玫瑰花破壁飲片HPLC指紋圖譜及不同工藝樣品比較研究

徐月陽(yáng)，甘均龍，史軍杰，潘均華，彭麗華，成金樂(lè)*

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源科學(xué)與工程研究中心，廣東 廣州 510006； 2. 中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥破壁飲片技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)研究室，廣東 中山 528437；3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué) 嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006；4. 國(guó)家中成藥工程技術(shù)研究中心 南藥研發(fā)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006）

明代姚可成《食物本草》首次記載玫瑰花，其味甘、微苦，性溫，無(wú)毒，主利肺脾、益肝膽、辟邪惡之氣，食之芳香甘美，令人神爽[1]。玫瑰花藥材為薔薇科植物玫瑰Rosa rugosaThunb.的干燥花蕾，具有行氣解郁、和血、止痛的功效，用于肝胃氣痛、食少嘔惡、月經(jīng)不調(diào)、跌撲傷痛[2]等癥的治療。作為藥食同源品種，玫瑰花的主要活性成分為黃酮類、揮發(fā)油類、多糖類、多酚類（主要為沒(méi)食子酸）等[3-9]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，玫瑰花具有抗疲勞、抗氧化、抗病毒、抑菌作用以及提高免疫功能，對(duì)急性心肌缺血損傷的保護(hù)作用等[10-16]。玫瑰花破壁飲片是將符合2020年版《中國(guó)藥典》要求的玫瑰花傳統(tǒng)飲片，經(jīng)現(xiàn)代粉碎技術(shù)加工至粒徑D90＜45 μm以上的粉體，后經(jīng)無(wú)添加成型劑的專利技術(shù)制成30 ～ 100目的干燥顆粒，具有質(zhì)量均一、成分高效利用、服用便捷等特點(diǎn)[17-20]。2020年版《中國(guó)藥典》僅對(duì)玫瑰花藥材的性狀、鑒別和浸出物等進(jìn)行要求，無(wú)法較全面的反映其質(zhì)量特征。中藥指紋圖譜以化學(xué)成分為基礎(chǔ)，能夠較系統(tǒng)、全面地表征中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)概貌[21]。目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)玫瑰花破壁飲片的HPLC指紋圖譜研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)玫瑰花破壁飲片開展HPLC指紋圖譜研究，綜合分析玫瑰花破壁飲片的化學(xué)成分信息，并以相似度評(píng)價(jià)比較玫瑰花傳統(tǒng)飲片到破壁粉體再制成破壁飲片三者之間化學(xué)成分的相關(guān)性以及通過(guò)聚類分析和主成分分析比較玫瑰花破壁飲片小試與大生產(chǎn)工藝樣品的區(qū)別，以期為玫瑰花破壁飲片及其原料的質(zhì)量控制以及玫瑰花破壁飲片生產(chǎn)工藝評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Millipore TM-D24UV型超純水機(jī)（美國(guó)密理博公司）；Waters 2695/2988型高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司）；HWS24型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與試藥

超純水（自制）、甲醇、乙腈（色譜純，安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司）、甲醇、磷酸（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）、沒(méi)食子酸（批號(hào)：110831-200803，純度：90.1%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）、鞣花酸（批號(hào)：MUST-19052603，純度：99.65%，成都曼斯特科技生物有限公司）。

玫瑰花傳統(tǒng)飲片：收集15批（詳見表1）種植基地及主產(chǎn)地玫瑰花原藥材，經(jīng)中藥師賈世清鑒定為薔薇科植物玫瑰Rosa rugosaThunb.的干燥花蕾，原藥材凈制，揀去雜質(zhì)，摘除花柄及蒂，后經(jīng)低溫干燥制成傳統(tǒng)飲片。

表1 玫瑰花樣品信息Tab. 1 Sample information of Rosae Rugosae Flos

玫瑰花破壁粉體及破壁飲片：將上述15批傳統(tǒng)飲片依次通過(guò)氣流粉碎技術(shù)制備成15批破壁粉體（中間體）、再經(jīng)“ 無(wú)添加成型”技術(shù)，進(jìn)一步制備成15批破壁飲片成品（小試工藝樣品）。

20批次大生產(chǎn)玫瑰花破壁飲片：生產(chǎn)批號(hào)依次 為15060203、20151101、20151201、20160301、20160902、16100102、20170302、20170303、17050102、17060202、20171202、20180101、20180103、20190504、20190503、20190502、20190501、20190203、20190202、20190201；樣品編號(hào)依次為UGP16-UGP35。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shiseido CAP Cell MGⅡ C18柱（ 250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序，見表2；流速：0.9 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：300 nm；進(jìn)樣體積：10 μL。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab. 2 Mobile phase gradient elution program

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱定65批玫瑰花樣品各0.5 g，置具塞錐形瓶中，加入80%甲醇25 mL，稱定重量，超聲30 min，取出放冷至室溫，用提取液補(bǔ)足減少的重量，搖勻，用濾紙濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱定鞣花酸、沒(méi)食子酸對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含沒(méi)食子酸 0.08 mg、鞣花酸 0.13 mg的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 取編號(hào)為UGP1的玫瑰花破壁飲片，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液和80%甲醇空白溶液，進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件。結(jié)果顯示空白溶劑在色譜條件下無(wú)對(duì)應(yīng)色譜峰，表明建立的方法專屬性好。

2.3.2 精密度考察 取編號(hào)為UGP1的玫瑰花破壁飲片，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，同一樣品連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄測(cè)定結(jié)果。以1號(hào)峰為參照峰，計(jì)算共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于3%，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性考察 取編號(hào)為UGP1的玫瑰花破壁飲片，平行6份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄測(cè)定結(jié)果。以1號(hào)峰為參照峰，計(jì)算共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于3%，表明分析方法的重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性考察 取編號(hào)為UGP1的玫瑰花破壁飲片，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h檢測(cè)，記錄測(cè)定結(jié)果。以1號(hào)峰為參照峰，計(jì)算共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間均小于3%，表明24 h內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 指紋圖譜采集 分別取15批次玫瑰花傳統(tǒng)飲片（DP1-DP15）、破壁粉體（UP1-UP15）、破壁飲片（UGP1-UGP15）及20批次大生產(chǎn)玫瑰花破壁飲片（UGP16-UGP35），按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，得到HPLC指紋圖譜色譜圖。

2.4.2 共有模式的建立及色譜峰的指認(rèn) 將“2.4.1”項(xiàng)下得到的HPLC指紋圖譜采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”2012版進(jìn)行分析，確認(rèn)共有色譜峰17個(gè)，采用中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜，結(jié)果見圖1-3。通過(guò)與對(duì)照品的保留時(shí)間和紫外吸收峰對(duì)比，指認(rèn)出1號(hào)峰為沒(méi)食子酸，12號(hào)峰為鞣花酸，見圖4。

圖1 15批玫瑰花傳統(tǒng)飲片的指紋圖譜Fig.1 Fingerprints of 15 batches of decoction pieces of Rosae Rugosae Flos

圖2 15批玫瑰花破壁粉體的指紋圖譜Fig.2 Fingerprints of 15 batches of ultrafine powder of Rosae Rugosae Flos

圖3 35批玫瑰花破壁飲片的指紋圖譜Fig.3 Fingerprints of 35 batches of ultrafine granular powder of Rosae Rugosae Flos

圖4 色譜峰的指認(rèn)Fig.4 Identification of chromatographic peaks

2.5 玫瑰花傳統(tǒng)飲片-破壁粉體-破壁飲片化學(xué)成分的相關(guān)性分析

采用上述相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，分別計(jì)算15批玫瑰花傳統(tǒng)飲片、15批破壁粉體、35批破壁飲片的相似度及同批次玫瑰花由傳統(tǒng)飲片到破壁粉體再制成破壁飲片之間的相似度，并生成3種狀態(tài)飲片各自的對(duì)照指紋圖譜、計(jì)算其相似度。結(jié)果表明15批玫瑰花傳統(tǒng)飲片（原料）之間的相似度均大于0.99，15批玫瑰花破壁粉體（ 中間品）之間的相似度均大于0.98，35批玫瑰花破壁飲片（成品）之間的相似度均大于0.98。各批次玫瑰花由傳統(tǒng)飲片到破壁粉體再制成破壁飲片三者之間的相似度均大于0.99，見表3。玫瑰花傳統(tǒng)飲片、破壁粉體和破壁飲片分別生成的共有模式非常相似，如圖5、表4所示三者的相似度大于0.99。上述結(jié)果表明，來(lái)自同一主產(chǎn)地的玫瑰花藥材化學(xué)成分物質(zhì)基礎(chǔ)相較一致，玫瑰花由傳統(tǒng)飲片制成破壁飲片時(shí)，只是外觀形態(tài)發(fā)生改變，各主要化學(xué)成分均較一致，物質(zhì)基礎(chǔ)傳遞好，制備工藝穩(wěn)定。

表3 15批次玫瑰花傳統(tǒng)飲片-破壁粉體-破壁飲片間的相似度Tab. 3 Similarity among the 15 batches of decoction pieces-ultrafine powder-ultrafine granular powder of Rosae Rugosae Flos

表4 共有模式相似度結(jié)果Tab. 4 Similarity results of shared pattern

圖5 15批玫瑰花傳統(tǒng)飲片-15批破壁粉體-35批破壁飲片共有模式比較Fig.5 Shared mode comparison among the 15 batches of decoction pieces of Rosae Rugosae Flos-15 batches ultrafine powder of Rosae Rugosae Flos-35 batches of ultrafine granular powder of Rosae Rugosae Flos

2.6 35批玫瑰花破壁飲片聚類分析和主成分分析

運(yùn)用SPSS 26.0和SIMCA 14.1軟件對(duì)35批玫瑰花破壁飲片樣品進(jìn)行聚類分析和主成分分析。以17個(gè)共有峰的峰面積為變量，采用Ward聯(lián)結(jié)法，選用Z得分對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以平方歐式距離測(cè)量進(jìn)行系統(tǒng)聚類，分析結(jié)果見圖6，結(jié)果顯示，當(dāng)平方歐式距離為15時(shí)，35批樣品被分為2類，其中UGP1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、14聚為一類，其全部為小試工藝制成的玫瑰花破壁飲片。UGP8、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35歸為一類，除UGP8、13、15外，其余全是大生產(chǎn)玫瑰花破壁飲片。以17個(gè)共有峰的峰面積為變量進(jìn)行PCA分析，結(jié)果顯示，2個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到73.4%。從PCA得分圖顯示35批玫瑰花破壁飲片可大致分為兩類，其中12批小試破壁飲片分為一類（除UGP7、13、15），20批大生產(chǎn)破壁飲片分為一類，與聚類分析的結(jié)果基本相一致，得分圖見圖7。為進(jìn)一步確認(rèn)造成分類差異的因素對(duì)其進(jìn)行OPLS-DA分析，分析結(jié)果見圖8，從中更可以直觀的看出將35批破壁飲片分為兩類，提取OPLS-DA模型中變量的VIP圖，分析結(jié)果見圖9，對(duì)17個(gè)共有峰的峰面積進(jìn)行VIP排序，顯示17號(hào)峰（VIP 1.611 67），5號(hào)峰（VIP 1.567 39），10號(hào)峰（VIP 1.374 4），11號(hào)峰（VIP 1.287 63），4號(hào)峰（VIP1.179 83），2號(hào) 峰（VIP 1.063 78），3號(hào) 峰（VIP 1.031 43），9號(hào)峰（VIP 1.028 15）的VIPpred值均大于1，說(shuō)明以上這些化學(xué)成分是造成15批小試制備破壁飲片和20批大生產(chǎn)破壁飲片分類的主要差異性成分。

圖6 35批玫瑰花破壁飲片HCA圖Fig.6 HCA of 35 batches of ultrafine granular powder of Rosae Rugosae Flos

圖7 35批玫瑰花破壁飲片PCA-X得分圖Fig.7 PCA-X scores of 35 batches of ultrafine granular powder of Rosae Rugosae Flos

圖8 35批玫瑰花破壁飲片OPLS-DA得分圖Fig.8 OPLS-DA scores of 35 batches of ultrafine granular powder of Rosae Rugosae Flos

圖9 差異標(biāo)志物的VIP得分圖Fig.9 VIP scores of different markers

3 討論

在供試品的制備方法優(yōu)化中，考察了提取時(shí)間（30、45、60 min）、提取方式（超聲、加熱回流和索氏提取）、提取溶劑（乙醇和50%、70%、80%、100%甲醇）以及料液比（0.5 g∶25 mL、0.5 g∶50 mL、1 g∶25 mL、1 g∶50 mL）對(duì)提取效率的影響，確定了最終的供試品溶液制備方法。

在色譜條件的優(yōu)化中，分別考察了不同檢測(cè)波長(zhǎng)（254、280、300 nm）、流動(dòng)相系統(tǒng)（乙腈/甲醇-水；乙腈/甲醇-0.1%冰醋酸水溶液；乙腈/甲醇-0.1%甲酸水溶液；乙腈/甲醇-0.1%磷酸水溶液）并進(jìn)行梯度優(yōu)化，考察不同柱溫（20、25、30、35、40℃）、流 速（0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2 mL/min）、進(jìn)樣體積（5、10、15、20 μL）的影響，根據(jù)色譜峰峰形、分離情況等確定上述最佳色譜條件。

本研究通過(guò)計(jì)算相似度對(duì)比分析65批玫瑰花樣品的HPLC指紋圖譜，結(jié)果提示，玫瑰花傳統(tǒng)飲片與破壁飲片和粉體之間具有極高的相似度，表明玫瑰花破壁飲片由玫瑰花傳統(tǒng)飲片到破壁粉體再到制粒，只是物理形態(tài)發(fā)生改變，三者之間的化學(xué)成分種類基本沒(méi)有新增和減少，整體概貌未改變，具有同質(zhì)性。且15批收集的玫瑰花樣品在同一地區(qū)不同區(qū)域之間的相似度大于0.99，表明同一主產(chǎn)地的玫瑰花樣品之間的物質(zhì)基礎(chǔ)相一致。通過(guò)聚類分析和主成分分析對(duì)不同工藝的玫瑰花破壁飲片樣品進(jìn)行分析，聚類結(jié)果和PCA分析得分圖顯示35批玫瑰花破壁飲片樣品大致分為兩類，可見不同工藝制備的玫瑰花破壁飲片之間存在差異性。進(jìn)而通過(guò)SIMCA軟件進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析，其得分圖明顯顯示35批樣品分為兩類，其中小試一類，大生產(chǎn)一類，通過(guò)VIP預(yù)測(cè)找到主要影響分類的因素，結(jié)果表明峰17、5、10、11、4、2、3、9是造成分類的主要因素。說(shuō)明大生產(chǎn)與小試工藝制成的玫瑰花破壁飲片存在差異，主要表現(xiàn)在峰17、5、10、11、4、2、3、9上。由于本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有進(jìn)行上述成分的指認(rèn)，因此后續(xù)需要進(jìn)一步進(jìn)行上述成分的指認(rèn)及含量測(cè)定并考察不同工藝對(duì)這些化學(xué)成分的影響。

4 結(jié)論

本研究所建立的玫瑰花破壁飲片HPLC指紋圖譜方法，確定了17個(gè)共有峰，指認(rèn)了2個(gè)化學(xué)成分（沒(méi)食子酸、鞣花酸）。該方法具有良好的重復(fù)性、精密度及穩(wěn)定性，可用于評(píng)價(jià)玫瑰花傳統(tǒng)飲片到破壁粉體再制成破壁飲片三者之間的物質(zhì)基礎(chǔ)是否發(fā)生改變以及生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，可為玫瑰花破壁飲片的質(zhì)量控制提供參考，后續(xù)研究可進(jìn)一步在本研究的基礎(chǔ)上結(jié)合LC-MS和GC-MS等多種手段對(duì)玫瑰花破壁飲片指紋圖譜中的化學(xué)成分進(jìn)行指認(rèn)。