杧果C2C2型鋅指蛋白MiLSDs的生物信息及脅迫響應(yīng)分析

劉志鑫，孫 宇，葉 子，羅睿雄，李 忠，蒲金基，張 賀，龔德勇

(1.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,貴陽 550025；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 環(huán)境與植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?571101；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所，?？?571101；4.貴州省亞熱帶作物研究所，貴州興義 562400)

轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor，TFs)是植物中一類重要的調(diào)節(jié)基因，具有調(diào)控基因表達(dá)的功能，植物鋅指蛋白是一類具有核酸結(jié)合作用的關(guān)鍵性調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，在植物的生長發(fā)育、生物及非生物脅迫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。鋅指蛋白作為真核生物中種類最豐富的一類多肽結(jié)構(gòu)蛋白,其經(jīng)典的鋅指結(jié)構(gòu)是以Zn2+作為結(jié)合中心,在短距離內(nèi)通過疏水作用與幾種特定的氨基酸鏈螯合并折疊而形成穩(wěn)固的“手指”構(gòu)型；根據(jù)半胱氨酸(Cys)和組氨酸(His)的數(shù)量及位置，可將鋅指結(jié)構(gòu)域分為5亞類，其中C2C2型鋅指由4個(gè)半胱氨酸殘基結(jié)合一個(gè)Zn2+[1-2]。LSD1(Lesion simulating disease 1，LSD1)轉(zhuǎn)錄因子是一類特殊的C2C2型鋅指蛋白，其特征是含有3個(gè)特殊的鋅指結(jié)構(gòu)域：CxxCxRxxLMYxxGASxVxCxxC又稱為Zf-LSD1結(jié)構(gòu)域,其鋅指結(jié)構(gòu)域由25個(gè)保守氨基酸殘基組成，Zf-LSD1結(jié)構(gòu)域通過抑制促死途徑或激活抗死途徑來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，以響應(yīng)病原菌誘導(dǎo)的超敏細(xì)胞死亡的細(xì)胞發(fā)出的信號(hào)[3]。Dietrich等[4]在1994年從擬南芥中分離了6種突變體(lsd1、lsd2、lsd3、lsd4、lsd5和T5121)，并將其命名為lsd型(lesion simulating disease resistance response)，隨后Dietrich等[3]在1997年首次從擬南芥突變體lsd1中分離克隆出LSD基因。LSD轉(zhuǎn)錄因子可以作為促死亡信號(hào)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，也可以作為植物細(xì)胞死亡保護(hù)基因的激活因子，其相關(guān)蛋白是對氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子，特別是對植物超敏反應(yīng)(Hypersensitive Response，HR)過程中形成的活性氧中間體(Reactive Oxygen Intermediates，ROI)的調(diào)節(jié)因子[5]。目前為止，擬南芥中已有5個(gè)基因被鑒定為LSD1類基因家族的成員[6]，其中3種包含2個(gè)或3個(gè)高度相關(guān)的鋅指結(jié)構(gòu)是植物特異性的，但其全基因組分析表明，擬南芥中共有12個(gè)LSD家族成員，剩余7個(gè)LSD家族成員的功能仍是未知的。擬南芥LSD1(AtLSD1)作為調(diào)節(jié)各種氧化應(yīng)激來源反應(yīng)的樞紐，在氧化應(yīng)激反應(yīng)中起中心作用[3-6]。Kliebenstein等[7]研究表明，AtLSD1是誘導(dǎo)銅鋅超氧化物歧化酶(CuZnSOD)蛋白響應(yīng)水楊酸(Salicylic acid，SA)信號(hào)通路的一部分并與lsd1介導(dǎo)的擴(kuò)散細(xì)胞死亡結(jié)合從而間接抑制細(xì)胞死亡，Aviv等[8]證實(shí)AtLSD1(AT4G20380)負(fù)調(diào)控SA依賴信號(hào)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此外，LSD1還保留了一種基本的亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子AtbZIP10，LSD1和AtbZIP10這兩種蛋白質(zhì)在病原體誘導(dǎo)的HR和基礎(chǔ)防御反應(yīng)中都具有拮抗作用[6]。AtLSD1還對干旱和強(qiáng)光脅迫具有耐受性，在調(diào)節(jié)低溫依賴的細(xì)胞死亡和冷應(yīng)激反應(yīng)與ROS相關(guān)細(xì)胞死亡之間的信號(hào)串?dāng)_中起著重要作用[9-10]。LSD1增強(qiáng)了與氧化應(yīng)激相關(guān)的信號(hào)通路中的活性氧清除能力，減少由生物、非生物脅迫及病原菌侵染造成活性氧過度積累帶來的傷害。近年來，關(guān)于LSD1轉(zhuǎn)錄因子功能的研究不斷被報(bào)道，例如水稻[11]、大豆[12]、苦蕎[13]、小麥[14]等。

杧果(Mangifera indica)為漆樹科杧果屬果樹。杧果在生長發(fā)育過程中經(jīng)常受到生物、非生物脅迫及病原菌侵染，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致杧果貯運(yùn)期病果率高達(dá)30%～50%，甚至可達(dá)100%，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[15]。隨著全基因組測序技術(shù)的進(jìn)步，Wang等[16]、Li等[17]分別完成了對杧果全基因組的測序工作，獲得了基因組大小為393 Mb，20條染色體的杧果基因組圖譜，這為深入了解杧果LSD(MiLSD)基因家族信息奠定了基礎(chǔ)。本研究基于杧果全基因組信息，利用生物信息學(xué)方法對MiLSD基因家族進(jìn)行鑒定與分析，包括生物信息、保守結(jié)構(gòu)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化分析、病原菌侵染及激素處理分析，為解析MiLSD基因功能、遺傳育種提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

試驗(yàn)材料取自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部儋州市杧果種植資源圃貴妃杧果苗，1 a生幼苗，溫室種植，對新抽的嫩葉進(jìn)行處理，對照為0 h處理。以分生孢子為 2×106個(gè)/mL的膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)分生孢子懸浮液、2×107cfu的細(xì)菌性黑斑病菌(Xanthomonascitripv.mangiferaeindicae)懸浮液、以5 mmol/L水楊酸(SA)、5 mmol/L茉莉酸甲酯(MeJA)分別淋灌杧果苗嫩葉。每個(gè)處理分別對0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，剪取杧果苗葉片，液氮速凍，放入-80 ℃保存、備用。

1.2 方 法

1.2.1 數(shù)據(jù)來源 從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索獲取杧果全基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)；從PlantTFDB v5.0(http://planttfdb.gao-lab.org/)中下載擬南芥、毛果楊、煙草、木薯、蘋果、玉米、水稻、番茄、菠蘿9個(gè)物種LSD蛋白的氨基酸序列。

1.2.2MiLSDs轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員的鑒定 在Pfam(http://pfam.janelia.org/)中獲得LSD蛋白特征性結(jié)構(gòu)域，通過HMMER構(gòu)建隱馬爾可夫模型，在杧果蛋白數(shù)據(jù)庫中搜索含有LSD特征性結(jié)構(gòu)域蛋白并與擬南芥LSD基因家族成員的蛋白序列進(jìn)行Blastp比對(E值為10-5)，然后通過CDD(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)檢測是否含有LSD特征性序列，剔除不含特征性結(jié)構(gòu)域的蛋白，最終得到MiLSDs基因家族成員。

1.2.3MiLSDs轉(zhuǎn)錄因子基因家族生物信息分析 使用ExPASy-ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)對MiLSDs轉(zhuǎn)錄因子成員進(jìn)行理化性質(zhì)的預(yù)測,包括氨基酸個(gè)數(shù)、基因長度、分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)。通過在線網(wǎng)站SPOMA Secondary structure prediction(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)、SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)對杧果LSD蛋白序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

1.2.4MiLSD轉(zhuǎn)錄因子基因家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析 利用ClustalX軟件對杧果、擬南芥、毛果楊、煙草、木薯、蘋果、玉米、水稻、番茄、菠蘿的LSD結(jié)構(gòu)域蛋白序列進(jìn)行多序列的比對，利用進(jìn)化樹分析軟件MEGA 5.0對杧果與其他選定的9個(gè)物種采用鄰接法(neighbor-joining NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，使用在線網(wǎng)站iTOL(https://itol.embl.de/)美化進(jìn)化樹，并對MiLSDs基因家族成員進(jìn)行分類及進(jìn)化關(guān)系分析。

1.2.5 杧果葉片總RNA提取及cDNA第一鏈的合成 采用天根生化科技有限公司的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒中的方法提取杧果的總RNA。測定總RNA的濃度，-80 ℃保存，備用。采用天根生化科技有限公司的FirstKing cDNA第一鏈合成試劑盒中的方法反轉(zhuǎn)錄生成第一鏈cDNA，保存、備用。

1.2.6MiLSD轉(zhuǎn)錄因子基因家族實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)及差異表達(dá)分析 利用Primer Primer 5.0軟件對上述獲得的杧果LSD轉(zhuǎn)錄因子序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表1)，以杧果葉片cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。利用QuantStudio 6Flex的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測系統(tǒng)檢測不同處理及病原菌侵染下MiLSDs的表達(dá)量，反應(yīng)程序參照UltraSYBR Mixture試劑盒(北京康為世紀(jì))。以杧果MiActin作為內(nèi)參基因，0 h的表達(dá)量為對照，運(yùn)用2-△△Ct法和SPSS1.0.0-118軟件對各個(gè)樣品Ct值進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及方差分析，計(jì)算MiLSD1、MiLSD2、MiLSD3的基因相對表達(dá)量。

表1 定量PCR引物Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 杧果LSD轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員分析

在Pfam、CDD網(wǎng)站進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測中獲得3個(gè)杧果LSD候選基因，并將其命名為MiLSD1、MiLSD2、MiLSD3。利用ExPasy網(wǎng)站對MiLSDs進(jìn)行理化性質(zhì)分析(表2)，結(jié)果表明，3個(gè)杧果LSD(MiLSD1、MiLSD2、MiLSD3)蛋白的氨基酸個(gè)數(shù)依次為110、94、165個(gè)，基因長度依次為 1 862、1 322、2 635 bp，分子質(zhì)量依次為10.36～ 17.58 ku，理論等電點(diǎn)(pI)為8.73、6.68、8.93,其中MiLSD2理論等電點(diǎn)小于 7.000 0(由酸性氨基酸組成)，MiLSD1、MiLSD3理論等電點(diǎn)均大于7.000 0(堿性氨基酸組成)；不穩(wěn)定指數(shù)依次為 58.32、48.51、46.45，不穩(wěn)定指數(shù)平均值為 51.09，大于40，表明MiLSDs屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；親水性依次為-0.033、0.441、-0.100。親水性的平均值為0.308，MiLSD2大于0，是非親水性蛋白質(zhì)，MiLSD1和MiLSD3是親水性蛋白。

表2 杧果LSD轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員信息Table 2 Information of LSD transcription factor family in mango

為進(jìn)一步確定MiLSDs轉(zhuǎn)錄因子成員，通過NCBI檢索及CDD網(wǎng)站檢測，結(jié)果顯示MiLSDs成員均含有Zf-LSD1結(jié)構(gòu)域(圖1)。MiLSD1有1個(gè)Zf-LSD1結(jié)構(gòu)域，MiLSD2和含MiLSD3有2個(gè)Zf-LSD1結(jié)構(gòu)域。

2.2 杧果LSD轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)序列比對及結(jié)構(gòu)預(yù)測

為了解MiLSDs轉(zhuǎn)錄因子之間是否存在功能相似性，使用DNAMAN軟件對杧果LSD轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)序列進(jìn)行對比，結(jié)果顯示(圖2)MiLSD1、MiLSD2蛋白質(zhì)序列相似，而MiLSD3蛋白質(zhì)序列與MiLSD1、MiLSD2蛋白質(zhì)序列存在較大差異。

SPOMA預(yù)測結(jié)果顯示(圖3)，MiLSD1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要元件是α-螺旋(29.09%)，其次是延伸鏈(19.09%)和β-轉(zhuǎn)角(4.55%)，其余的為無規(guī)則卷曲(47.27%)；MiLSD2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要元件依次為延伸鏈約占28.72%、α-螺旋約占21.28%、β-轉(zhuǎn)角約占8.51%、無規(guī)則卷曲約占41.49%；MiLSD3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中，延伸鏈約占21.82%、α-螺旋約占15.15%、β-轉(zhuǎn)角約占7.27%、剩余的氨基酸(約占55.76%)為無規(guī)則卷曲。

基于同源建模原理，通過SWISS-MODEL網(wǎng)站以6skf.25.A為模型對杧果LSD家族成員蛋白質(zhì)進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測。結(jié)果顯示(圖4)MiLSD1、MiLSD2的三級(jí)結(jié)構(gòu)相似，而MiLSD3卻與之不同，這與MiLSDs轉(zhuǎn)錄因子基因家族在二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果相吻合。

2.3 杧果LSD轉(zhuǎn)錄因子基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將杧果(3個(gè)LSD基因)、擬南芥(12個(gè)LSD基因)、毛果楊(15個(gè)LSD基因)、煙草(21個(gè)LSD基因)、木薯(6個(gè)LSD基因)、蘋果(5個(gè)LSD基因)、水稻(12個(gè)LSD基因)、番茄(3個(gè)LSD基因)、菠蘿(5個(gè)LSD基因)共82個(gè)LSD蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。根據(jù)進(jìn)化樹分支將82個(gè)LSD基因劃分為十類(ClassⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ)，MiLSDs分別分布在2個(gè)分支，MiLSD3與菠蘿和蘋果聚類在較小分支ClassⅥ；MiLSD1和MiLSD2與其他8個(gè)物種聚類在一個(gè)較大分支ClassⅨ。楊樹LSD基因分布在ClassⅧ、Ⅹ；擬南芥LSD基因大部分分布在ClassⅠ；煙草LSD基因大部分存在ClassⅦ和Ⅹ；其余物種LSD基因在各個(gè)分支均有分布。

2.4 杧果LSD轉(zhuǎn)錄因子基因家族脅迫差異表達(dá)分析

熒光定量PCR分析MiLSDs在膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides，Cg)、細(xì)菌性黑斑病菌(Xanthomonascitripv.Mangiferaeindicae，Xcm)、水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)4個(gè)處理下各個(gè)時(shí)間段的轉(zhuǎn)錄水平。以MiActin為內(nèi)參基因，0 h為對照組，使用2-△△Ct法計(jì)算MiLSDs基因表達(dá)量。結(jié)果顯示杧果LSD轉(zhuǎn)錄因子基因家族不同成員在不同處理下的表達(dá)量存在差異性。

Cg處理結(jié)果(圖6-a)表明，MiLSD1較MiLSD2和MiLSD3在整體侵染過程中表達(dá)量高，在侵染3 h、6 h、24 h、72 h時(shí)MiLSD1表達(dá)量明顯上升且呈顯著性，侵染12 h時(shí)表達(dá)量下降，在侵染48 h時(shí)表達(dá)量最低；MiLSD2在侵染3 h時(shí)表達(dá)量最高且呈顯著性，隨之表達(dá)量下調(diào)趨于一個(gè)較穩(wěn)定的趨勢；MiLSD3表達(dá)量雖呈上調(diào)趨勢，但總體表達(dá)量較低，侵染72 h時(shí)表達(dá)量最低。Xcm處理結(jié)果(圖6-b)表明,MiLSD2整體表達(dá)量比MiLSD1、MiLSD3高，且在3 h、6 h、24 h、72 h時(shí)表達(dá)量呈顯著性；MiLSD1在24 h、48 h時(shí)表達(dá)量呈顯著性，MiLSD3在24 h表達(dá)量呈顯著性，其余時(shí)間段二者表達(dá)量均較低。SA處理結(jié)果(圖6-c)表明，MiLSD1、MiLSD3分別在處理3 h、24 h時(shí)表達(dá)量呈上調(diào)，MiLSD1在6 h、24 h、48 h、72 h幾乎表達(dá)量較低，MiLSD3在6 h、12 h、48 h、72 h幾乎表達(dá)量較低；反之，MiLSD2整體表達(dá)量均上調(diào)，在12 h時(shí)表達(dá)量最高，隨之較12 h呈下調(diào)趨勢。MeJA處理結(jié)果(圖6-d)表明，3個(gè)基因表達(dá)量除72 h外均顯著上調(diào)，MiLSD1在6 h到48 h呈上升趨勢，MiLSD2在3 h表達(dá)量最高，6 h到48 h表達(dá)量趨于穩(wěn)定，MiLSD3在3 h小時(shí)表達(dá)量最高，6 h、12 h表達(dá)量大致相同，24 h和48 h表達(dá)量也相差不大。

3 討 論

隨著高通量測序技術(shù)的不斷革新，目前被廣泛應(yīng)用于基因組和轉(zhuǎn)錄組的測序。本研究基于杧果全基因組信息鑒定并分析了3個(gè)MiLSDs轉(zhuǎn)錄因子，對其親水性分析發(fā)現(xiàn)MiLSD2與ZmLSD1[18]都是屬于非親水性蛋白，由酸性氨基酸組成，其余2個(gè)則為親水性蛋白；為進(jìn)一步確定MiLSDs轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員，對其保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)，MiLSDs轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員具有高度保守的特征鋅指蛋白，均包含zf-LSD1結(jié)構(gòu)域CxxCxRxxLMYxxGASxVxCxxC[3]。Liu等[19]發(fā)現(xiàn)，含有3個(gè)zf-LSD結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)與僅含有1個(gè)zf-LSD1結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)在功能上有顯著差異。大多數(shù)植物L(fēng)SD基因都有3個(gè)LSD結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化中是保守的，雖然對1個(gè)或2個(gè)LSD結(jié)構(gòu)域的基因的鑒定表明，其結(jié)構(gòu)在進(jìn)化過程中同樣保守，但LSD結(jié)構(gòu)域數(shù)目對LSD基因功能的影響尚不清楚[20]。為了解MiLSDs轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員之間的功能相似性，對其蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對及二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)MiLSD1和MiLSD2二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)相似，而MiLSD3卻與之不同。因此，推測MiLSD1和MiLSD2蛋白質(zhì)之間具有功能相似性。植物L(fēng)SD1基因的進(jìn)化可能是由兩個(gè)全基因組復(fù)制事件(Whole Genome Duplication，WGD)決定的，這些蛋白質(zhì)含有Zf-LSD1結(jié)構(gòu)域的3個(gè)拷貝，在其整個(gè)多肽中起著調(diào)節(jié)疾病防御和細(xì)胞死亡的關(guān)鍵作用[4，14，19]。分析MiLSDs基因家族的系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)在ClassⅥ分枝，MiLSD3表現(xiàn)出與菠蘿同緣關(guān)系較近，而MiLSD1和MiLSD2的結(jié)構(gòu)相似，聚類在ClassⅨ分枝中，表現(xiàn)出與楊樹和木薯親緣關(guān)系較近，與煙草和擬南芥較遠(yuǎn)。從系統(tǒng)進(jìn)化樹分析中可推測，MiLSD1和MiLSD2可能在其結(jié)構(gòu)上具有相似的功能；另外，根據(jù)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析也可以推測同一亞組間具有相似功能的成員在其結(jié)構(gòu)上也具有一定的相似性。

植物在生長發(fā)育過程中常受到生物、非生物脅迫及病原菌侵染等，在植物響應(yīng)這些脅迫過程中涉及復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，對杧果葉片進(jìn)行病原菌(Cg、Xcm)侵染處理和激素(SA、MeJA)處理。熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，MiLSD1在真菌(Cg)侵染下基因表達(dá)量明顯升高，這表明MiLSD1可能對膠孢炭疽菌侵染起正調(diào)控作用。在大豆銹病(Phakopsorapachyrhizi)侵染和脫水脅迫下大豆GmLSD的表達(dá)受到了一定調(diào)控，這表明，GmLSD基因參與了大豆對生物和非生物脅迫的反應(yīng)[12]；小麥TaLSD基因的表達(dá)量與禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、白粉菌(Powedrymildewpathogen)和條銹菌(Striperustpanthogen)的侵染緊密相連[14]；擬南芥LSD1對霜霉菌(Downymildew)表現(xiàn)了很高的抗病性[4]；Wang[11]等研究表明，轉(zhuǎn)入LSD1同源基因OsLSD1的水稻轉(zhuǎn)基因植株對稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)的抗性增加，而OsLSD1在調(diào)節(jié)植物PCD中起負(fù)作用，但在愈傷組織分化中起正作用。MiLSD2在細(xì)菌(Xcm)和SA處理下表達(dá)量上調(diào)，表明MiLSD2參與了杧果對細(xì)菌性黑斑病的抗性和SA的脅迫響應(yīng)，MiLSD2可能通過誘導(dǎo)SA來增加?xùn)x果對細(xì)菌性黑斑病的抗性；另外，Xcm處理?xiàng)l件下MiLSD2表達(dá)上調(diào)較SA處理高，說明該基因?qū)Σ煌耐饨绱碳ぞ哂胁煌捻憫?yīng)速度。AtLSD1基因通過積極響應(yīng)SA信號(hào)，提升活性氧的清除以降低非生物脅迫的傷害[8]；在苦蕎(Fagopyrumtataricum)中FtLSD1基因在SA和UV-B處理?xiàng)l件下表達(dá)上調(diào)，說明FtLSD1可能參與了苦蕎的抗SA和UV-B的防衛(wèi)反應(yīng)[13]；但在玉米(Zeamays)中，ZmLSD1基因在玉米根和葉部中的表達(dá)量下調(diào)[18]，這說明LSD基因在不同物種中對SA的調(diào)控作用不同。在MeJA處理下MiLSD1、MiLSD2、MiLSD3的表達(dá)量均呈顯著性，其中MiLSD3在MeJA處理下的3～48 h之間的表達(dá)量顯著上調(diào)，且在3 h時(shí)達(dá)到最高峰，說明MiLSD3參與杧果對MeJA脅迫的響應(yīng)，而且茉莉酸甲酯可能受MiLSDs的調(diào)控。

植物使用復(fù)雜的機(jī)制來平衡細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)水平的穩(wěn)態(tài)[21]。在清除ROS的酶中，過氧化氫酶是一種高度保守的酶，催化過氧化氫(H2O2)轉(zhuǎn)化為水和氧氣，并在去除過量的H2O2中起關(guān)鍵作用[22]。LSD調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡長期以來一直與氧化應(yīng)激有關(guān)，雖然LSD1的RCD表型是由超氧化物依賴性信號(hào)觸發(fā)的[23]，但LSD1參與了上調(diào)銅鋅超氧化物岐化酶(COPPERZINC SUPEROXIDE DISMUTASE)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而限制了細(xì)胞死亡的擴(kuò)散[7]。此外，lsd1突變體在短期允許條件下表現(xiàn)出過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性降低，氣孔電導(dǎo)降低[24]。這些結(jié)果表明LSD1可監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，從而調(diào)節(jié)不同類型的細(xì)胞死亡。本研究構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，擬南芥的AtLSD1位于Class I分支，而杧果的MiLSD1，MiLSD2位于ClassⅨ分支，屬于不同的進(jìn)化分支，但MiLSDs均能響應(yīng)SA的激活，尤其是MiLSD2，被激活后能持續(xù)上調(diào)表達(dá)72 h；而Kliebenstein[7]等研究認(rèn)為，AtLSD1具有誘導(dǎo)CuZnSOD蛋白響應(yīng)SA信號(hào)通路的功能；這說明不同進(jìn)化分支的LSD家族基因成員在植物生長發(fā)育過程中所行使的功能有所不同，推測LSD蛋白與SA信號(hào)分子間存在互相調(diào)節(jié)的潛在功能。

本試驗(yàn)利用杧果基因組數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學(xué)手段在杧果基因組中鑒定出3個(gè)MiLSD基因(MiLSD1～3)，并進(jìn)行了鑒定和分類，這3個(gè)基因存在于2個(gè)亞家族，保守結(jié)構(gòu)域及二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示3個(gè)基因成員具有一定保守性；在Cg、Xcm、SA、MeJA處理下，成員間的基因表達(dá)存在一定差異，表明各基因間存在功能差異。杧果C2C2型鋅指蛋白基因MiLSDs對不同的生物脅迫和激素處理表現(xiàn)出不同的表達(dá)特征，說明MiLSDs與杧果脅迫響應(yīng)相關(guān)，但其確切的生物學(xué)功能，有待于進(jìn)一步研究。