高壓均質(zhì)-冷凍干燥技術(shù)制備大豆分離蛋白微粒及其功能特性

肖志剛，王依凡，王可心，段慶松，朱旻鵬，霍金杰，江睿生，李 航，何 東，高育哲

高壓均質(zhì)-冷凍干燥技術(shù)制備大豆分離蛋白微粒及其功能特性

肖志剛1,2，王依凡1，王可心1，段慶松2，朱旻鵬1，霍金杰1，江睿生1，李 航1，何 東1，高育哲1※

（1. 沈陽(yáng)師范大學(xué)糧食學(xué)院，沈陽(yáng) 110034； 2. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，沈陽(yáng) 110886）

為了進(jìn)一步改善大豆分離蛋白的分散性及功能性質(zhì)，該研究以大豆分離蛋白為原料，通過對(duì)天然大豆分離蛋白進(jìn)行高壓高剪切處理并聯(lián)合冷凍干燥技術(shù)，制備大豆分離蛋白微粒，考察壓力（60～100 MPa）對(duì)大豆分離蛋白微粒尺寸、功能性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特性的影響，探究其構(gòu)效關(guān)系。結(jié)果表明：隨著壓力逐漸增加，大豆分離蛋白平均粒徑大幅度減小，粒徑分布曲線向左側(cè)移動(dòng)，與天然大豆分離蛋白相比，在100 MPa時(shí)大豆分離蛋白粒徑減小了1 631%，粒徑曲線分布較寬。在60～100 MPa壓力范圍內(nèi)隨著壓力的增加。與天然大豆分離蛋白相比，大豆分離蛋白微粒的分散性指數(shù)（Protein Dispersibility Index, PDI）和功能性質(zhì)均顯著提高（<0.05），其中在100 MPa時(shí)大豆蛋白質(zhì)的溶解性提高了172.98%，乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別增加了約28.71%和77.82%，持油性增加了約123.76%，起泡性隨時(shí)間的變化其泡沫高度也均有所提高。由掃描電鏡圖可以觀察到，未經(jīng)過高壓均質(zhì)的大豆分離蛋白粒子呈聚集狀態(tài)，球狀的表面向內(nèi)凹陷，經(jīng)過高壓均質(zhì)聯(lián)合冷凍干燥處理后的大豆分離蛋白微粒呈現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。在高壓和高剪切力的作用下，大豆分離蛋白微粒的疏水基團(tuán)大量暴露，表面疏水性隨之增加，靜電斥力增加，-螺旋和-轉(zhuǎn)角向-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化是蛋白質(zhì)的溶解性等功能性質(zhì)提高的主要原因。溶解性等功能性質(zhì)的提高有利于大豆分離蛋白更好的應(yīng)用于食品加工行業(yè)，進(jìn)一步為蛋白的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供新思路。

蛋白；壓力；大豆分離蛋白；微粒；溶解性；功能性質(zhì)

0 引 言

大豆分離蛋白是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，具有豐富營(yíng)養(yǎng)價(jià)值且價(jià)格低廉。但天然大豆分離蛋白存在大量疏水基團(tuán)，與乳蛋白相比，其溶解性并不理想且待提高，功能性質(zhì)不能得到很好地發(fā)揮[1-3]。蛋白質(zhì)微?；╩icro-particulated）是通過各種物理、化學(xué)手段改變蛋白質(zhì)的聚集方式，使蛋白質(zhì)形成具有納微尺度和相對(duì)有序、剛性空間結(jié)構(gòu)的微粒[4]。蛋白微粒常用的制備方法有雙乳化法、反溶劑法、機(jī)械法或通過相分離與其他高分子聚合物結(jié)合等[5]。雙乳化法與反溶劑法都會(huì)引入其他化學(xué)試劑，相分離法需要控制好蛋白濃度，否則不容易制備成微?；鞍?，傳統(tǒng)機(jī)械法一般會(huì)與加熱相結(jié)合。與這些處理改性方法不同的是，本研究利用高壓均質(zhì)-冷凍干燥聯(lián)合技術(shù)制備大豆蛋白微粒，微粒產(chǎn)品性狀更加輕薄，蛋白會(huì)在高壓均質(zhì)機(jī)內(nèi)發(fā)生聚集或展開的一個(gè)瞬時(shí)高壓剪切過程，蛋白部分的官能團(tuán)暴露，使其功能性質(zhì)及結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，同時(shí)具有微?；潭雀?、不引入化學(xué)試劑等特點(diǎn)，與天然大豆蛋白質(zhì)相比，經(jīng)微?；蟮拇蠖沟鞍孜⒘５牧酱蠓鶞p小，這有助于進(jìn)一步提高蛋白溶解性和持油性等功能性質(zhì)。

因此本文通過改變不同高壓均質(zhì)壓力制備不同尺寸的大豆分離蛋白微粒，考察不同尺寸微粒形成前后溶解性等功能性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性的變化，探究其構(gòu)效關(guān)系，揭示高壓均質(zhì)制備微?；鞍椎臋C(jī)理。微?；拇蠖狗蛛x蛋白可作為植物蛋白配料應(yīng)用于高蛋白飲料等食品中，起到增溶減沉、增強(qiáng)乳化效果等作用，為進(jìn)一步拓寬大豆分離蛋白在食品行業(yè)的廣泛應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白（蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.06%，溶解性為33.60%）：得天力試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉，美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓均質(zhì)機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；DWF-100型電動(dòng)粉碎機(jī)，河北省科研儀器廠；ULTRA TURRAX?高速分散機(jī)，德國(guó)IKA公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī)，上海市離心機(jī)械研究所；Ntcolet 5DXC紅外光譜儀，美國(guó)Ntcolet Co公司；SU3500掃描電鏡，日本日立公司；Zetasizer Nano ZS90分子粒度和zeta電位分析儀，英國(guó)Malvern公司；熒光分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 高壓均質(zhì)聯(lián)合冷凍干燥制備大豆分離蛋白微粒

將大豆分離蛋白作為原料，配制大豆分離蛋白分散液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，將大豆分離蛋白分散液在室溫下用磁力攪拌器攪拌1 h，根據(jù)前期的預(yù)試驗(yàn)，經(jīng)過不同壓力（60、70、80、90、100 MPa）高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)后得到大豆分離蛋白微粒分散液，獲得的大豆分離蛋白微粒分散液再進(jìn)行冷凍干燥，然后將其過100目篩后獲得大豆分離蛋白微粒。

1.3.2 大豆分離蛋白微粒的溶解性測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行修改，取0.1 g蛋白樣品，加入10 mL蒸餾水，室溫下磁力攪拌1 h，然后在19 200下離心10 min，收取上清液，用凱氏定氮法測(cè)得上清液中蛋白質(zhì)含量（%）。根據(jù)以下公式計(jì)算蛋白質(zhì)的溶解性（%）：

1.3.3 大豆分離蛋白微粒的乳化活性及穩(wěn)定性測(cè)定

根據(jù)Song等[7]的方法進(jìn)行修改，配置2 mg/mL大豆分離蛋白微粒溶液，將30 mL的樣品溶液與10 mL大豆油混合均勻，使油的體積分?jǐn)?shù)為30%。用高速分散機(jī)在10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下均質(zhì)2 min。均質(zhì)結(jié)束后，立刻（0 min）從得到的溶液底部取50L乳液加至5 mL 0.1%十二烷基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS）溶液中，混勻，在波長(zhǎng)為500 nm處測(cè)定吸光值。10 min后，再?gòu)牡玫降娜芤旱撞咳?0L乳濁液加至5 mL 0.1%SDS溶液中，混勻，測(cè)定吸光值。初始時(shí)的吸光值為0，10 min時(shí)的吸光值為10，乳化活性（Emulsifying Activity Index）和乳化穩(wěn)定性（Emulsion Stability Index）的計(jì)算公式如下：

式中2為固定系數(shù)；2.303為反應(yīng)速率常數(shù)；為稀釋倍數(shù)；為油脂占總數(shù)的比例；為光路長(zhǎng)度，cm；C為蛋白質(zhì)濃度，g/mL；0為初始時(shí)吸光值；為間隔時(shí)間，min；為吸光度差值。

1.3.4 大豆分離蛋白微粒的起泡性及泡沫穩(wěn)定性測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行修改，配置5 mg/mL的大豆分離蛋白微粒溶液，用高速分散機(jī)在13 500 r/min的轉(zhuǎn)速下分散樣品溶液2 min，立即將起泡后的溶液倒入量筒中，記錄隨時(shí)間變化（0、10、20、30、40、50 min）其液面高度（mL）的變化。

1.3.5 大豆分離蛋白微粒持水性的測(cè)定

采用文獻(xiàn)[9]的方法，稱取0.1 g大豆分離蛋白微粒裝入10 mL離心管中，記錄此時(shí)大豆分離蛋白微粒與離心管總質(zhì)量為1（g），向離心管中加入3 mL的去離子水，用渦旋震蕩充分混合均勻后，在9 600下離心20 min，倒去上清液，記錄此時(shí)離心管的質(zhì)量為2（g）。持水性（%）用被吸附的水的質(zhì)量和蛋白質(zhì)的質(zhì)量之比計(jì)算，按以下公式計(jì)算：

1.3.6 大豆分離蛋白微粒持油性的測(cè)定

采用文獻(xiàn)[10]的方法并加以修改，稱取0.1 g大豆分離蛋白微粒裝入10 mL離心管中，記錄此時(shí)大豆分離蛋白微粒與離心管總質(zhì)量為3（g），向離心管中加入3 mL的大豆油，用渦旋震蕩充分混合均勻后，在9 600下離心20 min，，吸去上層未吸附樣品的大豆油，記錄此時(shí)離心管的質(zhì)量為4（g）。持油性（%）用被吸附的油的質(zhì)量和蛋白質(zhì)的質(zhì)量之比計(jì)算，按以下公式計(jì)算：

1.3.7 大豆分離蛋白微粒的微觀形貌觀察

以掃描電子顯微鏡（Scanning Eectron Microscope，SEM）觀察微粒粉體的微觀形貌。取少量冷凍干燥后的微粒粉末以導(dǎo)電雙面膠固定在樣品臺(tái)上，使用離子濺射儀對(duì)其表面進(jìn)行噴金處理，噴金時(shí)電流設(shè)置為20 mA，時(shí)間為45 s，將噴好金的樣品放入樣品室，以15 kV的電壓進(jìn)行觀察并拍照。

1.3.8 大豆分離蛋白微粒的粒度及Zeta電位測(cè)定

配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%的大豆分離蛋白溶液，分散介質(zhì)為水，在室溫下磁力攪拌1 h，粒度大小分布及Zeta電位采用Zetasizer Nano ZS90分子粒度儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.9 熱穩(wěn)定性測(cè)定

采用差示熱量掃描儀（NETZSCH DSC 200 F3，美國(guó)TA公司）分析大豆分離蛋白微粒的熱穩(wěn)定性（Differential Scanning Calorimetry，DSC）。稱取5 mg 左右的樣品至鋁坩堝中，然后將坩堝密封，加熱溫度為20～200 ℃，升溫速率為10 ℃/min。

1.3.10 大豆分離蛋白微粒二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

使用FT-IR光譜儀（AVATAR 370FT-IR，美國(guó)Ntcolet Co公司）分析樣品的主要官能團(tuán)。光譜記錄在400～4 000 cm-1的范圍內(nèi)，分辨率為4 cm-1。同時(shí)利用Peakfit Version 4.12 軟件進(jìn)行譜圖處理，采用分峰擬合的方法，計(jì)算出樣品中二級(jí)結(jié)構(gòu)組分的含量。

1.3.11 表面疏水性測(cè)定

依據(jù)朱明明等[11]的方法并修改，表面疏水性用8-苯胺-1-萘磺酸（8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）作為熒光探針進(jìn)行測(cè)定。用磷酸緩沖液（10 mmol/L，pH值7.2）制備8×10-3mol/L ANS貯備液以及15 mg/mL蛋白微粒溶液。用磷酸鹽緩沖液將上清液梯度稀釋至0.005～0.500 mg/mL之間，取40L 8 mmol/L的ANS溶液加入到4 mL不同質(zhì)量濃度的蛋白樣品中，用渦漩震蕩器充分混合。在390 nm（激發(fā)波長(zhǎng)）和470 nm（發(fā)射波長(zhǎng)）測(cè)量（20 ℃）熒光強(qiáng)度，狹縫5 nm，掃描速率10 nm/s。以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白微粒質(zhì)量濃度作圖，初始段的斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)。在用熒光分光光度計(jì)測(cè)定表面疏水性時(shí)，使用的是離心后的上清液，所以可以認(rèn)為上清液中蛋白是完全溶于磷酸緩沖溶液。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)均平行、重復(fù)測(cè)定3次，采用SPSS 22.0軟件中方差分析法進(jìn)行差異顯著性分析，以＜0.05表示差異顯著，通過Origin 8軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 壓力對(duì)大豆分離蛋白微粒的粒徑及電位的影響

蛋白質(zhì)平均粒徑的大小直觀反映了溶液中顆粒的大小，且對(duì)溶解性有至關(guān)重要的影響[12]。圖1和表1表示經(jīng)過高壓均質(zhì)處理的大豆分離蛋白平均粒徑，隨著壓力的逐漸增加，大豆分離蛋白平均粒徑大幅度減小，在100 MPa時(shí)與天然大豆分離蛋白相比粒徑減小了約1 631%，且達(dá)到最小值295.7 nm。圖1中的曲線表示，經(jīng)過高壓均質(zhì)處理后的曲線向左側(cè)移動(dòng)，天然大豆分離蛋白顆粒分布較窄，粒徑較大。這可能是由于天然的大豆分離蛋白的疏水基團(tuán)在蛋白質(zhì)內(nèi)部，經(jīng)過壓力和剪切力的作用，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生折疊，暴露出疏水基團(tuán)。這與趙飛[13]的研究結(jié)果一致。聚合物分散性指數(shù)（Polymer Dispersity Index），代表聚合物粒徑的均一程度，PDI 越大，粒徑大小分布越寬；PDI 越小，粒徑大小分布越均勻集中。由表1可知，隨著壓力的增加，大豆分離蛋白微粒均較天然大豆分離蛋白的PDI指數(shù)提高，阻止了聚集體的形成。

Zeta電位代表蛋白顆粒間相互吸引或排斥力強(qiáng)度及蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)，同時(shí)也是蛋白分散穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，Zeta 電位的絕對(duì)值越高，體系就越穩(wěn)定。經(jīng)過高壓高剪切的處理，大豆分離蛋白微粒Zeta電位的絕對(duì)值明顯提高，它們具有更大的電負(fù)性，同時(shí)進(jìn)一步增強(qiáng)了顆粒之間的靜電斥力，這可能是分子間非共價(jià)鍵的相互作用使得大豆分離蛋白所帶的極性基團(tuán)更多暴露于蛋白分子表面，從而增加了蛋白表面的電荷數(shù)量，導(dǎo)致大豆分離蛋白微粒溶液的 Zeta 電位絕對(duì)值增大[14]，同時(shí)提高了其分散體系的穩(wěn)定性。此結(jié)果和文獻(xiàn)[15]的研究結(jié)論一致。

表1 不同均質(zhì)壓力下大豆分離蛋白微粒的平均粒徑、PDI及Zeta電位

注：同列不同字母表示差異顯著（<0.05），下同。

Note: Different letters in the same column indicate significant differences (<0.05). The same below.

2.2 壓力對(duì)大豆分離蛋白微粒功能特性的影響

溶解性是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的重要指標(biāo)，經(jīng)過高壓均質(zhì)制備成大豆分離蛋白微粒后，其溶解性大幅度提高，當(dāng)壓力達(dá)到100 MPa時(shí)，大豆分離蛋白微粒溶解性達(dá)到最大值是91.72%，較天然大豆分離蛋白溶解性提高172.98%。這可能是由于壓力的增加使蛋白分子展開，大量疏水基團(tuán)暴露，增加了表面電荷，蛋白分子間靜電斥力增加[16]，空間結(jié)構(gòu)上蛋白發(fā)生一定程度上的先折疊再展開，二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)-水之間的相互作用增強(qiáng)，使大豆分離蛋白微粒的溶解有所提高。這與文獻(xiàn)[17]得到的研究結(jié)果一致。在90 MPa時(shí)的溶解性略低于80 MPa，產(chǎn)生這種結(jié)果可能是在此壓力時(shí)部分蛋白形成發(fā)生變性或形成聚集體。

乳化性能指油和水混合在一起形成乳狀液的性能，具有良好的乳化性能可以改善食品的口感[18]。由表2可知隨著壓力的增加，大豆分離蛋白微粒的乳化活性與乳化穩(wěn)定性均較天然大豆分離蛋白的有所提高，并在100 MPa時(shí)達(dá)到最大，其中乳化活性增大了約28.71%，乳化穩(wěn)定性增加了約77.82%。導(dǎo)致這種結(jié)果的原因是經(jīng)過高壓高剪切，使蛋白的內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，疏水基團(tuán)大量暴露，可以增強(qiáng)與油的相互作用[19-20]。起泡性能通過泡沫高度表征，并記錄不同時(shí)間下泡沫的穩(wěn)定性。經(jīng)過高壓均質(zhì)處理后，在不同時(shí)間下蛋白起泡能力與對(duì)照比較均有顯著增加，這是由于蛋白結(jié)構(gòu)展開和以及表面疏水性的增強(qiáng)，從而使得蛋白質(zhì)在氣－水界面快速吸附。該結(jié)果與Xu等[21]的研究一致。在100 MPa時(shí)其起泡能力略有減小，影響起泡能力的因素多且不易控制，可能由于此時(shí)蛋白微粒的表面疏水性有所減小。

持水性（Water Holding Capacity，WHC）是代表著蛋白質(zhì)吸收水分的能力，這是蛋白質(zhì)在食品加工中非常重要的指標(biāo)之一。表2顯示，隨著的壓力的增加大豆分離蛋白微粒的持水性先增加后減小，但較天然大豆分離蛋白均大幅度減小。蛋白微粒的持水性與蛋白質(zhì)構(gòu)象、氨基酸組成、表面疏水性等相關(guān)[22]。經(jīng)過高壓均質(zhì)處理后，由于其壓力和剪切力的作用使蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)暴露，減少了水結(jié)合位點(diǎn)，從而降低了其水吸收能力[23]。

持油性（Oil Holding Capacity，OHC）在食品加工應(yīng)用中也是很重要的指標(biāo)，它可以增加香味物質(zhì)的持久性、改善食品的口感等。由表2可知，隨著壓力的增加，大豆分離蛋白的持油性均高于天然大豆分離蛋白，在100 MPa時(shí)持油性增加了約123.76%，在經(jīng)過高壓高剪切處理天然大豆分離蛋白后，其蛋白結(jié)構(gòu)展開，疏水基團(tuán)暴露可以和更多脂肪相互作用。大多數(shù)天然蛋白質(zhì)具有疏水中心，它無(wú)法與溶劑和環(huán)境接觸的極性表面發(fā)生相互作用[24]。但由于蛋白質(zhì)經(jīng)過壓力與剪切力的處理，使得疏水中心的氨基酸參與了反應(yīng)，因此増加了大豆分離蛋白微粒的持油性。

表2 不同均質(zhì)壓力下大豆分離蛋白微粒的功能性質(zhì)

2.3 壓力對(duì)大豆分離蛋白微粒熱穩(wěn)定性的影響

通過采用差式掃描量熱儀表征不同高壓均質(zhì)壓力條件下的大豆分離蛋白的熱力學(xué)特性，比較了天然大豆分離蛋白和大豆分離蛋白微粒的變性溫度（）和熱焓值（Δ）。表3顯示，隨著壓力的增加，大豆分離蛋白的變性溫度差值不大，波動(dòng)范圍僅在10 ℃以內(nèi)。同時(shí)，不同壓力條件下的大豆分離蛋白的熱焓值（Δ）與天然大豆分離蛋白相比均有所提高，但壓力為60 MPa與天然大豆分離蛋白的焓值無(wú)明顯變化。這種現(xiàn)象主要是因?yàn)閴毫ζ茐牧说鞍椎臉?gòu)象，導(dǎo)致蛋白質(zhì)熱焓值改變，說(shuō)明維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的氫鍵斷裂，發(fā)生的吸熱反應(yīng)更強(qiáng)烈，熱焓值較天然大豆分離蛋白有所增加。劉麗莉等[25]也得到了與本文相似的研究結(jié)果。

表3 不同均質(zhì)壓力下大豆分離蛋白微粒的熱穩(wěn)定性

2.4 大豆分離蛋白微粒二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析

由圖2可知，大豆分離蛋白在酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶、酰胺Ⅲ帶均有振動(dòng)[26]，波數(shù)在1 300 cm-1左右有明顯吸收峰出現(xiàn)，這表明在C-H面內(nèi)產(chǎn)生彎曲振動(dòng)，C-O、C-X（鹵素）等伸縮振動(dòng)，以及C-C單鍵骨架振動(dòng)等，波數(shù)在1 500 cm-1左右，該區(qū)主要包括C=C，C=N，N=N，N=O等的伸縮振動(dòng)以及苯環(huán)的骨架振動(dòng)（C=C），波數(shù)在3 300 cm-1左右，這代表不飽和碳（三鍵和雙鍵、苯環(huán)）上的C-H的伸縮振動(dòng)[27]，而這些峰并沒有在天然大豆分離蛋白中出現(xiàn)，這表明經(jīng)過高壓均質(zhì)處理過后的蛋白內(nèi)部發(fā)生變性。由表4可以看出，經(jīng)過不同壓力處理后的大豆分離蛋白微粒-螺旋、-轉(zhuǎn)角、-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲均發(fā)生變化，其中-螺旋和-轉(zhuǎn)角含量均有所下降，-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲含量均提高，蛋白經(jīng)過高壓以及剪切力的處理，氫鍵會(huì)產(chǎn)生斷裂現(xiàn)象，使蛋白發(fā)生了部分變性，因此其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因與文獻(xiàn)[28]研究的結(jié)論一致。

表4 不同均質(zhì)壓力下大豆分離蛋白微粒的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成及含量

2.5 大豆分離蛋白微粒表面疏水性

表面疏水性被用于測(cè)定蛋白微粒三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，表征蛋白內(nèi)部疏水基團(tuán)的變化，這會(huì)進(jìn)一步影響蛋白的功能特性[29]。如圖3所示，隨著壓力的增加，大豆分離蛋白的表面疏水性均顯著提高（<0.05），因此經(jīng)過高壓處理過的蛋白，大蛋白質(zhì)聚集體被破壞，其部分結(jié)構(gòu)會(huì)展開，內(nèi)部的疏水基團(tuán)大量暴露。當(dāng)壓力達(dá)到一定程度時(shí)，大豆蛋白的分子間就會(huì)出現(xiàn)解聚集現(xiàn)象，變成更小的亞基單位，蛋白質(zhì)分子的二硫鍵、靜電相互作用和氫鍵被破壞，蛋白質(zhì)分子展開，蛋白質(zhì)內(nèi)部極性基團(tuán)和疏水基團(tuán)被暴露出來(lái)，這一定程度增強(qiáng)了溶劑與分子的相互作用，從而使得溶解性提高[30]。

2.6 大豆分離蛋白微粒的微觀形貌

不同壓力條件下的的大豆分離蛋白樣品SEM圖像（500倍和1 000倍）如圖4a所示。從圖中可以看出未經(jīng)過高壓均質(zhì)的大豆分離蛋白粒子呈聚集狀態(tài)，球狀的表面向內(nèi)凹陷，在經(jīng)過高壓及剪切力的處理后均呈碎片狀態(tài)，分子聚集形成更多的片層塊狀結(jié)構(gòu)，表面光滑。研究結(jié)果表明經(jīng)過高壓均質(zhì)處理處理可使蛋白質(zhì)球狀致密結(jié)構(gòu)遭到了破壞，使蛋白肽鏈打開，冷凍干燥后其形成無(wú)規(guī)則的團(tuán)聚，產(chǎn)生不同形狀和大小的塊狀結(jié)構(gòu)，質(zhì)地變得疏松。這一結(jié)果與趙飛[13]得到的結(jié)論一致。圖4b顯示當(dāng)放大倍數(shù)為1 000倍時(shí)大豆蛋白微粒呈現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，形成這種凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的原因可能是由于疏水基團(tuán)等作用力纏結(jié)所形成的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)壓力為70 MPa時(shí)其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分布較均一且緊密，當(dāng)壓力增加到80～100 MPa時(shí)，孔隙越來(lái)越大，此時(shí)具有高度開放的微納米孔隙結(jié)構(gòu)[31]。

3 結(jié) 論

1）經(jīng)過高壓均質(zhì)制備成大豆分離蛋白微粒，其粒徑大幅度減小，分散性指數(shù)及Zeta電位絕對(duì)值也隨之增加。因此蛋白的功能性質(zhì)均明顯增加，其中當(dāng)壓力達(dá)到100 MPa時(shí)，大豆分離蛋白微粒溶解性達(dá)到最大值，較天然大豆分離蛋白溶解性提高172.98%，乳化活性和乳化穩(wěn)定性最大分別增加了約28.71%和77.82%，在100 MPa時(shí)持油性提高了約123.76%，而持水性有所降低。蛋白質(zhì)的粒徑減小，溶解性提高，有利于其在食品加工中應(yīng)用。

2）在高壓和高剪切力的作用下，部分蛋白內(nèi)部發(fā)生變性，表面疏水性增加，因此大豆分離蛋白微粒的疏水基團(tuán)大量暴露，同時(shí)由Zeta電位可以看出經(jīng)過高壓均質(zhì)處理后蛋白分子間靜電斥力增加，-螺旋和-轉(zhuǎn)角向-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化是蛋白質(zhì)的溶解性及功能性質(zhì)提高的主要原因。

[1] 江連洲，楊宗瑞，任雙鶴，等.空化射流對(duì)大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)及乳化特性的影響[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2021，37(3)：302-311.

Jiang Lianzhou, Yang Zongrui, Ren Shuanghe, et al. Effects of cavitation jet on the structure and emulsification characteristics of soybean protein isolate[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(3): 302-311. (in Chinese with English abstract)

[2] Wang C X, Yin H, Zhao Y Y, et al. Optimization of high hydrostatic pressure treatments on soybean protein isolate to improve its functionality and evaluation of its application in yogurt[J]. Foods, 2021, 10(3): 667-667.

[3] Nishinari K, Fang Y, Guo S, et al. Soy proteins: A review on composition, aggregation and emulsification[J]. Food Hydro-colloids, 2014, 39(2):301-318.

[4] 張?zhí)? 微顆?；蠖沟鞍椎闹苽鋄D]. 廣州：華南理工大學(xué)，2018.

Zhang Tao. Preparation of Micro-granulated Soy Protein[D]. Guangzhou: South China University of Technology, 2018. (in Chinese with English abstract)

[5] 蘇芳萍. 蛋清蛋白微顆粒及其再制凝膠性質(zhì)研究[D]. 廣州：華南理工大學(xué)，2018.

Su Fangping. Study on the Properties of Egg White Protein Microparticles and Its Reconstituted Gel[D]. Guangzhou: South China University of Technology, 2018. (in Chinese with English abstract)

[6] 何興芬. 熱處理對(duì)藜麥蛋白質(zhì)功能特性、結(jié)構(gòu)及體外消化的影響[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

He Xingfen. The effect of Heat Treatment on the Functional Properties, Structure and in Vitro Digestion of Quinoa Protein[D]. Lanzhou:Gansu Agricultural University, 2020. (in Chinese with English abstract)

[7] Song Y L, Qin R Q, Yang S M, et al. Improvement of foaming and emulsifying properties of gluten by conjugation with fructose through maillardreaction[J]. Grain Oil Science and Technology, 2018, 1(3):119-125.

[8] 林素麗. 超高壓處理對(duì)米糠蛋白功能及結(jié)構(gòu)特性的影響研究[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2017.

Lin Suli.The Effect of Ultra-high Pressure Treatment on the Function and Structural Properties of Rice Bran Protein[D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2017. (in Chinese with English abstract)

[9] 段慶松，段玉敏，肖志剛，等. 擠壓穩(wěn)定化處理對(duì)米糠各組分蛋白結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2020，36(19)：283-290.

Duan Qingsong, Duan Yumin, Xiao Zhigang, et al. Effects of extrusion stabilization treatment on the protein structure and functional properties of rice bran components[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(19): 283-290. (in Chinese with English abstract)

[10] 許艷華，趙光遠(yuǎn)，敬思群，等. 高壓微射流對(duì)大豆分離蛋白化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的影響[J]. 食品工業(yè)，2018，39(3)：44-48.

Xu Yanhua, Zhao Guangyuan, Jing Siqun, et al. The effect of high-pressure microjet on the chemical properties and structure of soybean protein isolate[J].Food Industry, 2018, 39(3): 44-48. (in Chinese with English abstract)

[11] 朱明明，寧方建，溫平威，等. 高壓微射流處理對(duì)大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)功能特性及其乳液性質(zhì)的影響[J]. 中國(guó)油脂，2020，45(1)：61-67.

Zhu Mingming, Ning Fangjian, Wen Pingwei, et al. Effects of high-pressure micro-jet treatment on the structural and functional properties of soy protein isolate and the properties of its emulsion[J]. China Oils and Fats, 2020, 45(1): 61-67. (in Chinese with English abstract)

[12] Zheng T, Li X H, Ahmed T, et al. Effect of high intensity ultrasound on the structure and physicochemical properties of soy protein isolates produced by different denaturation[J]. Food Hydrocolloids, 2019, 97: 105216.

[13] 趙飛. 物理預(yù)處理對(duì)大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的影響機(jī)制[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

Zhao Fei. The Influence Mechanism of Physical Pretreatment on the Structure and Physical and Chemical Properties of Soybean Protein Isolate[D]. Tai'an: Shandong Agricultural University, 2019. (in Chinese with English abstract)

[14] 孫領(lǐng)鴿，毛曉英，吳慶智，等. 蛋白質(zhì)氧化對(duì)核桃蛋白界面性質(zhì)的影響[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2020，20(9)：59-66.

Sun Lingge, Mao Xiaoying, Wu Qingzhi, et al.The effect of protein oxidation on the interface properties of walnut protein[J]. Chinese Journal of Food Science, 2020, 20(9): 59-66. (in Chinese with English abstract)

[15] 范麗麗，竇博鑫，張曉琳，等. 大豆7S球蛋白的MTGase條件對(duì)其表面疏水性與功能特性、溶液性質(zhì)的影響及相關(guān)性分析[J]. 食品工業(yè)科技，2020，41(5)：52-57，62.

Fan Lili, Dou Boxin, Zhang Xiaolin, et al. The influence of mtgase conditions of soybean 7S globulin on its surface hydrophobicity, functional properties, solution properties and correlation analysis[J]. Food Industry Science and Technology, 2020, 41(5): 52-57, 62. (in Chinese with English abstract)

[16] 李朝陽(yáng)，竇中友，顧新禹，等. 高壓均質(zhì)協(xié)同殼聚糖萃取對(duì)乳清水中大豆蛋白結(jié)構(gòu)和功能性的影響[J]. 食品工業(yè)科技，2021，42(4)：55-59，120.

Li Chaoyang, Dou Zhongyou, Gu Xinyu, et al. The effect of high pressure homogenization and chitosan extraction on the structure and functionality of soy protein in whey water[J]. Science and Technology of Food Industry, 2021, 42(4): 55-59, 120. (in Chinese with English abstract)

[17] 王娜，吳長(zhǎng)玲，陳凡凡，等. 高壓均質(zhì)對(duì)大豆分離蛋白-大豆異黃酮相互作用及其復(fù)合物功能性質(zhì)的影響[J]. 食品科學(xué)，2020，41(19)：146-153.

Wang Na, Wu Changling, Chen Fanfan, et al. Effects of high pressure homogenization on the interaction of soy protein isolate-soy isoflavones and the functional properties of the complex[J]. Food Science, 2020, 41(19): 146-153. (in Chinese with English abstract)

[18] 王笑宇，韓東，陳子凈，等. 超聲處理對(duì)-伴大豆球蛋白乳化性能的影響[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2018，18(6)：153-159.

Wang Xiaoyu, Han Dong, Chen Zijing, et al. Effects of ultrasonic treatment on emulsification properties of-conglycinin[J]. Chinese Journal of Food Science, 2018, 18(6): 153-159. (in Chinese with English abstract)

[19] 韓莛璐. 高壓均質(zhì)和超聲處理對(duì)酪蛋白和乳清蛋白結(jié)構(gòu)及功能特性的研究[D]. 濟(jì)南：山東師范大學(xué)，2020.

Han Yulu. Study on the Structural and Functional Properties of Casein and Whey Protein by High-pressure Homogenization and Ultrasonic Treatment[D]. Jinan: Shandong Normal University, 2020. (in Chinese with English abstract)

[20] 郭增旺，郭亞男，李柏良，等. 高壓均質(zhì)條件下大豆蛋白熱聚集體結(jié)構(gòu)和乳化特性研究[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)，2021，52(4)：351-358，374.

Guo Zengwang, Guo Yanan, Li Boliang, et al. Research on the structure and emulsification characteristics of soybean protein thermal aggregates under high pressure homogenization conditions[J]. Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery, 2021, 52(4): 351-358, 374. (in Chinese with English abstract)

[21] Xu Y Y, Wang G R, Wang X B, et al. Effects of homogenization on the molecular flexibility and emulsifying properties of soy protein isolate[J]. Food Science and Biotechnology, 2018, 27(5): 1293-1299.

[22] 齊寶坤，李楊，王中江，等. 不同品種大豆分離蛋白Zeta電位和粒徑分布與表面疏水性的關(guān)系[J]. 食品科學(xué)，2017，38(3)：114-118.

Qi Baokun, Li Yang, Wang Zhongjiang, et al. The relationship between zeta potential and particle size distribution of different varieties of soybean protein isolate and surface hydrophobicity[J]. Food Science, 2017, 38(3): 114-118. (in Chinese with English abstract)

[23] 王喜波，徐曄曄，于潔，等. 高壓均質(zhì)對(duì)大豆蛋白柔性和乳化性的影響及相關(guān)性分析[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)，2018，49(6)：362-367.

Wang Xibo, Xu Yeye, Yu Jie, et al. The effect of high pressure homogenization on the flexibility and emulsification of soybean protein and its correlation analysis[J].Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery, 2018, 49(6): 362-367. (in Chinese with English abstract)

[24] 白銀，高悅，王中江，等. 射流空化對(duì)大豆分離蛋白的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的影響[J]. 食品科學(xué)，2020，41(7)：110-116.

Bai Yin, Gao Yue, Wang Zhongjiang, et al. The effect of jet cavitation on the physical and chemical properties and structure of soybean protein isolate[J].Food Science, 2020, 41(7): 110-116. (in Chinese with English abstract)

[25] 劉麗莉，陳珂，李媛媛，等. 噴霧干燥入口溫度對(duì)雞蛋清蛋白粉功能特性和結(jié)構(gòu)的影響[J]. 河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2020，41(6)：65-72，7-8.

Liu Lili, Chen Ke, Li Yuanyuan, et al. The effect of spray drying inlet temperature on the functional properties and structure of egg albumin powder[J]. Journal of Henan University of Science and Technology: Natural Science Edition, 2020, 41(6): 65-72, 7-8. (in Chinese with English abstract)

[26] 王娜. 米糠蛋白聚集體及其成膜特性研究[D]. 沈陽(yáng)：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

Wang Na. Study on Rice Bran Protein Aggregates and Their Film-forming Characteristics[D]. Shenyang: Shenyang Agricultural University, 2020. (in Chinese with English abstract)

[27] 黃朝波. 光量子對(duì)牛血清白蛋白影響的研究[D]. 天津：天津科技大學(xué)，2019.

Huang Chaobo. The Effect of Light Quantum on Bovine Serum Albumin[D]. Tianjin: Tianjin University of Science and Technology, 2019. (in Chinese with English abstract)

[28] 沈玲玲. 超聲預(yù)處理對(duì)植物蛋白生物利用度的影響及其機(jī)制研究[D]. 鎮(zhèn)江：江蘇大學(xué)，2019.

Shen Lingling. The Effect of Ultrasonic Pretreatment on the Bioavailability of Plant Protein and Its Mechanism[D]. Zhenjiang: Jiangsu University, 2019. (in Chinese with English abstract)

[29] 楊懷杰. 超聲及糖化處理對(duì)牛血清白蛋白纖維化聚集行為的影響機(jī)制[D]. 廣州：華南理工大學(xué)，2019.

Yang Huaijie. The Influence Mechanism of Ultrasound and Saccharification on the Fibrotic Aggregation Behavior of Bovine Serum Albumin[D]. Guangzhou: South China University of Technology, 2019. (in Chinese with English abstract)

[30] Tan M N, Xu J J, Gao H L, et al. Effects of combined high hydrostatic pressure and pH-shifting pretreatment on the structure and emulsifying properties of soy protein isolates[J]. Journal of Food Engineering, 2021, 306: 110622.

[31] 吳雪微. 常溫即食鰱魚糜制品的加工技術(shù)研究[D]. 無(wú)錫：江南大學(xué)，2017.

Wu Xuewei. Research on Processing Technology of Instant Silver Carp Surimi Products at Room Temperature[D]. Wuxi: Jiangnan University, 2017. (in Chinese with English abstract)

Preparation and functional properties of soy protein isolate particles by high pressure homogenization-freeze drying technology

Xiao Zhigang1,2, Wang Yifan1, Wang Kexin1, Duan Qingsong2, Zhu Minpeng1, Huo Jinjie1, Jiang Ruisheng1, Li Hang1, He Dong1, Gao Yuzhe1※

(1.,,110034,; 2.,,110886,)

This study aims to improve the PDI and functional properties of soy protein isolate. The high-pressure homogenization combined with freeze-drying was used to prepare soy protein isolate particles. A structure-activity relationship was established to clarify the effect of pressure on the properties and structure of soy protein isolate particles after preparation. The results showed that the average particle size of soy protein isolate was greatly reduced, with the gradual increase of pressure, where the distribution curve of particle size moved to the left. The particle size of soy protein isolate was reduced by about 1 631% at 100 MPa, indicating a much wider curve distribution of particle size, compared with natural soy protein isolate. The PDI and functional properties of soy protein isolate particles were significantly improved, with the increase of pressure in the range of 60-100 MPa. The solubility of soy protein at 100 MPa, emulsifying activity, emulsification, and oil retention increased by 172.98%, 28.71%, 77.82%, and 123.76%, respectively, while the foam height also increased with time.The reason was that the unfolding of protein structure and enhanced surface hydrophobicity allowed the protein to be rapidly adsorbed at the air-water interface. Scanning electron micrograph demonstrated that there was an aggregated state in the soy protein isolate particles that had not been homogenized under high pressure, indicating that the spherical surface was recessed inward. Correspondingly, the soy protein isolate particles presented a network structure after the high-pressure combined freeze-drying process. The hydrophobic groups of soy protein isolate particles were exposed to a large amount, where the surface charge enhanced as the electrostatic repulsion increased, namely the surface hydrophobicity increased under the action of high pressure and shear force. The solubility and the improved functional properties depended mainly on the transformation of-helix and-turn to-sheet and random coil structure. It was a benefit to improve the functional properties and structural characteristics of soy protein. The finding can provide a sound theoretical basis in the extensive application of the food industry.

protein; pressure; soy protein isolate; microparticle; solubility; functional properties

肖志剛，王依凡，王可心，等. 高壓均質(zhì)-冷凍干燥技術(shù)制備大豆分離蛋白微粒及其功能特性[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2021，37(13)：306-313.

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.13.035 http://www.tcsae.org

Xiao Zhigang, Wang Yifan, Wang Kexin, et al. Preparation and functional properties of soy protein isolate particles by high pressure homogenization-freeze drying technology[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(13): 306-313. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.13.035 http://www.tcsae.org

2021-01-19

2021-06-08

國(guó)家自然科學(xué)基金（32072139）；遼寧省農(nóng)業(yè)攻關(guān)及產(chǎn)業(yè)化指導(dǎo)計(jì)劃項(xiàng)目（2019JH8/10200020）；遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目-區(qū)域創(chuàng)新聯(lián)合基金（2020-YKLH-35）；遼寧省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（1584949193607）；沈陽(yáng)師范大學(xué)博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目（BS201517）

肖志剛，博士，教授，研究方向?yàn)榧Z食油脂及植物蛋白工程。Email：zhigangx@163.com

高育哲，博士，講師，研究方向?yàn)榧Z食油脂及植物蛋白工程。Email：gaoyuzhe_66@163.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.13.035

TS214.2

A

1002-6819(2021)-13-0306-08