采用分型方法檢測溯源副溶血性弧菌分析

邵守峰 吳學(xué)香

【摘要】目的：采用分型法對副溶血性弧菌進行分析，追溯親緣關(guān)系。方法：共收集1087株副溶血性弧菌，實施血清分型，同時利用脈沖場電泳基因分析以及腸桿菌基因間重復(fù)序列分析追蹤感染源，了解親緣關(guān)系。結(jié)果：來自食物的607例可分為10個血清群，其中0：6血清群最多，占比16.46%，來自病人的480例可分為6個血清群，其中0：3血清群最多，占比72.92%；食品中的377株VP可分為PFGE型25個，病人501株可分為19個，其中最多的為1型（P<0.05）；所有菌株可分為ERIC型42個，其中最多的為18型。結(jié)論：不同分型方法在副溶血性弧菌分型中均具有優(yōu)缺點，多種分型方法聯(lián)合使用可在很大程度上提升分型有效性。

【關(guān)鍵詞】分型法；溯源；副溶血性弧菌

[中圖分類號]R446.5 [文獻標識碼]A [文章編號]2096-5249（2021）03-0001-03

Detection of Vibrio parahaemolyticus by typing

SHAO Shou-feng 1， WU Xue-xiang 2（1. Center for Disease Control and prevention， Huangdao District， Qingdao Shandong 266400， China； 2. Liuwang Central Health Center， Huangdao District， Qingdao Shandong 266400， China）

[Abstract] Objective： To analyze Vibrio parahaemolyticus withtyping method and trace the genetic relationship. Methods： A total of 1087 strains of Vibrio parahaemolyticus were collected and serotyped. Then， pulse field electrophoresis gene analysis and intergenic repeat sequence analysis of enterobacter were used to trace the source of infection and understand the genetic relationship. Results： 607 cases from food can be divided into 10 serogroups， of which 0：6 serogroups is the most， accounting for 16.46%， and 480 cases from patients can be divided into 6 serogroups， of which 0：3 serogroups is the most， accounting for 72.92 %； The 377 strains of Vibrio parahaemolyticus in food can be divided into 25 PFGE types， and the 501 strains of patients can be divided into 19 PFGE types， of which the most is type 1（P<0.05）； All strains can be divided into 42 ERIC types， the most of which is type 18. Conclusion： Different typing methods have their own advantages and disadvantages in the typing of Vibrio parahaemolyticus， and the combined use of multiple typing methods can improve the effectiveness of typing greatly.

[Key words] typing method； look for the roots； Vibrio parahaemolyticus

副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus，VP）存在于某些食品之中，會造成人員由于食用了直接或間接被本菌污染的食品而引起急性胃腸炎，與多數(shù)食品中毒事件息息相關(guān)，是食品安全檢查的重點內(nèi)容[1]。本文對所采集的病株實施血清分型，另用多種方法實施溯源檢測，以期了解菌株流行趨勢以及方法可行性，實現(xiàn)副溶血性弧菌感染的減少和有效防控，研究結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1菌株來源 收集食品來源副溶血性弧菌計607株，收集病人及食物中毒副溶血性弧菌計480株，共收集1087株，將所有菌株實施血清分型，同時利用脈沖場電泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）基因分析以及腸桿菌基因間重復(fù)序列（ERIC-PCR）分析追蹤感染源，了解親緣關(guān)系。

1.2試劑與儀器

1.2.1試劑TCBS瓊脂 （生產(chǎn)企業(yè)：上海恒遠生物科技有限公司）；弧菌顯色培養(yǎng)基（生產(chǎn)企業(yè)：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；蛋白酶K（生產(chǎn)企業(yè)：洛陽惠爾納米科技有限公司）；XbaⅠ酶（生產(chǎn)企業(yè)：寶生物工程（大連）有限公司）；API20E生化鑒定試劑條（生產(chǎn)企業(yè)：法國生物梅里埃股份有限公司）；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（生產(chǎn)企業(yè)：北京鴻潤寶順科技有限公司）；APW（堿性蛋白胨水）培養(yǎng)基（生產(chǎn)企業(yè)：上海廣銳生物科技有限公司）；低熔點瓊脂糖（生產(chǎn)企業(yè)：北京金泰宏達生物科技有限公司）；PFGE專用瓊脂糖（生產(chǎn)企業(yè)：伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司）。

1.2.2儀器脈沖場電泳系統(tǒng) （品牌：伯樂bio-rad；型號：CHEF Mapper XA）；凝膠成像系統(tǒng)（品牌：伯樂biorad；型號：Versa Doc）。

1.3方法

1.3.1菌株分離鑒定 ①分離：使用篩檢法對食品來源副溶血性弧菌實施分離；使用文獻法對病人副溶血性弧菌實施分離。②鑒定：6%堿性蛋白胨水、蔗糖、阿拉伯膠糖、葡萄糖（產(chǎn)氣）為可疑菌株復(fù)篩試劑，若出現(xiàn)6%堿性蛋白胨水、蔗糖陰性、阿拉伯膠糖陽性以及葡萄糖不產(chǎn)氣等菌株則需要使用API20E生化鑒定試劑條進行進一步鑒定。

1.3.2分群 使用生理鹽水清洗純培養(yǎng)物（1%NaCl營養(yǎng)瓊脂所得），后將其置于沸水中，時長控制在20min左右以破壞K抗原，離心處理后制成菌懸液，與VP“O”群分群血清完成作玻片凝集試驗。

1.3.3分型 PFGE分型：①將新鮮培養(yǎng)物置于2mL細胞懸浮液，透射值為20%，后于離心管中置入200μL菌懸液，水浴，溫度為37℃，時長為5min；將10μL蛋白酶K置于混合物中，水浴，溫度為50℃，時長為10min；將1%金瓊脂糖與菌懸液1：1混合，倒入模具，置于4℃下進行冷卻，制成膠塊；②將15μL蛋白酶K置于3mL細胞裂解液，取出膠塊置于細胞裂解液中，水浴，溫度為54℃，時長為2h，棄液，加入5mL純水，水溫50℃，使用50℃TE緩沖液清洗膠塊，15min/次，共4次，在涼至室溫后加入TE緩沖液3mL，于4℃下保存；③150μL酶切體系中置入3mm膠塊，37℃過夜；④酶切樣品置于模具，取1g金瓊脂糖與0.5%TBE緩沖液加熱溶解，在溫度將至60℃后倒入模具，冷卻后取出膠塊，放于0.5%TBE緩沖液電泳槽；⑤實施電泳，時間設(shè)置為19h，脈沖參數(shù)為（2～10s；13h）：（20～25s；6h），電壓每厘米6V，溫度14℃；⑥電泳后取出凝膠，使用Goldview染色，時間為30min，后去離子水脫色，時間為30min；⑦用凝膠成像儀進行讀膠；⑧結(jié)果判定。

ERIC-PCR分型：①制備PCR模板，于營養(yǎng)瓊脂中培養(yǎng)VP，將培養(yǎng)物置于TNE緩沖液，加入0.5%十二烷基磺酸鈉以及100μL蛋白酶K，水浴，溫度為55℃，時長為30min，以1：24：25的比例抽取異戊醇、氯仿以及酚DNA，異丙醇沉淀，使用70%乙醇洗滌，后使用TE緩沖液溶解；②ERIC-PCR分型；③結(jié)果判定。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析軟件選擇為SPSS19.0，軟件中

_x±s表示計量資料，對比使用t檢驗，例（%）則表示計數(shù)資料，對比使用χ2檢驗，若最終得出P<0.05則表示數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1血清分型結(jié)果 對所有1087株副溶血性弧菌實施血清分型，其中來自食物的607例可分為10個血清群，其中存在30株無法實施分型，最終分型率為95.06%，其中0：6血清群最多，占比16.46%；來自病人的480例可分為6個血清群，其中0：3血清群最多，占比72.92%，為流行優(yōu)勢血清群，詳細信息見表1。

2.2 PFGE分型結(jié)果 878株副溶血性弧菌，在PFGE分型步驟完成后其菌株DNA分離情況較佳，具體可分為15～20個條帶，其分子量則在20～700kb范圍內(nèi)。聚類分析結(jié)果顯示，食品中的377株VP可分為PFGE型25個，病人501株VP可分為PFGE型19個，其中最多的為1型，與其他分型比差異明顯（P<0.05）。

2.3 ERIC-PCR分型結(jié)果 261株副溶血性弧菌，其中來自食物141株，來自病人60株，多為食物中毒病人，且菌株經(jīng)聚類分析，結(jié)果顯示，所有菌株可分為ERIC型42個，其中最多的為18型。

3 討論

副溶血性弧菌與流行性胃腸道疾病的發(fā)生有極強的關(guān)聯(lián)性，流行度高，蔓延性強，也是造成食物中毒的關(guān)鍵病株，因此在食品安全檢查中為必檢項目，且食品來源病株與病人來源病株的分離存在一定差異，其致病風(fēng)險還需要相關(guān)部門和人員實施進一步驗證[2]。此次研究最終分型率為95.06%，存在30株無法實施分型，這可能是出現(xiàn)了新的血清群，目前無法將其歸類，因此也說明副溶血性弧菌分型存在一定局限。PFGE 分型主要是是通過電場方向的改變對DNA進行有效分析，具有穩(wěn)定性高、準確性強的優(yōu)勢，即使是菌株間的細小差異也可以進行清晰顯示[3]。ERIC-PCR 分型則是利用弧菌屬細菌以及腸桿菌科與菌種中的短重復(fù)序列不同進行菌株分析，分型有效率高，且在溯源方面優(yōu)勢明顯，因此更能分析出菌株與致病因間的聯(lián)系。

無論是血清分型、PFGE分型亦或是ERIC-PCR分型均可適用于副溶血性弧菌分型分析，但是其中優(yōu)缺點也極為明顯。首先，血清分型采用的是通過血清分型探析病株流行趨勢進而實施溯源，但是該分型方式主要為表型特征的顯示，重復(fù)性不強，可靠性不高，且操作較為復(fù)雜，分型率不高，無法有效應(yīng)用于傳染源追蹤[4]。另外，菌株較易受到環(huán)境影響，一旦出現(xiàn)新血清型就難以分辨，給流行病學(xué)調(diào)查造成阻礙，因此血清分型在追蹤傳染源方面制約性強，且無法有效對暴發(fā)性感染菌株特征加以確定，因此在副溶血性弧菌分型分析中不甚理想。PFGE分型以及ERIC-PCR分型則是直接從DNA入手對副溶血性弧菌實施分型，在分型效果上具有特異性、敏感性強，分辨率、分型率高的優(yōu)勢，這主要是因為DNA所傳達的遺傳信息差異直接決定異種生物、同種生物不同株系的不同，因此成為了現(xiàn)代分型極為重要的手段。就優(yōu)勢而言，與血清分型、核糖體分型、生化分型等方式相比，PFGE分型及ERIC-PCR分型可重復(fù)性強，且操作便捷，分辨率高，更加適用于大樣本檢測。后兩者相比，ERIC-PCR分型的操作便捷性優(yōu)于PFGE，但是需要自行建立分型標準數(shù)據(jù)庫，難度較大，而PFGE分型數(shù)據(jù)庫已經(jīng)存在，因此實用性更強。若想有效實現(xiàn)分型率的提高，相關(guān)工作人員以及部門不僅需要健全操作規(guī)程，還要重視與國內(nèi)外有關(guān)企業(yè)和部門的合作，實現(xiàn)數(shù)據(jù)共享，共同建立準確率高、專業(yè)性強的基因分型數(shù)據(jù)庫，共同推動副溶血性弧菌流行病學(xué)發(fā)展[5]。有研究表明，在進行副溶血性弧菌分型時綜合使用多種分型法可以有效提高分型準確率和速度，進而為食物中毒事件的防控制定及時有效的預(yù)防方案。

綜上所述，不同分型方法在副溶血性弧菌分型中均具有優(yōu)缺點，多種分型方法聯(lián)合使用可在很大程度上提升分型有效性，因此相關(guān)工作者要探求與實際需求相契的有效分型方法，為副溶血性弧菌所致植物中毒防控方案的制定提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻

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