HPLC法測不同中藥中蛇床子素的含量

趙新紅，張作華，范 珊，侯雪芹，齊永秀，李 珂

（山東第一醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，山東 泰安 271000）

蛇床子、獨活等中藥材均含有蛇床子素的成分[1-2]，蛇床子素是香豆素類成分中最主要藥效成分，具有鎮(zhèn)靜、抗炎、免疫調(diào)節(jié)，保護神經(jīng)，抗骨質(zhì)疏松，保護心血管，保護腎臟的功效，在現(xiàn)代藥理學(xué)中的作用尤為顯著[3]。

1 儀器與材料

Waters e2695 高效液相色譜儀（美國 Waters 公司），KQ-500E 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），F(xiàn)R224CN 型電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司），凱特離心機（鹽城凱特實驗儀器有限公司），GM 0.33A 隔膜真空泵（天津市津騰實驗設(shè)備有限公司）

甲醇（美國天地高純?nèi)軇┯邢薰荆?，水（杭州娃哈哈集團有限公司），蛇床子素對照品（批號 17080510，含量質(zhì)量分?jǐn)?shù) 99.81%）。

蛇床子[Cnidium monnieri（L.）Cuss]、獨活（Angelica pubescensMaxim.f.biserrataShan et Yuan）、白芷[Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.）Benth.et Hook.f.ex Franch.et Sav]等藥店購買，產(chǎn)地四川，菟絲子（Cuscuta chinensisLam.）、白前[Cynanchum stauntonii（Decne.）Schltr.ex Levl]等藥店購買，產(chǎn)地安徽。以上中藥均由山東第一醫(yī)科大學(xué)中藥學(xué)教研室曲曉蘭副教授鑒定均符合《中華人民共和國藥典》2020 年版（一部）項下有關(guān)規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備

將適量蛇床子藥材于研缽內(nèi)研磨成粉末，稱取 5 g 置于 50 mL 棕色量瓶中，甲醇定容至刻度，超聲處理 30 min，室溫冷卻，甲醇補足至刻度，靜置片刻，于 3 000 r·min-1離心 5 min，將上清液經(jīng) 0.45 μm 微孔濾膜濾過，濾去初濾液 2.0～3.0 mL，取續(xù)濾液即得，備用。

2.1.2 對照品溶液的制備

取蛇床子素對照品適量，加甲醇定容至 25 mL 棕色量瓶中，搖勻，制得質(zhì)量濃度為 2.016 g·L-1的蛇床子素儲備液。

2.2 色譜條件

色譜柱為 Aglient C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-體積分?jǐn)?shù) 0.05% 磷酸（體積比 70:30）。檢測波長為 322 nm，流速為 1.0 mL·min-1，進樣量為 10 μL，柱溫為 30 ℃[4]。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗

分別將甲醇（溶劑）、蛇床子素對照品溶液、蛇床子供試品溶液，按照“2.2”條色譜條件進樣，測得色譜圖。由圖1 可知，蛇床子素的保留時間為 11.9 min。供試品溶液主峰的保留時間與蛇床子素對照品的色譜峰保留時間一致。以蛇床子素色譜峰計算理論塔板數(shù)為 1 600，與相鄰組分分離較好。

Fig.1 HPLC of blank solvent (A), reference solution (B) and test solution (C)圖1 空白溶劑（A）、對照品溶液（B）和供試品溶液（C）的高效液相色譜圖

2.3.2 線性與范圍

分別精密量取蛇床子素對照品儲備液 0.496、2.73、4.96、7.19和9.43 mL 置 10 mL 量瓶內(nèi)，并用甲醇定容至刻度，搖晃均勻，即可得到質(zhì)量濃度為 0.100、0.550、1.00、1.45 和 1.90 g·L-1的蛇床子素對照品溶液，按“2.2”條色譜條件各質(zhì)量濃度對照品溶液分別進樣 3 次，取平均值，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（ρ，g·L-1）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。所得回歸方程為：A=3.0 × 107ρ- 3.0 × 105，r= 0.999 2。結(jié)果表明，蛇床子素在質(zhì)量濃度為 0.100～1.90 g·L-1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗

取“2.1.1”項下供試品溶液，按“2.2”條色譜條件，進樣量為 10 μL，重復(fù)進樣 6 次，記錄色譜圖，記錄蛇床子素的峰面積。計算蛇床子素的 RSD 為 0.36%，小于 3.0%，表明該方法的精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗

按“2.1.1”項下方法新配制蛇床子供試品溶液，室溫下放置，分別在 0、2、4、6、8、10、12 h等不同時間點分別進樣，記錄蛇床子素的峰面積。計算蛇床子素 RSD 為 0.45%，小于 3.0%，結(jié)果表明本蛇床子供試品溶液在 12 h 內(nèi)保持穩(wěn)定，穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗

取蛇床子粉末 6 份，分別按“2.1.1”項下實驗方法配制溶液，按“2.2”項下色譜條件進行進樣分析，記錄蛇床子素的峰面積。計算蛇床子素的 RSD 為 0.28%，小于 3.0%，重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗

按“2.1.1”項下方法配制蛇床子溶液 3 份，分別按 80%、100%、120% 高中低 3 個不同質(zhì)量濃度精密量取對照品儲備液加入其中，甲醇定容至刻度，搖晃均勻，精密量取 1 mL 于進樣瓶進樣，進樣量 10 μL，每種質(zhì)量濃度進樣 3 次。每份按照“2.2”項下色譜條件進行測定。分別記錄其色譜圖峰面積。結(jié)果見表1。

Table 1 Recovery test results of osthol in samples表1 樣品中蛇床子素加樣回收試驗結(jié)果

2.3.7 樣品含量測定

取菟絲子、獨活、白芷、白前等中藥藥材，分別將其置于研缽內(nèi)研成細(xì)粉，按“2.1.1”項下方法制備供試溶液，分別按“2.2”項下色譜條件取 3 份進行測定[5]，結(jié)果見表2。

Table 2 Determination results of osthol in different Chinese medicinal materials（mg·g-1）表2 不同中藥材中蛇床子素含量測定結(jié)果（mg·g-1）

3 討論

通過在實驗過程中對高效液相色譜條件的不斷優(yōu)化，使蛇床子素的出峰時間和分離效果較好，本實驗首先通過對蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)品溶液進樣，進行梯度洗脫以確定試驗中流動相的大體比例，后采用等度洗脫對流動相的比例進行調(diào)整，進一步選擇最適合于該試驗的流動相比例，來達到優(yōu)化的目的，使實驗的結(jié)果更加的可靠。

實驗中以甲醇作為有機相，調(diào)試水相來使色譜峰分的更好，分別嘗試不同體積分?jǐn)?shù)的甲酸、冰醋酸、磷酸等不同流動相作為該實驗的水相[6-7]，進樣蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)品溶液得到標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，從色譜圖比較來看，當(dāng)水相為 0.05% 磷酸水溶液的時候，色譜圖中蛇床子素的所出的峰更加穩(wěn)定分離效果更好，與其他峰的干擾小。

關(guān)于蛇床子、獨活等中藥中蛇床子素的提?。骸吨腥A人民共和國藥典》2015 版（一部）均是采用無水乙醇溶解、超聲處理[8]，其提取方法簡便、快速，但無水乙醇極易揮發(fā)，導(dǎo)致所配制的溶液濃度極不穩(wěn)定，導(dǎo)致耗時、耗材。有文獻采用薄層色譜法測蛇床子素的含量[9]，手動操作比較多，人為的影響因素大，重現(xiàn)性不好。本實驗在查閱以及研究文獻的基礎(chǔ)上，采用甲醇溶解、超聲，提取方法同于《中華人民共和國藥典》2015 年版，提取效果相似，配制的溶液較為穩(wěn)定。通過 e2695 高效液相色譜儀自動進樣測定、消除人為因素，且方法簡便快捷，重現(xiàn)性較好。