廈門地區(qū)兒童流感嗜血桿菌流行特點(diǎn)及耐藥性分析

王金輝 陳 雷 黃美戀 莊鴻源

廈門市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建廈門 361006

流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae，HI）是引起兒童呼吸道感染的常見病原菌，是兒童社區(qū)獲得性肺炎的重要病原體，可引起肺炎、支氣管炎、化膿性腦膜炎、膿毒血癥等多種疾病，嚴(yán)重威脅兒童的身體健康[1]。近年來，臨床抗生素的廣泛使用，使流感嗜血桿菌的耐藥性逐年增加，臨床治療難度越來越大[2]。本課題組分析了2019年1—12月廈門市兒童醫(yī)院呼吸道感染就診患兒的流感嗜血桿菌流行情況，并對(duì)痰液標(biāo)本培養(yǎng)分離出的流感嗜血桿菌的耐藥情況及β-內(nèi)酰胺酶基因進(jìn)行分型，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2019年1—12月廈門市兒童醫(yī)院呼吸道感染患兒的痰液標(biāo)本31 163份，經(jīng)培養(yǎng)后使用德國BRUKER MALDI TOP微生物快速鑒定系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定。

1.2 主要儀器和試劑

微生物快速鑒定系統(tǒng)（德國BRUKER公司，BRUKER MALDI TOP）；嗜血桿菌屬培養(yǎng)基（HTM）平板（美國BD公司）；藥敏試驗(yàn)鑒定儀（法國梅里埃公司，VITEK 2 Compact）；頭孢硝噻吩紙片（中國龐通醫(yī)療公司）；PCR擴(kuò)增儀（美國ABI公司7500型）。

1.3 β-內(nèi)酰胺酶表型檢測(cè)

用頭孢硝噻吩紙片法，按照試劑說明書操作：用無菌去離子水浸濕紙片，沾取少量待測(cè)菌菌落到紙片表面。紅色出現(xiàn)為陽性結(jié)果，即細(xì)菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶；1 h后無顏色改變?yōu)殛幮?，即?xì)菌不產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶。

1.4 β-內(nèi)酰胺酶基因分型

采用煮沸法提取流感嗜血桿菌DNA：取流感嗜血桿菌混勻于0.5 ml生理鹽水中，濃度高于1麥?zhǔn)蠞岫葐挝唬瑧乙河?00℃ 10 min，冷卻后13 800 g 離心1 min，取上清液，-20℃保存。流感嗜血桿菌β-內(nèi)酰胺酶TEM-1和ROB-1基因引物、PCR擴(kuò)增條件和β-內(nèi)酰胺酶基因分型方法見參考文獻(xiàn)[3-4]。引物由上海生工生物工程公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 50 μl，包括 10 mmol/L dNTP 4 μl，10×buffer 5 μl，Taq DNA 聚合酶 1 μl，上、下游引物（20 μmol/L）各 1 μl，DNA 模板 2.5 μl，ddH2O 35.5 μl。擴(kuò)增條件：94℃ 10 min；94℃ 45 s，54℃ 45 s，72℃ 45 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果。部分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GeneBank數(shù)據(jù)庫中網(wǎng)上查詢比較，進(jìn)行Blast比對(duì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以%表示，組間差異使用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用WHONET 5.5軟件進(jìn)行細(xì)菌耐藥性分析。

2 結(jié)果

2.1 流感嗜血桿菌檢出率及不同年齡段的分布情況

2019年共收到31 163份痰標(biāo)本，經(jīng)培養(yǎng)后，其中3491份標(biāo)本陽性。經(jīng)鑒定檢出HI陽性標(biāo)本841株，占陽性標(biāo)本的24.09%。不同的年齡段分布情況如下：＜1歲的嬰幼兒占比28.15%，幼兒期（1～＜3歲）占28.10%；學(xué)齡前期（3～7歲）占18.82%；學(xué)齡期（＞7歲）占5.46%，見表1。

表1 2019年兒童痰液標(biāo)本流感嗜血桿菌的檢出率及不同年齡段的分布情況

2.2 流感嗜血桿菌的季節(jié)分布情況

2019年共841株HI臨床株，第一季度檢出364株（43.28%），第二季度檢出303株（36.03%），第三季度檢出61株（7.25%），第四季度檢出113株（13.44%）。

2.3 流感嗜血桿菌的耐藥情況分析

2019年檢出流感嗜血桿菌的對(duì)抗菌藥物的耐藥情況見表2、圖1，841株HI陽性菌株的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。其中復(fù)方磺胺甲噁唑的耐藥率最高為74.78%，氯霉素的耐藥率最低為3.18%。同時(shí)課題組查閱了www.chinets.com網(wǎng)站數(shù)據(jù)，將2019年廈門市兒童醫(yī)院流感嗜血桿菌的耐藥情況與同年CHINET公布的流感嗜血桿菌（兒童）數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，除氨芐西林/舒巴坦組外，各組的耐藥率與CHINET的數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而氨芐西林/舒巴坦的耐藥率為3.57%，與2019年CHINET數(shù)據(jù)（32.8%）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 2019年流感嗜血桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥情況且與2019年CHINET數(shù)據(jù)比較

圖1 2019年廈門市兒童醫(yī)院流感嗜血桿菌耐藥情況與2019年CHINET數(shù)據(jù)比較

2.4 流感嗜血桿菌β-內(nèi)酰胺酶表型結(jié)果及基因分析

841株流感嗜血桿菌β-內(nèi)酰胺酶檢出率為41.85%（352/841），檢測(cè)到β-內(nèi)酰胺酶基因與頭孢硝噻吩紙片法結(jié)果一致。β-內(nèi)酰胺酶的基因型均為TEM-1型，見圖2。

圖2 流感嗜血桿菌TEM-1型和ROB-1型內(nèi)酰胺酶基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

3 討論

流感嗜血桿菌是兒童發(fā)生社區(qū)獲得性肺炎的重要病原體，基于鑒定條件及耐藥機(jī)制的復(fù)雜性，HI的分布和耐藥性具有地域性差異[5-6]。本課題組對(duì)2019年廈門市兒童醫(yī)院呼吸道感染患兒的痰液標(biāo)本分離出的HI進(jìn)行分析，HI的檢出率占總檢出率的24.09%，2019年CHINET官網(wǎng)（www.chinets.com）的數(shù)據(jù)顯示在101 714份呼吸道標(biāo)本中，HI在的分離率為8.92%，我院2019年的分離率遠(yuǎn)高于CHINET統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[7]。兒童的呼吸道標(biāo)本中，分離出的細(xì)菌種類與成人細(xì)菌種類分布不同，兒童以肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、奈瑟卡他菌為主[8]。本課題組統(tǒng)計(jì)2019年HI高于CHINET的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，這與兒童醫(yī)院專科特點(diǎn)相關(guān)，符合兒童呼吸道細(xì)菌陽性分布的特點(diǎn)[9]。

在不同年齡分布情況顯示，＜3歲幼兒的HI陽性的檢出率高于3歲以上兒童的檢出率，而≤1歲和1～3歲年齡組的檢出率相似，分別為28.15%和28.10%，高于其他年齡段，這可能由于幼兒期免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育健全，肺清除能力不足，使流感嗜血桿菌的定植概率增加所致[10]。季節(jié)分布結(jié)果顯示一、二季度流感嗜血桿菌的檢出率高于三、四季度，與汪倩鈺等[11]報(bào)道的2016—2018年兒童呼吸道感染病原譜中的結(jié)果相一致。廈門地區(qū)一、二季度氣溫相對(duì)較低且潮濕，冷熱交替，且早晚溫差大，因此容易出現(xiàn)流感嗜血桿菌感染相關(guān)的呼吸系統(tǒng)疾病。

兒童革蘭陰性桿菌感染的主要菌群是流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌。流感嗜血桿菌的藥敏試驗(yàn)顯示對(duì)復(fù)方新諾明、氨芐西林的耐藥率較高，這一點(diǎn)與陳姍姍等[12]報(bào)道的山西省兒童醫(yī)院流感嗜血桿菌的分布及耐藥情況分析相一致。本課題組對(duì)流感嗜血桿菌的耐藥性進(jìn)行了分析，本研究藥敏結(jié)果顯示，HI對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑的耐藥率最高為74.78%，略高于CHINET的數(shù)據(jù)（70.4%），其耐藥機(jī)制主要是染色體介導(dǎo)的二氫葉酸還原酶過量產(chǎn)生，導(dǎo)致與甲基芐氧嘧啶的結(jié)合減少所致[13]。對(duì)氨芐西林的耐藥率為62.34%，低于2019年CHINET的數(shù)據(jù)（71.1%）；而氨芐西林和阿莫西林是治療感染常用的藥物，但由于HI的耐藥率逐年升高，不宜作為臨床經(jīng)驗(yàn)用藥[14]。

本課題組對(duì)流感嗜血桿菌的β-內(nèi)酰胺酶的檢出率為41.85%，提示本地區(qū)產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是導(dǎo)致HI對(duì)氨芐西林耐藥的主要機(jī)制。同時(shí)對(duì)其基因型進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)絕大部分是TEM-1型，水解氨芐西林使其失活，此結(jié)果與秦惠宏等[15]的報(bào)道一致。本課題組發(fā)現(xiàn)氨芐西林/舒巴坦的耐藥率我院為3.57%，遠(yuǎn)低于CHINET的數(shù)據(jù)（32.8%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。氨芐西林/舒巴坦聯(lián)合應(yīng)用，不僅可保護(hù)β-內(nèi)酰胺類抗生素（氨芐西林）免收酶的水解破壞，增強(qiáng)其抗菌作用，而且還擴(kuò)大了抗菌譜，增強(qiáng)了抗菌活性，具有廣譜、耐酶的特點(diǎn)。因此臨床可選擇氨芐西林/舒巴坦治療因流感嗜血桿菌引起的呼吸道感染。我院的結(jié)果與CHINET的數(shù)據(jù)有差異，可能有兩方面原因：一是CHINET數(shù)據(jù)包括全國不同地區(qū)綜合醫(yī)院和兒童醫(yī)院的數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)來源寬泛；二是細(xì)菌耐藥的分布具有年齡和地域的差異，在廈門地區(qū)兒童HI對(duì)氨芐西林/舒巴坦的耐藥率低，具有地域特色[16]。

綜上所述，HI是兒童呼吸道感染的重要病原體，3歲以下的嬰幼兒是易感人群，感染率與氣候相關(guān)，冬季是高發(fā)季節(jié)，且產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的HI比例較高，應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果選擇藥物進(jìn)行治療。