糖基化大豆分離蛋白納米乳液的制備及其穩(wěn)定性研究

趙晨宇，布冠好，陳復(fù)生，于 珍

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

大豆蛋白來源豐富，價(jià)格低廉，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值[1]和較好的功能性質(zhì)[2-3]，是一種比較理想的植物蛋白類乳化劑，但在極端環(huán)境中蛋白質(zhì)容易變性，難以維持體系的穩(wěn)定性，因此通常與其他乳化劑結(jié)合[4]或采用改性等方式[5-6]，提高體系對抗環(huán)境變化的能力。糖基化是一種綠色、安全的改性技術(shù)，通過適當(dāng)?shù)母蔁峄驖駸崽幚恚軌虼偈沟鞍踪|(zhì)的游離氨基與還原糖的羰基共價(jià)結(jié)合[7]，改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，有利于提高蛋白質(zhì)的乳化特性[8]。通常分子量較小的單糖或二糖具有較高的反應(yīng)活性，能夠在短時(shí)間內(nèi)生成更多的共價(jià)復(fù)合物[9-10]，同時(shí)也很容易生成美拉德反應(yīng)副產(chǎn)物[11]；分子量較大的多糖具有較高的空間位阻效應(yīng)，對蛋白質(zhì)乳化特性的改善效果更好，但接枝效率較低，反應(yīng)時(shí)間較長[12-14]。

低聚半乳糖是一類由半乳糖基和葡萄糖基構(gòu)成的寡糖類混合物，在人母乳中含量較多[15]。因具有調(diào)節(jié)腸道菌群、改善腸道功能、調(diào)節(jié)免疫的能力[16-18]，一般用于生產(chǎn)嬰幼兒配方乳粉。另外，低聚半乳糖分子量適中，具有較好的酸、熱穩(wěn)定性，并且能與蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)[19]，有效降低蛋白質(zhì)的致敏性[20]。因此，作者旨在通過濕熱糖基化制備大豆分離蛋白-低聚半乳糖共價(jià)復(fù)合物，再以復(fù)合物為乳化劑制備納米乳液，研究酸、鹽離子、溫度對乳液穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白：河南省鯤華生物技術(shù)有限公司；低聚半乳糖：上海源葉生物科技有限公司；大豆油：益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司；其余試劑：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-6D型電泳儀：北京市六一儀器廠；TU-1901紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；AH-BASIC 100高壓均質(zhì)機(jī)：德國ATS儀器公司；ZS90納米粒度電位儀：英國Malvern Instruments Ltd。

1.3 方法

1.3.1 糖基化產(chǎn)物的制備

稱取一定質(zhì)量的大豆分離蛋白溶于0.05 mmol/L、pH 10.0的硼砂緩沖液中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的溶液，攪拌過夜，按照質(zhì)量比1∶ 1添加低聚半乳糖，磁力攪拌30 min后，80 ℃恒溫水浴一定時(shí)間，立即采用冰水浴終止反應(yīng)，4 ℃下透析48 h，冷凍干燥，得到不同反應(yīng)程度的糖基化產(chǎn)物，儲(chǔ)存于-20 ℃的冰箱備用。

1.3.2 納米乳液的制備

稱取質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的樣品和0.02%的疊氮鈉，添加去離子水，磁力攪拌2 h后，加入5% (V/V)的大豆油，以12 000 r/min剪切2 min，然后在50 MPa條件下均質(zhì)1 min，得到納米乳液[21]。

1.3.3 接枝度的測定

采用鄰苯二甲醛法。參考Wang等[6]的方法略有改動(dòng)，根據(jù)賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算游離氨基含量。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)下糖基化產(chǎn)物的接枝度按下式計(jì)算。

式中：C0和Ci分別表示反應(yīng)時(shí)間為0 min和imin的游離氨基含量，mol/L。

1.3.4 褐變程度及中間產(chǎn)物的測定

參考Kim等[22]的方法略有改動(dòng)。以10% SDS和0.05 mol/L硼砂的溶液為稀釋液，褐變程度以420 nm處的吸光度表示，中間產(chǎn)物以294 nm處的吸光度表示。

1.3.5 溶解度的測定

采用考馬斯亮藍(lán)G250染色法。參考周洋瑩等[23]的方法略做修改，配制5 mg/mL的蛋白溶液，4 500 r/min離心10 min，上清液為試樣待測液。根據(jù)牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)溶解度按下式計(jì)算。

1.3.6 乳化特性的測定

參考Ma等[5]的方法略做修改。乳化活性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)按下式計(jì)算。

式中：N表示稀釋倍數(shù)；θ表示油相體積比；L表示比色皿厚度，cm；C表示蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL；A0、A10分別表示0 min和10 min的吸光度；10為2次測定的時(shí)間間隔，min。

1.3.7 SDS-PAGE測定

參考曹靜等[12]的方法略做修改。配制蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL的樣品溶液，選用4%的濃縮膠和8%的分離膠，采用考馬斯亮藍(lán)染色液對凝膠進(jìn)行染色。

1.3.8 乳液粒徑、分散指數(shù)(PDI)及電位的測定

采用納米粒度及Zeta電位分析儀測定乳液的平均粒徑、PDI及Zeta電位。儀器參數(shù)：折射率1.450，測試溫度25 ℃，平衡時(shí)間120 s，每個(gè)樣品測試3次[4]。

1.3.9 納米乳液穩(wěn)定性測定

酸處理：取適量乳液用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH至6.0。采用1.3.8中的方法測定乳液粒徑變化，然后取5 mL于比色管中，室溫(25 ℃±2 ℃)放置1周后記錄乳液外觀。

熱處理：取適量乳液在80 ℃條件下處理30 min，冷卻至室溫，然后按上述方法測定乳液穩(wěn)定性。

鹽離子處理：取適量乳液與300 mmol/L NaCl溶液等體積混合，然后按上述方法測定乳液穩(wěn)定性。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0和Origin 2019軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖基化反應(yīng)程度

反應(yīng)時(shí)間對接枝度、褐變程度及中間產(chǎn)物的影響如圖1所示。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，SPI與GOS的接枝度逐漸增加，最高達(dá)到43.23%；褐變程度及中間產(chǎn)物均呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢。原因可能是在反應(yīng)初期，SPI的游離氨基基團(tuán)不斷暴露，并與GOS的羰基基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，引起接枝度、褐變程度及中間產(chǎn)物的增加；而在反應(yīng)180 min后，接枝度持續(xù)增加，褐變程度趨于穩(wěn)定，而中間產(chǎn)物有所減少，說明糖基化反應(yīng)可能向著更高的階段進(jìn)行[24]。

注：不同字母表示同一組數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異，P<0.05。圖1 反應(yīng)時(shí)間對接枝度、褐變程度及中間產(chǎn)物的影響Fig.1 Effect of reaction time on grafting degree, browning degree and intermediate products

2.2 糖基化產(chǎn)物的功能特性

2.2.1 溶解度

蛋白質(zhì)的溶解度決定了其在食品中的應(yīng)用范圍。由圖2可知，糖基化反應(yīng)可顯著提高SPI在酸性條件下的溶解度。在pH 5條件下，溶解度的提高最為顯著，且隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而升高，反應(yīng)240 min時(shí)溶解度為35.67%，相比同條件下SPI溶解度(0.26%)，提高了136倍。這與趙城彬等[9]采用葡萄糖和麥芽糖對大豆分離蛋白進(jìn)行糖基化改性的研究結(jié)果一致。Saatchi等[25]認(rèn)為這可能是因?yàn)樘腔磻?yīng)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)合的親水性羥基增加，減弱了蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)與水分子的親和力，從而改善了蛋白質(zhì)的溶解度。

注：SPI為大豆分離蛋白；SPI-GOS 90～240 min為不同反應(yīng)時(shí)間的糖基化大豆分離蛋白。不同字母表示同一pH值下各樣品之間存在顯著性差異，P<0.05。圖2 不同pH值下SPI及其糖基化產(chǎn)物的溶解度Fig.2 Solubility of SPI and glycated products at different pH values

2.2.2 乳化特性

由圖3可知，糖基化產(chǎn)物的乳化活性隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，乳化活性最高達(dá)到20.73 m2/g，較SPI(18.26 m2/g)提高了13.52%；乳化穩(wěn)定性隨反應(yīng)時(shí)間的增加也有一定程度的提高，乳化穩(wěn)定性最高達(dá)到17.84 min，較SPI(14.62 min)提高了22.02%，這與周洋瑩等[23]的研究結(jié)果一致。一方面，糖基化反應(yīng)提高了蛋白質(zhì)在水相中的溶解度，可能加速了蛋白質(zhì)在油水界面的吸附速率；另一方面，糖基化反應(yīng)導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，這也是乳化性提高的原因之一[26]。

注：不同字母表示同一組數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異，P<0.05。圖3 反應(yīng)時(shí)間對糖基化產(chǎn)物乳化特性的影響Fig.3 Effect of reaction time on emulsification of glycated products

2.3 糖基化產(chǎn)物的分子量分布

由圖4可知，SPI與GOS經(jīng)糖基化反應(yīng)后，各亞基條帶顏色逐漸變淺，而在濃縮膠與分離膠交界處產(chǎn)生了新的條帶，說明蛋白與糖發(fā)生反應(yīng)生成了大分子聚合物；隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，濃縮膠與分離膠交界處的條帶逐漸變淺，說明隨著糖基化反應(yīng)的進(jìn)行，可能生成了更多的大分子聚合物，且由于分子量較大難以進(jìn)入分離膠[27]。

注：M為標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白；1-7分別為SPI、SPI-GOS(反應(yīng)時(shí)間分別為90、120、150、180、210、240 min)糖基化產(chǎn)物。圖4 不同反應(yīng)時(shí)間下糖基化產(chǎn)物的SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE of glycated products at different reaction time

2.4 納米乳液的理化特性表征

2.4.1 平均粒徑、PDI及Zeta電位

納米乳液的平均粒徑、PDI及Zeta電位如表1所示，與單獨(dú)SPI穩(wěn)定的納米乳液相比，SPI-GOS共價(jià)復(fù)合物穩(wěn)定的納米乳液平均粒徑及PDI均顯著減小，Zeta電位絕對值顯著增加。說明SPI-GOS共價(jià)復(fù)合物具有更好的乳化能力，可能是共價(jià)接枝的糖鏈提高了乳滴之間的靜電斥力，從而使乳液更加穩(wěn)定。

2.4.2 粒徑分布

SPI及其糖基化反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定的納米乳液粒徑分布如圖5所示。從圖5可以看出，單獨(dú)SPI穩(wěn)定的納米乳液粒徑呈雙峰分布，糖基化產(chǎn)物穩(wěn)定的納米乳液均呈單峰分布，且都偏向粒徑較小的方向，這與表1相對應(yīng)。

圖5 SPI及其糖基化產(chǎn)物納米乳液的粒徑分布Fig.5 Particle size distribution of nanoemulsions stabilized by SPI and glycated products

表1 SPI及糖基化產(chǎn)物納米乳液的平均粒徑、PDI及Zeta電位Table 1 Average particle size, PDI and Zeta potential of nanoemulsions stabilized by SPI and glycated products

2.5 納米乳液穩(wěn)定性分析

2.5.1 酸穩(wěn)定性

酸處理對SPI及其糖基化產(chǎn)物穩(wěn)定的納米乳液平均粒徑、PDI及粒徑分布的影響如圖6所示。

由圖6a可知，在酸性環(huán)境中，SPI穩(wěn)定的納米乳液的平均粒徑和PDI與處理前相比(表1)明顯增大，而糖基化產(chǎn)物穩(wěn)定的納米乳液均無明顯變化。從圖6b可以看出，經(jīng)酸處理后，SPI穩(wěn)定的乳液粒徑分布明顯向著粒徑較大的方向移動(dòng)，而糖基化產(chǎn)物穩(wěn)定的乳液仍呈單峰分布。

圖6 酸處理后納米乳液的平均粒徑、PDI及粒徑分布Fig.6 Average particle size, PDI and particle size distribution of acid-treated nanoemulsion

2.5.2 鹽離子穩(wěn)定性

鹽離子對SPI及其糖基化產(chǎn)物穩(wěn)定的納米乳液平均粒徑、PDI及粒徑分布的影響如圖7所示。由圖7a可知，加入鹽離子后，SPI及糖基化產(chǎn)物穩(wěn)定的納米乳液的平均粒徑、PDI相比處理前(表1)均有不同程度的增加，但隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，糖基化產(chǎn)物穩(wěn)定的納米乳液變化幅度逐漸減小。從圖7b可以看出，經(jīng)鹽離子處理后，所有乳液的粒徑分布均呈現(xiàn)雙峰特征，但糖基化產(chǎn)物穩(wěn)定的乳液粒徑分布更偏向于粒徑較小的方向。

圖7 鹽離子處理后納米乳液的平均粒徑、PDI及粒徑分布Fig.7 Average particle size, PDI and particle size distribution of salt ion-treated nanoemulsion

2.5.3 熱穩(wěn)定性

熱處理對SPI及其糖基化產(chǎn)物穩(wěn)定的納米乳液平均粒徑、PDI及粒徑分布的影響如圖8所示。如圖8a所示，80 ℃處理30 min后，所有乳液的平均粒徑及PDI相比處理前(表1)變化較小。從圖8b可以看出，經(jīng)熱處理后，所有乳液的粒徑均呈雙峰分布，但糖基化產(chǎn)物穩(wěn)定的乳液粒徑分布更偏向于粒徑較小的方向。

圖8 熱處理后納米乳液的平均粒徑、PDI及粒徑分布Fig.8 Average particle size, PDI and particle size distribution of heat-treated nanoemulsion

2.5.4 乳液外觀

酸、鹽離子及熱處理對SPI及其糖基化產(chǎn)物穩(wěn)定的納米乳液外觀的影響如圖9所示。從圖9a、9b可以看出，SPI穩(wěn)定的乳液在酸性和高離子濃度環(huán)境中放置1周后，出現(xiàn)了明顯的絮凝現(xiàn)象，而糖基化產(chǎn)物穩(wěn)定的乳液均未出現(xiàn)絮凝，說明糖基化反應(yīng)能有效提高大豆蛋白基納米乳液的酸穩(wěn)定性和鹽離子穩(wěn)定性，這可能與糖鏈的空間位阻效應(yīng)有關(guān)[28]。從圖9c可以看出，經(jīng)熱處理后所有樣品均未出現(xiàn)明顯的分層現(xiàn)象，只有SPI的試管底部出現(xiàn)了輕微的乳析現(xiàn)象。

圖9 酸、鹽離子及熱處理后納米乳液的外觀Fig.9 Appearance of nanoemulsion after acid, salt ions and heat treatment

3 結(jié)論

選用低聚半乳糖對大豆分離蛋白進(jìn)行糖基化改性，以糖基化產(chǎn)物為乳化劑，制備納米乳液，研究反應(yīng)時(shí)間對大豆分離蛋白及其納米乳液特性的影響。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，接枝度逐漸增加，反應(yīng)240 min，接枝度達(dá)到43.23%；褐變程度及中間產(chǎn)物先增加，后趨于穩(wěn)定；糖基化之后大豆分離蛋白的溶解度最高提高了136倍，乳化活性最高提高了13.52%，乳化穩(wěn)定性最高提高了22.02%；SDS-PAGE表明糖基化反應(yīng)生成了大分子聚合物；粒徑及Zeta電位分析表明，糖基化產(chǎn)物穩(wěn)定的納米乳液粒徑較小，具有更高的靜電斥力，且反應(yīng)時(shí)間越長，糖鏈的空間位阻效應(yīng)越明顯，乳液的酸、鹽離子及熱穩(wěn)定性越好。因此，通過糖基化改性，提高了大豆蛋白基納米乳液的加工環(huán)境穩(wěn)定性，對于生物活性物質(zhì)在納米乳液體系中的包埋、傳遞具有重要意義。