（P＜0.05），且3組灌胃治療組的小鼠的血清中5-HT的相對(duì)體重含量與空白對(duì)照組中小鼠已無(wú)明顯差異，這些結(jié)果充分說(shuō)明蜂王幼蟲(chóng)凍干粉對(duì)失眠小鼠具有明顯的改善作用。

實(shí)驗(yàn)中PCPA造模的失眠小鼠其心臟和肝臟質(zhì)量出現(xiàn)了明顯增加，而飼喂蜂王幼蟲(chóng)凍干粉治療后會(huì)減輕這兩個(gè)器官增加的質(zhì)量，尤其是高劑量蜂王幼蟲(chóng)凍干粉治療的小鼠心臟和肝臟質(zhì)量與失眠模型組的小鼠出現(xiàn)了顯著降低（P＜0.05），而與空白對(duì)照組已無(wú)明顯差異，表明蜂王幼蟲(chóng)凍干粉對(duì)失眠帶給小鼠器官的負(fù)面影響具有改善作用。在一項(xiàng)對(duì)失眠人群的研究中發(fā)現(xiàn)失眠會(huì)導(dǎo)致患非酒精性脂肪肝的風(fēng)險(xiǎn)增加[20]，而非酒精性脂肪肝通常表現(xiàn)為肝臟脂肪積累增多變重[21]，因此，失眠模型小鼠肝臟質(zhì)量增加可能是患非酒精性脂肪肝的前兆。在對(duì)失眠小鼠飼喂高劑量蜂王幼蟲(chóng)凍干粉后，其脾臟與其它組小鼠相比明顯變重，而脾臟是重要的免疫器官，在免疫應(yīng)答方面起著重要作用[22]。這說(shuō)明高劑量蜂王幼蟲(chóng)還會(huì)提高小鼠的免疫力，這與周瑞華等[7]的研究結(jié)果相一致。蜂王幼蟲(chóng)在整個(gè)生命階段都會(huì)一直取食蜂王漿[23]，因此，本研究中飼喂失眠小鼠的蜂王幼蟲(chóng)凍干粉中也含有蜂王漿的一些營(yíng)養(yǎng)成分，最近有研究發(fā)現(xiàn)，蜂王漿中的王漿主蛋白具有改善免疫的作用[24]，蜂王幼蟲(chóng)能增強(qiáng)小鼠免疫力很可能是王漿主蛋白發(fā)揮了重要作用。

免疫系統(tǒng)對(duì)睡眠有著重要的調(diào)節(jié)作用[14]，研究發(fā)現(xiàn)一些免疫細(xì)胞因子、褪黑素和生長(zhǎng)激素等都參與了睡眠調(diào)節(jié)，若免疫系統(tǒng)功能發(fā)生失調(diào)，這些細(xì)胞因子等就會(huì)發(fā)生失調(diào)，從而引起睡眠障礙[22，25-26]。蜂王幼蟲(chóng)凍干粉中除了含有可增強(qiáng)免疫力的王漿主蛋白，還含有蜂蛹多肽等肽類(lèi)物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)蜂蛹多肽可增強(qiáng)RAW264.7巨噬細(xì)胞的免疫活性[27]，因此，蜂王幼蟲(chóng)可改善失眠小鼠的睡眠作用，很可能是通過(guò)蜂王幼蟲(chóng)凍干粉中的活性蛋白（如王漿主蛋白）和蜂蛹多肽等肽類(lèi)物質(zhì)的綜合作用提高和改善了小鼠的免疫力，從而達(dá)到治療失眠的作用。另外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)腸道微生物受到睡眠質(zhì)量影響，睡眠不足會(huì)改變腸道正常菌群[28]，而通過(guò)調(diào)節(jié)失眠小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)和組成，來(lái)增加腸道菌群中有益菌群的比例，可有效改善小鼠的睡眠作用[29]，蜂王幼蟲(chóng)凍干粉可能也會(huì)通過(guò)改變失眠小鼠的腸道菌群來(lái)改善睡眠作用，但還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)蜂王幼蟲(chóng)具有改善PCPA失眠小鼠的作用，蜂王幼蟲(chóng)凍干粉改善失眠小鼠的睡眠作用可能是通過(guò)提高小鼠免疫力等機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)的，但蜂王幼蟲(chóng)凍干粉改善失眠小鼠的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。