海水魚源美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種對小鼠的致病性研究

王麗芳，于永翔，王印庚,3，廖梅杰,3，榮小軍,3，李 彬，秦 蕾，張 正,3*

(1.江蘇海洋大學(xué)，江蘇連云港 222005；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室，山東青島 266071；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室/海洋漁業(yè)科學(xué)與食品產(chǎn)出過程功能實驗室，山東青島 266237)

美人魚發(fā)光桿菌(Photobacteriumdamselae)是一種廣泛分布于全球海洋環(huán)境中的革蘭氏陰性菌，包括美人魚亞種和殺魚亞種(Photobacteriumdamselaesubsp.piscicida)兩個亞種[1]。其中殺魚亞種只能感染魚類發(fā)病，但美人魚亞種對魚類、軟體動物、甲殼類、爬行類、哺乳類等多種類的海洋動物都有較強的致病性，沒有明顯的宿主特異性。多種經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類，如虹鱒魚(Oncorhynchusmykiss)、鰻魚(Anguillidae)和黃姑魚(Nibeaalbiflora)等都因感染美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種發(fā)病而造成嚴重的經(jīng)濟損失。此外，美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種還能感染人，1982年Morris J G等[2]首次描述了該菌感染人發(fā)病后會導(dǎo)致傷口感染和流膿等癥狀。Clarridge J E等[3]于1985年首次報道了該菌感染人致死的病例。隨后，美國、日本和中國香港等地的科學(xué)家陸續(xù)報道了多個美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種感染人后導(dǎo)致急性死亡的案例[4]。

近些年來，我國有關(guān)美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種感染水產(chǎn)動物的報道逐漸增多。2010年福建省大黃魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)暴發(fā)疾病，患病大黃魚(Larimichthyscrocea)體表多處充血，并逐漸發(fā)展成局部潰瘍，隨后出現(xiàn)大量死亡，主要致病原為美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種[5]。2015年，浙江省沿海地區(qū)養(yǎng)殖的銀鯧魚(Pampusargenteus)出現(xiàn)鰭部出血等癥狀，經(jīng)鑒定是因感染美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種所致[6]。2016年-2018年間，山東長島地區(qū)深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的許氏平鲉暴發(fā)疾病，患病許氏平鲉出現(xiàn)鰭部出血、皮膚潰爛等癥狀，研究證實美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種是其主要的致病原[7]。此外，半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[8]、南美白對蝦(Penaeusvannamei)[9]、龍膽石斑魚(Epinepheluslanceolatus)[10]等也有因感染美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種引起疾病的報道。美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種已經(jīng)成為我國近年來新興的海水養(yǎng)殖病原，對我國南方和北方的海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展構(gòu)成新的威脅[11]。

美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種現(xiàn)已廣泛分布于我國沿海水域環(huán)境中。根據(jù)已有的研究報道，該菌能通過傷口接觸海水或食用海鮮等途徑感染人，且其致病性較強，對人的身體健康甚至生命構(gòu)成威脅，是少有的來自海洋環(huán)境的人魚共患病原。Takahashi H等[1]用不同來源的美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種感染小鼠，結(jié)果顯示不同美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種菌株對小鼠的致病力不同，這說明不同的美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種菌株致病力是存在差異性的。為進一步驗證我國近海環(huán)境中美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種的致病力，本研究以1株分離自患病許氏平鲉的美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種為對象，用昆明系小鼠為實驗動物模型，通過人工感染試驗，觀察美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種對小鼠的致病性，從而為評判該菌對人及哺乳動物的致病性提供間接證據(jù)，為防控該菌的擴散傳播和降低生物安全風(fēng)險提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及實驗動物 試驗所用美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種菌株為實驗室保存，系本實驗室人員從山東省長島縣深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的患病許氏平鲉中分離獲得，人工感染試驗證實其對許氏平鲉具有較強的致病性[7]。試驗所用小鼠為清潔級昆明系小鼠，購自青島大學(xué)附屬醫(yī)院。

1.1.2 主要試劑和儀器 40 mg/mL多聚甲醛液，青島貝和益生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；TSB培養(yǎng)基，青島升泉港化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；無水乙醇、二甲苯、中性樹膠，國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備 生物安全柜(BSC-1300IIA2)，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；生化培養(yǎng)箱(SPX-250B-Z)，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；組織切片系統(tǒng)(包括石蠟切片機、全自動冷凍切片機、全自動染色機、石蠟包埋機和全自動全封脫水機)，德國Leica公司產(chǎn)品；正置生物顯微鏡(E800)，日本Nikon公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種對小鼠的致病力驗證 將保存的菌株接種于TSB瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃條件下倒置培養(yǎng)24 h，挑取單菌落進行純化培養(yǎng)1次，然后用無菌鹽水(15 mg/mL)制成7.5×108CFU/mL的菌懸液。取健康的18周齡～19周齡昆明系成年小鼠10只，體重為37.75 g±2.33 g，隨機分成對照組和試驗組，試驗組6只，對照組4只。試驗組小鼠按0.1 mL/10 g體重劑量灌胃制備好的美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種菌懸液，對照組灌胃等量的無菌生理鹽水。處理后對兩組小鼠進行隔離飼養(yǎng)，定期觀察并記錄兩組小鼠的健康狀況。

1.2.2 美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種對小鼠的LD50測定 另取48只4周齡～5周齡健康昆明系小鼠，體重為30.93 g±2.89 g隨機分成6組，每組8只，分成5個試驗組和1個對照組。試驗組小鼠按0.1 mL/10 g體重劑量分別腹腔注射3.94×104、3.94×105、3.94×106、3.94×107、3.94×108CFU/mL的制備好的美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種菌懸液，對照組注射等量的無菌生理鹽水。將6組小鼠隔離后正常飼養(yǎng)，觀察并記錄小鼠7 d內(nèi)的死亡情況。采用寇氏法[12]測定該菌的LD50，取死亡小鼠進行解剖檢查，并分離病原進行鑒定。

1.2.3 組織病理學(xué)分析 將剛剛死亡的小鼠及時剖檢，剪取心臟、肝臟、脾、腸等內(nèi)臟器官，修剪后放入濃度為40 mg/mL的多聚甲醛溶液中固定48 h以上。同時解剖1只對照組的健康小鼠，取同樣的器官用于對比分析。將在多聚甲醛溶液中固定好的組織塊進行修切后，經(jīng)過脫水、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、染色、封片等步驟制成小鼠組織病理切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 灌胃感染后小鼠的臨床癥狀

試驗組小鼠口腔灌胃美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種1 h后，均出現(xiàn)不同程度的嗜睡、精神萎靡、被毛聳立、呼吸急促和對外界刺激反應(yīng)遲緩等癥狀。灌胃1 d后，試驗組小鼠狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)，但采食量和飲水量相比對照組小鼠明顯減少，部分小鼠眼角分泌物增多。灌胃7 d后，試驗組有1只小鼠前肢上部出現(xiàn)潰瘍狀傷口(圖1A)。試驗期間，試驗組有1只小鼠死亡，對照組活動正常，未發(fā)現(xiàn)有異?，F(xiàn)象。

2.2 美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種對小鼠的LD50

腹腔注射不同濃度的美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種菌液后，記錄小鼠7 d內(nèi)的死亡率。其中，108CFU/mL菌量組在24 h內(nèi)全部死亡，107CFU/mL菌量組在24 h內(nèi)死亡3只，但在后續(xù)觀察的6 d中再未有其他小鼠死亡，其余濃度組小鼠在7 d內(nèi)全部存活，無異?，F(xiàn)象。107CFU/mL菌量組有1只存活小鼠在前肢處出現(xiàn)明顯的潰瘍狀傷口(圖1B)，對照組小鼠狀態(tài)良好。根據(jù)感染試驗的死亡率，采用寇氏法計算美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種對小鼠致死的LD50為5.52×105CFU/g。

2.3 死亡小鼠的剖檢觀察

對死亡小鼠進行解剖檢查發(fā)現(xiàn)，相比健康小鼠，感染美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種死亡的小鼠腸道膨脹，被大量淡黃色的膿樣液體填充，腸壁充血明顯，心臟和肝臟也因淤血而變?yōu)樯钭霞t色。與對照組小鼠相比，試驗組死亡小鼠的腸壁充血明顯，心臟和肝臟因淤血而呈現(xiàn)深紫紅色(圖2)。

從死亡小鼠的心、肝、肺、脾、腎、消化道組織中分離出優(yōu)勢菌，經(jīng)16S rDNA鑒定為美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種。

A.灌胃組；B.腹腔注射組

A.對照組；B.試驗組。

2.4 死亡小鼠的組織病理分析

組織病理切片的觀察發(fā)現(xiàn)，感染美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種的小鼠主要內(nèi)臟器官都發(fā)生了不同程度的病變，其主要的顯微病理特征如下(圖3和圖4)。

(1)心臟：正常小鼠心臟的心肌肌纖維組織排列緊密有序，而感染小鼠的心肌組織肌纖維束相互解離、斷裂，并發(fā)生了大面積的空泡樣變性。肌纖維束之間有大量的血細胞浸潤。

(2)肝臟：感染小鼠的肝臟細胞出現(xiàn)了炎性病變，細胞核輪廓變得模糊，肝臟組織出現(xiàn)了非常明顯的血細胞點狀浸潤。

(3)肺臟：健康小鼠的肺實質(zhì)組織結(jié)構(gòu)致密、完整，可見清晰的毛細血管樣結(jié)構(gòu)。感染小鼠的肺實質(zhì)組織已經(jīng)完全崩解，組織結(jié)構(gòu)變得稀松、零落。

(4)腎臟：健康小鼠的腎臟組織可見清晰的腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)，感染小鼠的腎間質(zhì)發(fā)生了局灶性的潰瘍，使腎小球和腎小管從腎間質(zhì)中剝離。同時，腎間質(zhì)也出現(xiàn)了大量的血細胞浸潤。

(5)脾臟：健康小鼠的脾臟組織結(jié)構(gòu)清晰，可見明顯的白髓區(qū)和紅髓區(qū)。感染小鼠的白髓區(qū)和紅髓區(qū)界線已經(jīng)模糊，髓質(zhì)出現(xiàn)局灶性的潰爛壞死。同時，脾臟中出現(xiàn)了大量的炎性巨核細胞。

(6)消化道：健康小鼠的胃和腸道組織結(jié)構(gòu)完整，黏膜層和黏膜下層清晰可見。感染小鼠的胃和腸道的黏膜層和黏膜下層都發(fā)生了大面積的潰瘍性壞死，壞死的組織大量堆積于消化腔中。

3 討論

美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種廣泛分布于海洋和河口水域中，是海水環(huán)境中的常見細菌，除了患病的海洋動物外，海藻、健康的海洋動物[13]以及海鮮食品[14]中也有分離到該菌的報道。有研究者認為，該菌還是夏枯草鯊(Carcharhinidsharks)體內(nèi)微生物群的常見成員之一[15]。美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種不僅給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，而且對人類健康也構(gòu)成了威脅。該菌會導(dǎo)致人傷口感染，形成明顯的水腫等癥狀，若未能及時治療，感染程度會加深，發(fā)展為壞死性筋膜炎和多器官衰竭等。在一些臨床案例中，患者即使在治療過程中使用了抗菌類藥物，仍無法控制致命性感染的病情發(fā)展[2]。還有患者的感染部位盡管進行了廣泛的清創(chuàng)處理，但患者仍在出現(xiàn)一系列并發(fā)癥后死亡。因此加強對美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種致病性的研究具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

A.健康小鼠心臟；B.感染組小鼠心臟，心肌纖維斷裂，發(fā)生空泡樣變性(三角箭頭)；C.健康小鼠肝臟；D.感染小鼠組肝臟，細胞發(fā)生炎性病變(三角箭頭)，并有血細胞點狀浸潤(箭頭)；E.健康小鼠肺臟；F.感染小鼠肺臟，肺實質(zhì)組織完全崩解。

研究證明，美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種的毒力與其產(chǎn)生的致病因子密切相關(guān)，其中溶血素是該菌最重要的毒力因子之一。已有研究證明，美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種的毒素Dly和毒素PhlyP是導(dǎo)致小鼠患病的主要毒力因子[16]。其中Dly具有磷脂酶-D的活性和溶血活性[17]，對小鼠具有強溶血活性，能夠降解宿主紅細胞膜中的脂質(zhì)雙分子層，使細胞膜形成空洞，改變膜的通透性，引起紅細胞的破裂溶解，被認為是美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種感染導(dǎo)致小鼠患病的主要毒力因子。PhlyP能形成穩(wěn)定的低聚體，插入到構(gòu)成孔復(fù)合體的紅細胞膜中，在有膽固醇的情況下會引起溶血現(xiàn)象[18]。Dly和PhlyP協(xié)同作用，能夠造成小鼠紅細胞的強溶血效應(yīng)，并產(chǎn)生致病性[16]。而在本研究中，也觀察到感染美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種的小鼠腸壁、心臟和肝臟等組織器官有明顯的充血現(xiàn)象。此外，有研究表明，在美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種的胞外產(chǎn)物中能夠檢測到多種酶活性[19]，其中包括磷脂酶和溶血素活性，可以降解宿主的蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)等，增加感染部位血管通透性，導(dǎo)致血液的滲出，而在本研究中個別試驗小鼠也出現(xiàn)了嚴重的體表潰瘍癥狀。同時，也發(fā)現(xiàn)感染小鼠的心臟肌纖維束之間、肝臟組織、腎間質(zhì)都有血細胞浸潤。胞外蛋白酶還能破壞宿主的免疫系統(tǒng)[14]，導(dǎo)致小鼠的免疫力下降。通過文獻和本研究的發(fā)現(xiàn)可以推測，到達小鼠體內(nèi)的美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種能夠穿過小鼠組織器官表面的黏膜屏障進入血管和更深層次的組織內(nèi)，并通過循環(huán)系統(tǒng)進一步擴散到小鼠全身各器官中。為抵御外來細菌的侵襲，小鼠的免疫系統(tǒng)被激活，而該菌致病因子協(xié)同作用可以造成小鼠組織和器官的病理性損傷和組織充血，破壞小鼠的免疫因子酶活性，最終導(dǎo)致小鼠的死亡。

A.健康小鼠腎臟；B.感染小鼠腎臟，腎間質(zhì)發(fā)生局灶性的潰瘍，有大量的血細胞浸潤(箭頭)；C.健康小鼠脾臟；D.感染小鼠脾臟，髓質(zhì)出現(xiàn)局灶性壞死(箭頭)和炎性巨核細胞(三角箭頭)；E.健康小鼠胃；F.感染小鼠胃，胃黏膜層出現(xiàn)潰瘍性壞死(箭頭)；G.健康小鼠腸道；H.感染小鼠腸道，黏膜層發(fā)生大面積潰瘍性壞死(箭頭)。

通過本研究發(fā)現(xiàn)，從我國近海環(huán)境中分離的美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種對小鼠也存在較強的致病力，可以造成小鼠多組織和器官的病變，高濃度的美人魚發(fā)光桿菌能導(dǎo)致小鼠死亡，間接證實我國近海環(huán)境中的美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種也存在感染人的潛在風(fēng)險。因此，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中除了要防控該菌對養(yǎng)殖動物造成的經(jīng)濟損失外，也應(yīng)對該菌潛在的公共衛(wèi)生風(fēng)險引起足夠的重視。