不同來(lái)源刺柏葉及其易混淆品種的HPLC指紋圖譜分析

吳珊珊，徐 瑞，林 燕

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院 國(guó)家新藥臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010065；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 招標(biāo)采購(gòu)中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特010017；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院 蒙藥室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010）

刺柏葉是柏科刺柏屬植物杜松Juniperus rigidaSieb et Zucc的干燥嫩枝葉，夏、秋二季采收，除去老枝等雜質(zhì)，曬干[1]。刺柏葉常應(yīng)用于蒙醫(yī)臨床，具有清腎熱、利尿、燥“協(xié)日烏素”、愈傷止血等功效[1-2]，多分布于內(nèi)蒙古、遼寧、吉林、黑龍江等地，日本、朝鮮也有分布[3]。刺柏葉中含有豐富的化學(xué)成分，包括苯丙素苷類、木質(zhì)素及其苷類、黃酮類、香豆素類、揮發(fā)油類、萜類和酚類[4-9]等，具有顯著的抗炎[4]、抗腫瘤[6]、抗病毒[10]、抗氧化和抗菌[8]等藥理作用。其中，揮發(fā)油類在化妝品領(lǐng)域也有著很大的應(yīng)用價(jià)值，是香水、護(hù)膚霜等的化學(xué)成分之一。另有研究報(bào)道，刺柏葉中鬼臼毒素的含量很高，可能會(huì)成為因過(guò)度采集而瀕臨滅絕的鬼臼屬植物的替代來(lái)源，在許多疾病的傳統(tǒng)治療中發(fā)揮其抗病毒、抗腫瘤等多種藥理活性[5]。

刺柏葉的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊(cè)》中僅規(guī)定了性狀、顯微和理化鑒別項(xiàng)，不能夠全面控制刺柏葉藥材的質(zhì)量。已有文獻(xiàn)報(bào)道刺柏葉HPLC指紋圖譜結(jié)合一測(cè)多評(píng)的質(zhì)量控制研究[11-12]，但并未對(duì)藥材質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)和客觀分析[13-14]。刺柏葉易與同屬植物如刺柏Juniperus formosanaHayata、西伯利亞刺柏Juniperus sibiricaBurgsd、歐洲刺柏Juniperus communis等的枝葉混淆[2]，故其真?zhèn)舞b別和質(zhì)量控制需要得到更大的重視[13]。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)刺柏葉進(jìn)行了HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)評(píng)價(jià)研究，并對(duì)易混淆品種進(jìn)行了HPLC指紋圖譜鑒別研究，為更全面的控制刺柏葉的質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

島津LC-20A型低壓四元高效液相色譜儀（日本島津制作所）；Retsch MM400型混合研磨機(jī)（德國(guó)萊馳公司）；HH-D4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠）；ME5型百萬(wàn)分之一天平（德國(guó)賽多利斯公司）；AE100型萬(wàn)分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；PL203型千分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 試劑和試藥

甲醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸（分析純，天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司）；超純水；乙腈（色譜純，SIGMA-ALDRICH）；穗花杉雙黃酮（批號(hào)：111902-201102），購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；12批刺柏葉（編號(hào)S1-S12）均來(lái)自內(nèi)蒙古的不同區(qū)域，經(jīng)原內(nèi)蒙古食品藥品檢驗(yàn)所康雙龍、周凱兩位主任中藥師鑒定為杜松Juniperus rigidaSieb et Zucc的干燥嫩枝葉；在采集刺柏葉的過(guò)程中，采集到4批易混淆品種（編號(hào)C1-C4）,與刺柏葉外觀性狀和顯微鑒別均有所不同，刺柏葉藥材及易混淆品種具體來(lái)源，見表1。

表1 刺柏葉藥材及易混淆品種來(lái)源Tab. 1 The source of Juniperus rigida leaves and confused varieties

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色 譜 柱：Phenomenox C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm），柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：乙腈（A）- 0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫，洗脫條件：0 ～ 25 min，16% →27%；25 ～ 30 min，27% → 45%；30 ～ 45 min，45% → 60%；45 ～ 60 min，60% → 80%；檢測(cè)波長(zhǎng)：337 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 供試品溶液的制備

取刺柏葉粉末（過(guò)二號(hào)篩）約0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流2.5 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得[11-12]。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

取穗花杉雙黃酮對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成每1 mL含17.98 μg的對(duì)照品溶液，于4℃保存，備用。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密性試驗(yàn) 取刺柏葉粉末（S1），精密稱定，按“2.2”方法制備供試品溶液，在“2. 1”色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，以穗花杉雙黃酮峰為參照峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.73%，相對(duì)峰面積的RSD均小于1.80%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取刺柏葉粉末（S1）6份，精密稱定，按“2.2”方法制備供試品溶液，在“2.1”色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以穗花杉雙黃酮峰為參照峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.26%，相對(duì)峰面積的RSD均小于2.61%，結(jié)果表明建立方法的重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液于0、4、8、12、16、20、24 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以穗花杉雙黃酮峰為參照峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.99%，相對(duì)峰面積的RSD均小于2.09%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。

2.5 HPLC指紋圖譜

2.5.1 HPLC指紋圖譜的建立 取12批不同來(lái)源的刺柏葉，分別按“2.2”方法制備供試品溶液，再按“2.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并將色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004A版）進(jìn)行數(shù)據(jù)匹配[13]，合成疊加指紋圖譜，見圖1。根據(jù)匹配結(jié)果，共標(biāo)定18個(gè)共有峰，并生成對(duì)照指紋圖譜（R），見圖2，指認(rèn)13號(hào)峰為穗花杉雙黃酮色譜峰（A）。因穗花杉雙黃酮色譜峰分離度好，峰面積較大，故以其為參照物峰計(jì)算12批刺柏葉共有峰的平均相對(duì)保留時(shí)間、平均相對(duì)峰面積，結(jié)果見表2。12批刺柏葉與對(duì)照指紋圖譜的相似度范圍為0.962 ～0.996，結(jié)果見表3。

表2 平均相對(duì)保留時(shí)間和平均相對(duì)峰面積Tab. 2 Average relative retention time and average relative peak area

表3 12批刺柏葉藥材的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab. 3 Similarity evaluation results of 12 batches of Juniperus rigida leaves

圖1 12批刺柏葉疊加圖譜Fig.1 Superimposed fingerprint of 12 batches of Juniperus rigida leaves

圖2 對(duì)照指紋圖譜（R）與參照物穗花杉雙黃酮（A）疊加圖譜Fig.2 Superimposed fingerprint of reference fingerprint (R) and amentoflavone (A)

2.5.2 刺柏葉易混淆品種的鑒別 將4批易混淆品種按“2.2”方法制備供試品溶液，再按“2.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并將色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004B版）與對(duì)照指紋圖譜（R）進(jìn)行數(shù)據(jù)匹配[13]，得到疊加圖譜，見圖3，將4批易混淆品種與對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行比較，可知，有10個(gè)相同的色譜峰，分別為1、3、4、5、9、10、12、13、14和17號(hào)峰，4批易混淆品種之間的色譜峰也有所差別；相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，C1、C2、C3和C4與對(duì)照指紋圖譜的相似度依次為0.951、0.893、0.580和0.943，除C3的相似度很低外，其余3批易混淆品種均較高，見表4。

表4 4批易混淆品種的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab. 4 Similarity evaluation results of 4 batches of confused varieties

圖3 對(duì)照指紋圖譜（R）與易混淆品種（C1 ～ C4）疊加圖譜Fig.3 Superimposed fingerprint of reference fingerprint (R) and confused varieties (C1 ～ C4)

2.5.3 聚類分析 應(yīng)用IBM SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)12批刺柏葉的18個(gè)共有峰峰面積積分值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，再采用組間聯(lián)接法，以平方歐式距離為測(cè)量區(qū)間進(jìn)行聚類分析，結(jié)果S2、S6、S9和S10聚為一類，其余批次聚為一類，見圖4。

圖4 12批刺柏葉藥材的譜系圖Fig.4 Dendrogram of 12 batches of Juniperus rigida leaves

2.5.4 主成分分析 應(yīng)用IBM SPSS 25.0軟件，以12批刺柏葉藥材的18個(gè)共有峰峰面積積分值作為變量，標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行主成分分析，提取出5個(gè)特征值大于1的主成分，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為90.777%，見表5，表明5個(gè)主成分基本可以反映出18個(gè)共有峰的大部分信息。

表5 5個(gè)主成分的特征值和方差貢獻(xiàn)率Tab. 5 Eigenvalues and variance contribution rates of 5 principal components

表6 5個(gè)主成分的因子得分值Tab. 6 Factor scores of 5 principal components

表7 12批刺柏葉藥材主成分得分、綜合得分和排名Tab. 7 Principal component scores, comprehensive scores and ranking of 12 batches of Juniperus rigida leaves

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立的刺柏葉HLPC指紋圖譜，共標(biāo)定18個(gè)共有峰，13號(hào)峰為穗花杉雙黃酮參照物峰，各共有峰的平均相對(duì)保留時(shí)間RSD均在1.00%以下，表明各批次刺柏葉藥材的化學(xué)成分基本一致，各共有峰的平均相對(duì)峰面積RSD均在21.00%以上，表明各批次刺柏葉化學(xué)成分的含量存在一定的差異。通過(guò)將4批易混淆品種與刺柏葉對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行疊加匹配和相似度評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，刺柏葉與其易混淆品種的色譜峰數(shù)目差別較大，4批易混淆品種之間也各有不同；有3批易混淆品種（C1、C2、C4）與刺柏葉有較高的相似性，采自內(nèi)蒙古和河北兩地；而來(lái)自青海的易混淆品種（C3）與刺柏葉的差異很大，說(shuō)明刺柏葉與其易混淆品種之間存在一定的差異性成分。

由于4批易混淆品種和12批刺柏葉之間存在一定相似性，在同時(shí)進(jìn)行聚類分析時(shí)，并不能將二者進(jìn)行很好的區(qū)分。故本實(shí)驗(yàn)從評(píng)價(jià)刺柏葉整體質(zhì)量的角度出發(fā)，僅對(duì)12批刺柏葉進(jìn)行了聚類分析和主成分分析。結(jié)合聚類分析結(jié)果，由主成分分析所得綜合得分排名前四的刺柏葉藥材在聚類分析中聚為一類，包括采自烏蘭察布市的3批（S2、S9、S10）和阿拉善盟的1批（S6），說(shuō)明這4批刺柏葉藥材的質(zhì)量更佳。

4 結(jié)論

刺柏葉在蒙醫(yī)臨床多與其它藥材配伍成復(fù)方制劑。為了更廣泛的應(yīng)用刺柏葉，應(yīng)該建立更為嚴(yán)格的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC指紋圖譜，具有一定的專屬性，并可有效的對(duì)其易混淆品種進(jìn)行鑒別。結(jié)合聚類分析和主成分分析對(duì)所采集的12批刺柏葉藥材進(jìn)行整體性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源刺柏葉藥材的質(zhì)量存在一定的差異性。