原花青素-明膠復(fù)合物為囊材的川芎和香附揮發(fā)油微囊的制備

李雪慧，徐 暉，孟 佳，賈衛(wèi)茹，高啟棟

（1.沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 本溪 117004；2.遼寧省基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，遼寧 沈陽 110101；3.遼寧省認(rèn)證審評院，遼寧 沈陽 110036）

明膠（gelatin）是膠原蛋白水解產(chǎn)物，具有良好的生物相容性和生物可降解性，廣泛用于膠囊劑、栓劑和半固體制劑以及注射劑輔料等[1-4]。明膠或明膠-聚陰離子（如阿拉伯膠、羥丙甲纖維素酞酸酯等）可通過單凝聚或復(fù)凝聚法制備載藥微囊（microcapsules，MCs）[5]。由于凝聚為可逆的物理過程，需用甲醛或戊二醛等與明膠發(fā)生氨醛縮合反應(yīng)，從而交聯(lián)固化微囊，但游離的醛或其降解物會引起顯著的細(xì)胞毒性，極大限制這種經(jīng)典的微囊化方法在藥物遞送中的應(yīng)用[6]。原花青素（proanthocyanidins，PC）是一種自然界廣泛存在（如蔬菜、水果、種皮等）的多酚類化合物，其酚羥基可與帶有氫鍵供體的分子通過氫鍵相互作用形成復(fù)合物，這提示是否可將 PC 作為交聯(lián)劑用以固化明膠微囊[7]。

本文作者研究了 PC-明膠復(fù)合物的形成，以川芎揮發(fā)油和香附揮發(fā)油為模型藥物，采用明膠-阿拉伯膠復(fù)凝聚法制備川芎和香附揮發(fā)油微囊（芎附微囊），探討用 PC 作為交聯(lián)劑固化載藥微囊的應(yīng)用可行性。川芎和香附揮發(fā)油是從川芎和香附的干燥根莖中提取的揮發(fā)油，具有活血止氣、祛風(fēng)止痛的功能[8-10]。川芎和香附揮發(fā)油易揮發(fā)、胃腸道刺激性大、穩(wěn)定性差，利用微囊化技術(shù)將其包裹在高分子囊殼中，以期實現(xiàn)液體藥物固體化、減少胃腸道刺激和增加穩(wěn)定性的目標(biāo)[11]。

1 儀器與材料

T18 Basic 高速分散機（德國 IKA 公司），OS20-S 頂置式攪拌器（大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司），BA300Pol 偏光顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司），LGJ-10E 冷凍干燥機（四環(huán)福瑞科儀科技（北京）發(fā)展有限公司），高效液相色譜儀（配備 2400 紫外檢測器和 2130輸液泵，日本 Hitachi 公司），傅立葉變換紅外光譜分析儀（日本 Shimadu 公司），差示掃描量熱儀（瑞士Mettler Toledo 公司），S-3400 掃描電子顯微鏡（日本 Hitachi 公司）。

2 方法

2.1 PC-明膠復(fù)合物的制備

稱取 0.3 g 明膠，用適量水溶脹，加水使終體積為 100 mL，50 ℃ 水浴保溫溶解。冰浴下，將質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1% 的 PC 溶液 3 mL 滴入明膠溶液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng) 1 h，取混懸液適量，用光學(xué)顯微鏡觀察其形態(tài)。靜置待分層后棄去上清，蒸餾水洗 3 次，-20 ℃ 預(yù)凍 12 h，凍干。

2.2 掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope, SEM）觀察

取適量凍干的 PC-明膠復(fù)合物，用導(dǎo)電膠固定在樣品支架上，噴金，SEM 觀察其表面形貌。

2.3 傅立葉變換紅外光譜（fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）分析

取明膠、PC、PC-明膠物理混合物和 PC-明膠復(fù)合物，分別與光譜純溴化鉀置于瑪瑙研缽研磨，充分混合后，壓片，置樣品架上，測試。掃描波數(shù)范圍：4 000～400 cm-1，分辨率：4 cm-1。

2.4 差示掃描量熱（differential scanning calorimeter, DSC）分析

取適量明膠、PC、PC-明膠物理混合物和 PC-明膠復(fù)合物置于氧化鋁坩堝中，以空白坩堝為參比，氮氣氣氛下測定。設(shè)定溫度范圍為 20～250 ℃，升溫速率為 10 ℃·min-1。

2.5 川芎和香附揮發(fā)油乳劑的制備

以一定濃度的阿拉伯膠溶液為水相，川芎揮發(fā)油、香附揮發(fā)油、大豆油（體積比1:1:2）混合物為油相，將一定體積的油相快速加入到 5 mL 水相中，5 000 r·min-1高速剪切乳化 90 s，制得乳劑。

2.6 川芎和香附揮發(fā)油微囊的制備

2.6.1 以 PC 為交聯(lián)劑制備

實際教學(xué)中，教師更多依賴自己的實踐性知識，教師的實踐性知識是建立在個人經(jīng)驗和前人經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，因此教師會通過對不同表征形式的吸收、借鑒來生成自己的實踐性知識，實現(xiàn)專業(yè)發(fā)展。教師的實踐性知識的表征形式是具體多樣的，教師們會彼此交流教學(xué)心得，一個教研室的老教師會傳授給新教師有用的教學(xué)經(jīng)驗，教師在教學(xué)過程中也會通過解決實際問題來積累經(jīng)驗。教師們各自掌握著“一套”管用的方法，有各自信奉的實踐性知識，表現(xiàn)出不同的表征形式。有些教師擅長通過敘事、案例來管理教導(dǎo)學(xué)生，有些教師習(xí)慣借用意象、隱喻等解釋內(nèi)容。通過表征形式的交流使得實踐性知識在教師群體間傳遞，可以促進教師個人性知識的形成，早日實現(xiàn)專業(yè)發(fā)展。

將上述乳劑轉(zhuǎn)移至燒杯中，50 ℃ 水浴，500 r·min-1機械攪拌，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù) 15% 明膠溶液（50 ℃）5 mL，滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù) 10% 醋酸溶液調(diào)節(jié)體系 pH 值至 3.8，調(diào)節(jié)至合適的攪拌速度，加適量蒸餾水稀釋，冷卻至室溫后冰浴 1 h。補加適量 4 ℃ 蒸餾水使總體積至 250 mL，調(diào)節(jié)攪拌速度至 400 r·min-1，滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1% PC 溶液 7.5 mL，繼續(xù)攪拌 1 h。吸取適量微囊混懸液，光學(xué)顯微鏡下觀察微囊的形態(tài)，用顯微鏡配置的軟件測量不少于 200 個微囊粒徑，計算微囊粒徑。微囊混懸液靜置后棄去上清液，蒸餾水洗 3 次，-20 ℃ 預(yù)凍 12 h，凍干，得干燥微囊（芎附微囊）。

2.6.2 以甲醛為交聯(lián)劑制備

制備工藝相同條件下，將交聯(lián)劑更換為體積分?jǐn)?shù) 37% 甲醛溶液（375 μL，用蒸餾水稀釋一倍），攪拌 15 min，用質(zhì)量分?jǐn)?shù) 20% 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH 至 8.0～9.0，繼續(xù)攪拌 20 min 得芎附微囊混懸液，凍干得干燥微囊。

2.7 微囊的形態(tài)變化

取芎附微囊混懸液 2 mL，加入 100 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1% 聚山梨酯-80 的磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.8），37 ℃ 水浴保溫，100 r·min-1磁力攪拌，分別于 0.25、2、4 h 取樣置光學(xué)顯微鏡下觀察微囊的形態(tài)變化。

2.8 體外藥物釋放

取芎附微囊（粒徑：(79.4 ± 5.0) μm）混懸液或芎附乳劑 2 mL，置于透析袋（截留分子量8 000）中。將透析袋置于 100 mL 含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1% 聚山梨酯-8 0的磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.8）中，100 r·min-1磁力攪拌。分別于 0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12、18、24 h 取釋放介質(zhì)5 mL，同時補加等體積的新鮮釋放介質(zhì)。樣品溶液經(jīng) 0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液用高效液相色譜測定藁本內(nèi)酯（作為川芎揮發(fā)油的指標(biāo)成分）和α-香附酮（作為香附揮發(fā)油的指標(biāo)成分）。另取芎附微囊混懸液或芎附乳劑 2 mL，置 100 mL 量瓶中，微囊混懸液中加入少量胃蛋白酶溶液消解，用釋放介質(zhì)稀釋至刻度，同法測定指標(biāo)成分的含量。

藁本內(nèi)酯測定的色譜條件：北京迪馬 C18（200 mm × 4.6 mm，5 μm）色譜柱，50 mmol·L-1無水乙酸鈉（乙酸調(diào) pH 4.0）-乙腈（體積比 50:50）為流動相，檢測波長 281 nm，流速 1 mL·min-1，柱溫為室溫。

α-香附酮測定的色譜條件：北京迪馬 C18（200 mm × 4.6 mm，5 μm）色譜柱，乙腈-水（體積比65:35）為流動相，檢測波長 250 nm，流速 1 mL·min-1，柱溫為室溫。

3 結(jié)果

3.1 PC-明膠復(fù)合物的形成

將 PC 溶液沿內(nèi)壁緩慢加入到明膠溶液后，PC-明膠復(fù)合物在 PC 與明膠接觸的瞬間以絮狀沉淀的形式析出（圖1A）。PC 分子向明膠溶液內(nèi)部擴散，PC-明膠復(fù)合物隨之不斷產(chǎn)生?；鞈乙褐霉鈱W(xué)顯微鏡下觀察，可見大量大小不均的絮狀顆粒（圖1B）。

由 PC-明膠復(fù)合物在 SEM 下的觀察結(jié)果可知（圖1C），表面有大小不同的凹陷，可能是樣品在凍干的過程中發(fā)生了塌陷。

為了研究 PC 交聯(lián)明膠的作用機制，對明膠、PC、明膠-PC物理混合物以及明膠-PC 復(fù)合物進行紅外光譜分析（圖1D）。明膠的伯胺基峰在 1 629.98 cm-1處，3 425.38 cm-1峰歸屬于明膠羧酸基團的氧氫伸縮振動；PC 羥基峰在 3 382.94 cm-1處，1 611.31 cm-1和 1 517.87 cm-1峰歸屬為 PC 苯環(huán)骨架振動。明膠-PC 物理混合物沒有出現(xiàn)明膠的特征峰，原因可能是 PC 特征峰強度較明膠大，且二者特征峰峰位相差不多，明膠的特征峰被掩蓋。明膠-PC 復(fù)合物中，PC 酚羥基峰 3 382.94 cm-1紅移至 3 305.92 cm-1；明膠氨基峰 1 629.98 cm-1藍移至 1 652.02 cm-1，且強度明顯增大。結(jié)果顯示，明膠與 PC 形成復(fù)合物后二者之間存在氫鍵作用。

明膠和 PC-明膠物理混合物的 DSC 行為基本一致（圖1E），在 100 ℃ 處有一寬鈍峰，峰歸屬為明膠的結(jié)合水吸熱氣化；222 ℃ 為明膠的熔點峰，PC 與明膠形成復(fù)合物之后消失。

Fig.1 The characterizations of PC-gelatin complex圖1 PC-明膠復(fù)合物的表征

3.2 芎附微囊的制備

3.2.1 阿拉伯膠濃度對乳滴粒徑的影響

采用不同濃度阿拉伯膠溶液所制得乳劑的粒徑（表1），隨著阿拉伯膠濃度增加，乳劑外觀呈均勻的乳白色，乳滴粒徑減?。粷舛却笥?15% 時，粒徑減小幅度并不明顯，但體系的黏性增大，不利于后續(xù)微囊的制備，故選擇阿拉伯膠濃度為 15%。

Table 1 Effect of gum arabic concentration on particle size of emulsion drops.表1 阿拉伯膠濃度對乳滴粒徑的影響

3.2.2 制備工藝對微囊質(zhì)量的影響

復(fù)凝聚法制得的芎附微囊懸液外觀呈均勻黃色，靜置后固化微囊緩慢沉降。顯微鏡下觀察，可見微囊呈規(guī)則的球形或類球形，囊內(nèi)包裹大量的小油滴（圖2）。實驗考察了顯著影響微囊性質(zhì)的處方和工藝條件，包括蒸餾水體積、攪拌速度和囊心體積對芎附微囊的形態(tài)和粒徑的影響（表2）。體系中加入 90 mL 蒸餾水稀釋，較加入 60 mL 和 120 mL 微囊粒徑分布范圍跨度小，平均粒徑較小。攪拌速度對微囊粒徑幾乎沒有影響，外觀均圓整、未出現(xiàn)黏連。囊心體積分別為 0.9、1.1、1.3 mL時，制得的微囊平均粒徑相差不大；囊心體積為 1.3 mL 時，所得微囊外觀不規(guī)則；囊心體積為 0.9 mL較 1.1 mL 粒徑范圍小。

Fig.2 Typical micrographs of Chuanxiong and Cyperi volatile oil microcapsules (scale bar:100 μm)圖2 典型的芎附微囊的顯微照片（比例尺：100 μm）

Table 2 The morphology of MCs under different ratios of phase volume and dilution volume表2 明膠和阿拉伯膠凝聚時的濃度對微囊質(zhì)量的影響

3.3 體外藥物釋放

由芎附微囊和芎附乳劑的體外釋放結(jié)果可知（圖3），川芎揮發(fā)油和香附揮發(fā)油體外釋放行為基本一致，芎附乳劑釋藥迅速，2 h 時已基本釋放完全；芎附微囊在體外有較好的緩釋效果，釋放曲線前部分斜率大，釋藥較為迅速，前 6 h 的累積釋藥量已超過 50%，后期釋放緩慢，18 h 基本釋放完全。

Fig.3 The ligustilide (A) and α-cyperone (B) dissolution profiles of Chuanxiong and Cyperi volatile oil emulsion and MCs (n=5)圖3 芎附乳劑、微囊中藁本內(nèi)酯（A）和α-香附酮（B）的體外釋放曲線（n=5）

3.4 芎附微囊在體外釋放介質(zhì)中的形態(tài)變化

以甲醛和 PC 分別作為交聯(lián)劑制備微囊考察其體外釋放過程中的形態(tài)變化（圖4）。甲醛較 PC分子量小，交聯(lián)作用能夠深入微囊內(nèi)部，在釋放過程中微囊形態(tài)幾乎沒有變化，4 h 出現(xiàn)開裂現(xiàn)象。PC 作交聯(lián)劑的微囊在體外釋放介質(zhì)中的行為可分為吸水脹大（圖4A）、囊殼破裂（圖4B）和內(nèi)容物泄漏（圖4C）三個階段。吸水溶脹是明膠的固有性質(zhì)，芎附微囊與體外釋放介質(zhì)接觸后，水逐漸進入微囊內(nèi)部，微囊粒徑明顯增大；隨吸水體積增加，囊殼較薄弱部位出現(xiàn)破裂，內(nèi)容物從囊殼缺口泄漏，油滴和囊心未交聯(lián)的明膠及阿拉伯膠由此分散到釋放介質(zhì)中，缺口增大，進而導(dǎo)致釋放速率增快。囊殼在釋放較為完全后，由于囊內(nèi)缺少內(nèi)容物支撐，可呈凹陷或折疊狀態(tài)。

Fig.4 The morphology of Chuanxiong and Cyperi volatile oil MCs in dissolution medium at different times(scale bar:100 μm)圖4 芎附微囊在體外釋放介質(zhì)中的形態(tài)變化（比例尺：100 μm）

4 討論

明膠是兩性電解質(zhì)，分子中含有大量-NH2和-COOH，通過調(diào)節(jié)溶液的 pH 可使明膠帶正電或負(fù)電；阿拉伯膠只含有-COOH，在水溶液中始終帶負(fù)電。當(dāng)溶液的 pH 小于明膠等電點時，明膠帶正電，分子中的-NH2以-NH3+的形式存在，可與阿拉伯膠的-COO-靜電作用力吸引從而形成凝聚物（圖5A）。氫鍵是一種存在于分子內(nèi)或分子間弱于共價鍵但強于范德華力的作用力，由極性很強的 X-H 鍵上的 H 與另一個（同個或者不同分子中）鍵上電負(fù)性很強且原子半徑很小的原子（如 F、N、O 等）的孤對電子之間相互作用形成。FTIR 分析結(jié)果可以看出，PC 的酚羥基提供H 受體，明膠的氨基提供孤對電子，從而形成氫鍵（圖5B）。PC 交聯(lián)的明膠在 222.0 ℃ 的吸熱峰（圖1E）消失，結(jié)合 FTIR 分析結(jié)果，PC 與明膠形成分子間氫鍵，限制了明膠分子鏈的移動，使明膠的熔點升高。

Fig.5 The diagram of complex coacervation of gelatin and gum acacia (A).The diagram of gelatin crosslinked with PC (B)圖5 明膠和阿拉伯膠凝聚示意圖(A)，PC交聯(lián)明膠作用機制示意圖(B)

明膠是一種常用的微囊囊材，單凝聚或復(fù)凝聚法制得的微囊，通常需要用甲醛和戊二醛氨醛縮合反應(yīng)得到固化的微囊[12]。本文作者選用天然來源的化合物，葡萄籽中提取的 PC 作為交聯(lián)劑，避免了甲醛和戊二醛等的潛在毒性[13-14]。PC 的多酚羥基可與明膠的氨基通過分子間氫鍵作用形成水不溶的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，這與已報道的實驗結(jié)論相吻合[15-16]。選用 PC 替代甲醛或戊二醛等作為交聯(lián)劑，具有來源廣泛、毒性低、交聯(lián)效率高等優(yōu)點，且交聯(lián)作用迅速。

5 結(jié)論

PC 可與明膠形成分子間氫鍵，反應(yīng)迅速。本研究成功制得芎附微囊，掩蓋了藥物的不良?xì)馕?，具有較好的體外釋放結(jié)果，說明 PC 替代甲醛、戊二醛等傳統(tǒng)交聯(lián)劑切實可行，且 PC 為天然來源，安全性更高。天然來源交聯(lián)劑 PC 的使用，擴展了以明膠為囊材的微囊化技術(shù)在藥物遞送領(lǐng)域的應(yīng)用范圍；微囊化技術(shù)在降低揮發(fā)油的揮發(fā)性，改善其釋藥行為方面具有廣闊的應(yīng)用前景。