青稞耐低氮相關(guān)類甜蛋白基因HvTOND1克隆和亞細(xì)胞定位研究

安立昆，姚有華，姚曉華，吳昆侖

(1.青海大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)院，西寧 810016；2.青海省青稞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016；3.國家麥類改良中心青海青稞分中心，西寧 810016)

青稞(HordeumvulgareL.var.nudumHook.f.)，也稱裸大麥，是最具有高原地區(qū)特色的重要糧食和飼料作物，青稞栽培歷史悠久是高原農(nóng)業(yè)文明的象征。通過長期的進(jìn)化和栽培選育青稞完全適應(yīng)了高原地區(qū)極端的氣候，具有耐高寒、干旱、鹽堿、貧瘠等特點(diǎn)[1]。青稞籽粒富含纖維素、蛋白質(zhì)、維生素、β-葡聚糖，是人類非常理想的健康食品[2]。在高原地區(qū)青稞的產(chǎn)業(yè)發(fā)展直接影響著高原地區(qū)的糧食安全和經(jīng)濟(jì)發(fā)展，尤其是在高原農(nóng)牧民扶貧、脫貧工作中有著重要的地位[3-4]。

氮元素是作物生長發(fā)育中最重要的大量元素，在植物三大營養(yǎng)素(氮磷鉀)中排第一，也是作物生長和產(chǎn)量的主要限制因素之一[5]。青稞的主要產(chǎn)地都在生態(tài)極為脆弱的高原地區(qū)，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中過量的氮肥施用引起的生態(tài)環(huán)境問題更為敏感，高原地區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展直接影響著生態(tài)環(huán)境保護(hù)和地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。耐低氮基因TOND1(Tolerance of nitrogen defificiency 1)屬于類甜蛋白基因家族。類甜蛋白是植物中一類抗菌蛋白的總稱，屬于病程相關(guān)蛋白PR-5家族參與植物應(yīng)對多種病害，尤其是對真菌病害的防御過程[6-8]。水稻耐低氮基因OsTOND1是由Zhang等[9]采用秈稻‘特青’為背景的云南元江野生稻滲入系為材料，通過苗期和全生育期的耐低氮性狀鑒定，并選用苗期對低氮敏感滲入系‘YIL105’與‘特青’雜交構(gòu)建次級定群體進(jìn)行精細(xì)定位克隆得到的一個水稻類甜蛋白基因，發(fā)現(xiàn)其主要在水稻新生的芽、根、莖、幼嫩葉片和幼穗中表達(dá)，采用洋蔥表皮進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)其定位在細(xì)胞膜中，在水稻中過表達(dá)OsTOND1能提高水稻苗期耐低氮能力和大田成熟期的產(chǎn)量，采用RNAi干擾水稻中OsTOND1基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)低氮條件下水稻苗期的根長、株高、干質(zhì)量、氮濃度和植株總氮量和大田成熟期的有效穗數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)以及單株產(chǎn)量都明顯下降，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)OsTOND1啟動子區(qū)3個SNP和編碼區(qū)的2個SNP是含有TOND1基因的水稻品種耐低氮性增強(qiáng)的原因。

近年來各界高度重視化肥減施增效的研究與推廣，化肥減施增效戰(zhàn)略在高原地區(qū)生態(tài)文明建設(shè)有著重要的地位，減少高原地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中化肥施用，減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對環(huán)境的影響對于保護(hù)高原地區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境促進(jìn)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展具有重要作用?？寺『脱芯壳囡偷偷?qū)ρ芯壳囡偷偷獧C(jī)制以及利用分子育種技術(shù)培育耐低氮青稞品種有重要的推動作用，對于減少青稞生產(chǎn)中的氮肥施用，減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對生態(tài)環(huán)境的影響。促進(jìn)青稞栽培區(qū)域的生態(tài)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 青稞DNA提取 參照天根生化科技有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒DP305說明書提取青稞葉片基因組DNA，提取的DNA放于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2HvTOND1基因克隆和啟動子區(qū)域序列克隆 根據(jù)已報(bào)道的水稻耐低氮基因OsTOND1，將基因序列輸入植物基因組數(shù)據(jù)庫Gramene(http://www.gramene.org/)中大麥基因組數(shù)據(jù)中進(jìn)行搜索獲得大麥的HvTOND1基因，并根據(jù)大麥HvTOND1基因序列及起始密碼子ATG前2 000 bp左右序列設(shè)計(jì)引物。基因克隆正向引物：F:5′-ACAGCACCACAGCAAGCAAG-3′；反向引物：R:5′-TCAGGGCGTGTGTCAAGGTT-3′。啟動子區(qū)域序列克隆正向引物：F:5′-TGTCGATCGTGAGGAGCTGG-3′；反向引物：F:5′-CTTGCTTGCTGTGGTGCTGT-3′。采由于用HvTOND1不具有內(nèi)含子所以采用KOD-FX高保真PCR酶以青稞‘昆侖14’基因組DNA為模板克隆青稞HvTOND1序列和啟動子區(qū)域序列。對提取的青稞基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s,56 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min(擴(kuò)增啟動子區(qū)域序列為2 min)，35個循環(huán)；4 ℃保存。反應(yīng)完畢，取5 μL PCR產(chǎn)物在含EB的10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下檢測。將PCR產(chǎn)物與pEASY-Blunt Cloning載體混合參照試劑盒說明書進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆并送測序。

1.2.3 青稞HvTOND1生物信息學(xué)分析 采用Gene Structure Display Server 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)對基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；采用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對啟動子區(qū)域元件進(jìn)行預(yù)測分析；采用Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)對蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測分析；采用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析；采用kinasephos2(http://kinasephos2.mbc.nctu.edu.tw/)對蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測分析；采用SignalP(http://www.Cbs.Dtu.Dk /services /SignalP/)對蛋白信號肽進(jìn)行預(yù)測分析；采用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；采用同源建模軟件Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行蛋白三級結(jié)構(gòu)同源建模。采用DNAMAN 7.0將青稞 HvTOND1蛋白序列與小麥(Triticumaestivum)TaTOND1、黑麥(Secalecereale)ScTOND1、小米(Setariaitalica)SiTOND1、水稻(Oryzasativa)OsTOND1、高粱(Sorghumbicolor)SbTOND1、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)BdTOND1、節(jié)節(jié)麥(Aegilopstauschiisubsp.tauschii)AtsTOND1、玉米(ZeamaysL.)ZmTOND1、二型花DoTOND1(Dichantheliumoligosanthes)、羊黍PhTOND1(Panicumhallii)的蛋白序列進(jìn)行對比并采用MEGA7中以最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 青稞HvTOND1亞細(xì)胞定位研究 采用pBI221-GFP載體用于亞細(xì)胞定位研究，設(shè)計(jì)帶有XbaⅠ的正向引物：5′-GCTCTAGAACAGCACCACAGCAAGCAAG-3′和KpnⅠ酶切位點(diǎn)的反向引物5′-CGGGTACCTGGGCAGAA GACGACTTG-3′采用高保真酶KOD-FX擴(kuò)增HvTOND1的ORF區(qū)域，構(gòu)建C端與GFP融合的表達(dá)載體。PCR擴(kuò)增體系與HvTOND1基因克隆時(shí)體系相同。PCR產(chǎn)物和PBI221-GFP載體質(zhì)粒經(jīng)KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切后，分別回收片段混合后采用T4連接酶連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，選取陽性克隆，并進(jìn)行測序 驗(yàn)證。

將水稻種子在30 ℃黑暗萌發(fā)15 d取葉片切成碎段(<0.5 mm)，總量5～10 g。加入5～ 10 mL酶解液28 ℃ 100 r/min緩慢震蕩酶解 5～6 h，酶解后用40 μm濾網(wǎng)過濾，50 g離心 10 min。倒去上清，用預(yù)冷W5溶液10 mL洗滌2次，50 g離心5min，加入500 μL MMG溶液懸浮。鏡檢：40倍鏡下，每個視野20～40個。取200 μL原生質(zhì)體懸液加入10 μL質(zhì)粒(500 ng以上)，取相等體積的PEG溶液混合，室溫靜置 30 min。用1 mL W5稀釋原生質(zhì)體，100 g離心 5 min去上清。加入1 000 μL W5洗1～2次。最后加入 1 mL W5溶液，轉(zhuǎn)移到2 mL 離心管中，28 ℃暗培養(yǎng) 24～48 h，激光共聚焦顯微鏡 觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞 HvTOND1基因和啟動子區(qū)域序列 克隆

通過PCR分別擴(kuò)增出片段大小為619 bp的基因片段和2 080 bp的啟動子區(qū)域片段(圖1)。將擴(kuò)增得到的片段連接入pEASY-Blunt Cloning載體中采用M13引物進(jìn)行測序。

2.2 青稞 HvTOND1基因生物信息分析

2.2.1 青稞HvTOND1啟動子功能元件預(yù)測 將克隆得到的HvTOND1基因啟動子區(qū)域序列輸入啟動子元件分析網(wǎng)站PlantCARE中進(jìn)行分析(表1)。發(fā)現(xiàn)HvTOND1基因啟動子區(qū)域具有多種激素誘導(dǎo)表達(dá)元件。

表1 青稞 HvTOND1 啟動子區(qū)域元件分析 Table 1 Structure of cis-acting elements in promoter region of HvTOND1 gene

2.2.2 HvTOND1蛋白理化性質(zhì)分析 通過在線軟件ProtParam分析OsTOND1和 HvTOND1蛋白的理化性質(zhì)，OsTOND1由182個氨基酸組成，為疏水性穩(wěn)定蛋白。HvTOND1由171個氨基酸組成，為親水性穩(wěn)定蛋白(表2)。

表2 水稻OsTOND1和青稞 HvTOND1蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析Table 2 Physical and chemical properties of OsTOND1 and HvTOND1 protein

2.2.3 HvTOND1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析 通過在線軟件TMHMM Server v.2.0 網(wǎng)站 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)對OsTOND1和 HvTOND1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)OsTOND1有一個跨膜結(jié)構(gòu)而HvTOND1不具有跨膜結(jié)構(gòu)(圖2)。

2.2.4 HvTOND1蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測 使用KinasePhos(http://kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/predict.php)預(yù)測OsTOND1和HvTOND1的磷酸化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)OsTOND1有絲氨酸(Ser)3個，蘇氨酸(Thr)2個，酪氨酸(Tyr)1個共5個磷酸化位點(diǎn)。HvTOND1有絲氨酸(Ser)1個，蘇氨酸(Thr)2個，酪氨酸(Tyr)1個共3個磷酸化位點(diǎn)(圖3)。

2.2.5 HvTOND1蛋白信號肽預(yù)測 采用在線軟件SignalP-5.0(http://www.Cbs.Dtu.Dk /services /SignalP/)，對 OsTOND1和HvTOND1進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)OsTOND1具有信號肽序列：MASAPAASPAVLVVVVLVASLAAGGANA，切割位點(diǎn)在第28至29位氨基酸之間。HvTOND1具有信號肽序列：MAASSSMLILLLAAALDADA，切割位點(diǎn)在第20至21位氨基酸之間(圖4)。

2.2.6 HvTOND1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 采用在線軟件SOPMA分析OsTOND1和 HvTOND1蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)OsTOND1蛋白的α螺旋、無規(guī)則卷曲、β轉(zhuǎn)角、延長鏈分別占氨基酸總數(shù)的6.59%、50.55%、8.24%、34.62%。HvTOND1蛋白的α螺旋、無規(guī)則卷曲、β轉(zhuǎn)角、延長鏈分別占氨基酸總數(shù)的12.87%、54.97%、3.51%、28.65%(圖5)。

2.2.7 HvTOND1蛋白信號肽預(yù)測三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 采用在線軟件Swiss-Model對青稞HvTOND1和水稻OsTOND1蛋白進(jìn)行同源建模生成三級結(jié)構(gòu)(圖6)。

2.2.8 HvTOND1蛋白氨基酸序列對比分析 采用DNAMAN 7.0進(jìn)行蛋白序列對比分析發(fā)現(xiàn)青稞HvTOND1與水稻OsTOND1一致性為58.24%，HvTOND1與其他物種的同源蛋白都具有信號肽和TLP-P結(jié)構(gòu)域(圖7)。

2.2.9 HvTOND1同源進(jìn)化分析 將青稞HvTOND1與小麥(Triticumaestivum)TaTOND1、黑麥(Secalecereale)ScTOND1、小米(Setariaitalica)SiTOND1、水稻(Oryzasativa)OsTOND1、高粱(Sorghumbicolor)SbTOND1、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、節(jié)節(jié)麥(Aegilopstauschiisubsp.tauschii)AtsTOND1、玉米(ZeamaysL.)ZmTOND1、二型花DoTOND1(Dichantheliumoligosanthes)、羊黍PhTOND1(Panicumhallii)的TOND1同源蛋白序列輸入MEGA7中構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)青稞HvTOND1與節(jié)節(jié)麥AtsTOND1親緣關(guān)系最近(圖8)。

2.3 青稞HvTOND1亞細(xì)胞定位結(jié)果

采用水稻原生質(zhì)體進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)在水稻原生質(zhì)體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中有明顯的綠色熒光信號，說明青稞HvTOND1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中(圖9)。

3 結(jié)論與討論

HvTOND1屬于類甜蛋白家族(Thaumatin-like protein)，類甜蛋白廣泛分布于動植物和微生物中[10]。類甜蛋白家族在植物應(yīng)對干旱、低溫、病害等逆境中均能發(fā)揮功能，尤其是具有廣譜抗真菌病害作用，此外類甜蛋白家族也廣泛參與植物的生長發(fā)育過程調(diào)控[11-13]。植物類甜蛋白家族基因有10個具有共同起源的旁系類群構(gòu)成，不同類群的類甜蛋白家族基因的功能發(fā)生高度分化[14]。類甜蛋白家族大多具有信號肽結(jié)構(gòu)，是一種分泌蛋白可以在細(xì)胞外發(fā)揮作用[13,14-18]。

目前，大部分類甜蛋白家族研究都主要集中于抗真菌病害等領(lǐng)域，很多類甜蛋白家族基因被應(yīng)用于培育抗真菌病害的轉(zhuǎn)基因植物中[19]。目前，關(guān)于類甜蛋白在植物耐低氮中的功能研究報(bào)道極少。李健平等[20]采用race技術(shù)從香蕉EST文庫中克隆到一個與香蕉抗病相關(guān)的類甜蛋白基因MaTLP1，該基因在根、球莖、假莖中表達(dá)量高，在葉、花、果實(shí)中表達(dá)量較低，并且發(fā)現(xiàn)在香蕉受古巴?；图怄哏牭毒腥緯r(shí)有強(qiáng)烈的誘導(dǎo)表達(dá)，認(rèn)為該類甜蛋白在香蕉抗枯萎病中有重要的作用。馬驪等[13]采用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)從低溫脅迫下的油菜葉片中差異蛋白點(diǎn),分離出一個耐寒相關(guān)類甜蛋白，命名為TLP，并進(jìn)一步對TLP進(jìn)行生物信息學(xué)和低溫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)該類甜蛋白在油菜應(yīng)對低溫脅迫中有著重要作用。一些研究表明從大麥、蘋果、櫻桃、煙草等植物中發(fā)現(xiàn)一些類甜蛋白具有β-1,3-葡聚糖酶活性，并認(rèn)為這與誘導(dǎo)植物抵御真菌病害有關(guān)[21]。很多研究表明一些類甜蛋白家族成員有木聚糖酶抑制劑活性或淀粉酶抑制劑的活性，可以抑制昆蟲淀粉酶的活性，減少昆蟲消化吸收營養(yǎng)成分達(dá)到抵御蟲害的作用，此外很多植物中發(fā)現(xiàn)一些類甜蛋白家族成員是引起人類過敏的過敏源[14]。

目前，關(guān)于青稞中耐低氮相關(guān)類甜蛋白基因尚未見有研究報(bào)道，克隆和研究青稞HvTOND1對于研究青稞耐低氮分子機(jī)制具有重要意義。本研究根據(jù)已報(bào)道的水稻OsTOND1基因信息在植物基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索獲得了大麥的同源基因HvTOND1信息，并以此設(shè)計(jì)引物從青稞‘昆侖14’中克隆得到青稞HvTOND1基因序列信息。采用生物信息學(xué)軟件對基因和蛋白結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)等進(jìn)行預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)HvTOND1基因不具有內(nèi)含子。啟動子區(qū)域上具有大量和激素有關(guān)的順式作用元件。很多類甜蛋白家族的表達(dá)受茉莉酸和水楊酸等激素信號調(diào)控[14,22]，HvTOND1基因啟動子區(qū)域序列元件預(yù)測也發(fā)現(xiàn)有8個茉莉酸和4個脫落酸的順式作用元件，1個水楊酸和2個赤霉素作用元件，此外還有4個MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)以及1個細(xì)胞周期和種子特異性順式作用元件。HvTOND1蛋白是一種分子量為18 022.24 u理論等電點(diǎn)為5.27的親水蛋白。HvTOND1具有4個磷酸化位點(diǎn)，具有信號肽結(jié)構(gòu)，但是不具有跨膜結(jié)構(gòu)。通過與其他物種的同源蛋白序列進(jìn)行對比并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)其系統(tǒng)進(jìn)化樹分成兩支小麥TaTOND1、小米SiTOND1、水稻OsTOND1、高粱SbTOND1、羊黍PhTOND1、二型花DoTOND1為一分支，玉米ZmTOND1、黑麥ScTOND1、二穗短柄草BdTOND1、節(jié)節(jié)麥AtsTOND1、青稞HvTOND1為另一分支，其中青稞HvTOND1與節(jié)節(jié)麥AtsTOND1親緣關(guān)系最近。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示青稞HvTOND1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，而張陽軍[23]研究發(fā)現(xiàn)水稻OsTOND1僅定位于細(xì)胞膜中。

青稞作為高原地區(qū)的特有作物，在青稞生產(chǎn)中避免過量施用氮肥造成對生態(tài)環(huán)境的破壞在生態(tài)極為脆弱的高原地區(qū)尤為重要。目前關(guān)于青稞中耐低氮基因的研究報(bào)道極少。本研究克隆了青稞耐低氮相關(guān)類甜蛋白基因HvTOND1，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析和亞細(xì)胞定位研究，為青稞耐低氮分子機(jī)制研究提供了一定的參考。