HPLC法同時測定小葉丁香中4種護(hù)肝活性成分

施春陽，馬養(yǎng)民，劉玉枝，梁承遠(yuǎn)，李道明

(1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安 710021；2.陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院，陜西西安 710021；3.陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西西安 710021)

肝臟是動物體內(nèi)重要的解毒和代謝器官。由于抗生素等藥物濫用，飼料霉變，細(xì)菌、病毒或寄生蟲侵染以及環(huán)境污染等影響，畜禽在大規(guī)模養(yǎng)殖過程中極易造成肝臟損傷，引發(fā)肝臟疾病。這極大影響了畜禽養(yǎng)殖的生產(chǎn)性能和經(jīng)濟效益，亟需科技工作者研究解決。

近年來，發(fā)酵中藥或中草藥添加劑已在畜牧養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用，具有低耐藥性、低藥物殘留，對動物、人類和自然環(huán)境不良影響較小等優(yōu)勢[1-2]。小葉丁香(SyringamicrophyllaDiels，SMD)為木樨科丁香屬植物，又名四季丁香、二度梅和野丁香等，主要分布于我國河南、河北、陜西等地[3]，在我國北方作為觀賞性園林植物廣泛應(yīng)用，民間用其花、果實等泡茶飲用，具有消炎、鎮(zhèn)咳、治療肝炎和肝硬化之療效。小葉丁香富含糖苷類活性化合物，主要有以紫丁香苷、松果菊苷和連翹酯苷B等為主的苯乙醇苷類，以橄欖苦苷為主的裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類和黃酮苷類等[4-7]。現(xiàn)代藥理研究表明，橄欖苦苷和紫丁香苷具有較好的肝細(xì)胞保護(hù)作用[8]。橄欖苦苷對脂多糖和四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝損傷均有顯著的保護(hù)作用，其作用機制可能與阻止肝臟炎性反應(yīng)有關(guān)[9-10]。紫丁香苷則是一種強抗肝毒藥物，可通過恢復(fù)微粒體酶系統(tǒng)的酶活性和抑制脂質(zhì)過氧化作用促進(jìn)肝毒物代謝并改善肝功能。松果菊苷可提高肝損傷小鼠的存活率、降低ALT水平和改善肝組織學(xué)形態(tài)，并可明顯降低大鼠血清中ALT、AST、MDA和ROS產(chǎn)物，提高SOD活性和GSH含量，具有良好的抗炎和肝損傷保護(hù)作用[11-12]。連翹酯苷可通過減輕肉雞氧化應(yīng)激，抑制肝組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，有效提高其肝臟抗損傷能力[13]。因此，小葉丁香枝葉富含保肝護(hù)肝活性成分，可通過發(fā)酵、復(fù)配加工等開發(fā)功能型畜禽飼料或飼料添加劑，具有良好的市場應(yīng)用前景。

目前，尚未見報道關(guān)于同時測定小葉丁香中保肝護(hù)肝活性成分的檢測方法。本研究采用高效液相法同時測定了小葉丁香中4種護(hù)肝活性成分，可為小葉丁香枝葉的綜合開發(fā)利用和質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.2 試劑 4種標(biāo)準(zhǔn)品橄欖苦苷(含量98.50%，批號AF20051703)、紫丁香苷(含量99.47%，批號AF9093171)、連翹酯苷B(含量98.53%，批號AF2052702)、松果菊苷(含量98.82%，批號AF20051710)，成都埃法生物科技有限公司產(chǎn)品；乙腈、甲醇，色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器 高效液相色譜儀(LC-16)，島津中國公司產(chǎn)品；超純水制備系統(tǒng)(Millipore Milliv Plus)，美國Millipore公司產(chǎn)品；電子天平(LE204E/02)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品；電子天平(JA2603B)，上海天美天平儀器有限公司產(chǎn)品；超聲波清洗器(YM-1005)，深圳市方奧微電子有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱AkzoNobel KromasiL C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)和1 mL/L醋酸水溶液(B)梯度洗脫，洗脫程序為0～15 min，5%～15%B、15 min～20 min，15%～20%B、20 min～30 min，20%～25%B、30 min～60 min，25%～40%B；流速為1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測器為紫外檢測器，采用254 nm和330 nm雙波長檢測。

1.2.2 溶液的制備

1.2.2.1 儲備液的制備 分別稱取4種標(biāo)準(zhǔn)品適量，甲醇溶解并定容，配制成單一標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，置-4 ℃保存。其中，紫丁香苷和連翹酯苷B儲備液濃度為1 000 μg/mL，橄欖苦苷儲備液濃度為800 μg/mL，松果菊苷儲備液濃度為80 μg/mL。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 用甲醇將上述儲備液分別稀釋成標(biāo)準(zhǔn)品梯度溶液，置-4 ℃保存。其中，松果菊苷標(biāo)準(zhǔn)品梯度溶液的濃度分別為5、10、20、40、80 μg/mL；橄欖苦苷標(biāo)準(zhǔn)品梯度溶液的濃度分別為50、100、200、400、800 μg/mL；紫丁香苷和連翹酯苷B標(biāo)準(zhǔn)品梯度溶液的濃度分別為50、100、250、500、1 000 μg/mL。

1.2.2.3 供試品溶液的制備 取小葉丁香的莖葉，80 ℃干燥，粉碎。準(zhǔn)確稱取7.50 g至200 mL三角瓶，以10倍量950 mL/L乙醇超聲提取30 min，提取2次，合并濾液，蒸干，加適量甲醇溶解，離心，上清液移至100 mL容量瓶，甲醇定容，即得供試品溶液。測定前，用0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.2.3 線性考察 將“1.2.2.2”中4種活性成分的標(biāo)準(zhǔn)品梯度溶液，在“1.2.1”中規(guī)定的色譜條件下進(jìn)行分析，記錄色譜峰峰面積。以進(jìn)樣濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

這當(dāng)然是教學(xué)重點，包括詞匯、語法的講解和學(xué)習(xí)。但由于該文主要涉及思政教育內(nèi)容，因此傳統(tǒng)的語言教學(xué)在這里就不做重點介紹和分析。

1.2.4 精密度試驗 按“1.2.2.3”中方法制備供試品溶液，將同一樣品連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，測定色譜峰峰面積，分別計算4種活性成分對應(yīng)峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，考察測定方法的精密度。

1.2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h，每次進(jìn)樣10 μL，測定色譜峰峰面積，分別計算4種活性成分對應(yīng)峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，考察測定方法的穩(wěn)定性。

1.2.6 重復(fù)性試驗 按“1.2.2.3”中方法制備6份供試品溶液，每次進(jìn)樣10 μL，測定色譜峰峰面積，分別計算4種活性成分對應(yīng)峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，考察測定方法的重復(fù)性。

1.2.7 加樣回收率試驗 精密移取已知含量的小葉丁香供試品溶液，分別加入4種不同活性成分的對照品溶液，配制成加樣樣品溶液，每種活性成分配制6份，進(jìn)樣量為10 μL，測定色譜峰峰面積，分別計算4種活性成分對應(yīng)的加樣回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.2.8 小葉丁香樣品測定 將不同批號的小葉丁香樣品6份，分別制備成供試品溶液，每個供試品溶液測定2次，每次進(jìn)樣10 μL，計算不同批號小葉丁香樣品中橄欖苦苷、紫丁香苷、松果菊苷和連翹酯苷B的平均含量。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)使用SPSS軟件(19.0版)進(jìn)行統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系

以進(jìn)樣濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以最小二乘法做線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和線性關(guān)系見表1。松果菊苷在5 μg/mL～80 μg/mL、橄欖苦苷在50 μg/mL～800 μg/mL、紫丁香苷和連翹酯苷B在50 μg/mL～1 000 μg/mL濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r為0.999 8～0.999 9，說明4種活性成分的峰面積與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好。

表1 各成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

4種活性成分標(biāo)準(zhǔn)品和供試樣品測定的HPLC色譜圖見圖1，其主峰分離度均較好。

2.2 精密度試驗

4種活性成分分別連續(xù)進(jìn)樣6次，理論塔板數(shù)均大于2 500，保留時間和峰面積RSD見表2。橄欖苦苷、紫丁香苷、松果菊苷和連翹酯苷B在色譜系統(tǒng)中保留時間均較穩(wěn)定，RSD介于0.12%～0.22%，且所測得峰面積的RSD分別為2.01%、2.36%、2.09%和2.77%，表明該方法的儀器精密度良好。

A.橄欖苦苷；B.紫丁香苷；C.松果菊苷；D.連翹酯苷B；E1.供試樣品(254 nm)；E2.供試樣品(330 nm)

表2 各成分的精密度

2.3 穩(wěn)定性試驗

4種活性成分供試品溶液制備后在室溫放置24 h，分別在規(guī)定時間測定主峰峰面積，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD見表3。在24 h內(nèi)，橄欖苦苷、紫丁香苷、松果菊苷和連翹酯苷B在色譜系統(tǒng)中保留時間均較穩(wěn)定，RSD介于0.07%～0.15%，且所測得的峰面積也都未發(fā)生明顯變化，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差依次為1.67%、2.20%、1.88%和1.97%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

表3 各成分的穩(wěn)定性

2.4 重復(fù)性試驗

4種活性成分對應(yīng)峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見表4。橄欖苦苷、紫丁香苷、松果菊苷和連翹酯苷B在色譜系統(tǒng)中保留時間較穩(wěn)定，RSD介于0.11%～0.95%，且所測得峰面積RSD分別為2.21%、2.37%、2.51%和2.92%，表明該方法重復(fù)性良好。

表4 各成分的重復(fù)性

2.5 加樣回收率試驗

4種活性成分對應(yīng)的平均加樣回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD見表5。4種活性成分的加樣回收率都介于95%～105%，符合藥典要求。橄欖苦苷、紫丁香苷、松果菊苷和連翹酯苷B的平均加樣回收率分別為99.08%、95.20%、99.40%和98.69%，RSD值分別為1.73%、2.55%、2.83%和1.89%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表5 各成分的加樣回收率

2.6 小葉丁香樣品測定

經(jīng)測定，不同批號小葉丁香樣品中橄欖苦苷、紫丁香苷、松果菊苷和連翹酯苷B的含量分別為0.709%±0.016%、0.452%±0.012%、0.059%±0.003%和0.512%±0.012%。

3 討論

本研究選用紫外檢測器，其線性范圍廣，受影響的范圍較小，可滿足多組分同時測定的要求。根據(jù)《中華人民共和國藥典第一部(2020年版)》規(guī)定[14]，紫丁香苷檢測波長為265 nm，松果菊苷檢測波長為330 nm。另有資料顯示[15-16]，橄欖苦苷檢測波長為285 nm，連翹酯苷B檢測波長為332 nm。為兼顧方法的靈敏性和可操作性，本方法采用雙波長檢測，橄欖苦苷和紫丁香苷的檢測波長確定為254 nm，松果菊苷和連翹酯苷B的檢測波長確定為330 nm。

試驗分別考察了甲醇-水、甲醇-1 mL/L醋酸水溶液、甲醇-1 mg/mL磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-1 mL/L醋酸水溶液、乙腈-1 mg/mL磷酸水等洗脫體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含甲醇流動相體系的分離度均不能全部滿足要求，含乙腈流動相體系的分離度可以滿足要求，且峰型較好。經(jīng)優(yōu)化，采用乙腈(A)-1 mg/L醋酸水溶液(B)流動相體系梯度洗脫進(jìn)行檢測，梯度洗脫程序確定為0～15 min，5%～15%B、15 min～20 min，15%～20%B、20 min～30 min，20%～25%B、30 min～60 min，25%～40%B。

試驗比較了甲醇、乙醇和乙腈等溶劑對4種活性成分的提取率，并對超聲、索氏、回流和滲漏等不同提取方法及其提取條件進(jìn)行考察。結(jié)果表明，以10倍量950 mL/L乙醇超聲提取30 min，提取2次的效果最好，提取率大于其他方法，且樣品處理時間短、操作簡單。

中國藥典第一部(2020年)在暴馬子皮和肉蓯蓉2種藥材或飲片的含量測定中規(guī)定了紫丁香苷和松果菊苷的檢測方法，有關(guān)學(xué)者也分別研究了小葉丁香中橄欖苦苷和抗宮炎軟膠囊中連翹酯苷B的HPLC測定方法。但是，這4種活性成分測定時，其供試品溶液制備方法，HPLC測定的流動相組成、洗脫程序及檢測波長均不一致，無法直接參照用于同時測定小葉丁香中多組分的含量。本研究通過優(yōu)化樣品處理方法和HPLC色譜條件，建立了同時測定小葉丁香中4種護(hù)肝活性成分含量的方法，為評價小葉丁香的產(chǎn)品質(zhì)量和護(hù)肝功效提供了理論依據(jù)。試驗對采自不同地區(qū)的6份小葉丁香樣品進(jìn)行了檢測，其莖葉富含護(hù)肝活性成分，橄欖苦苷、紫丁香苷、松果菊苷和連翹酯苷B的平均含量分別為0.709%、0.452%、0.059%和0.512%。這表明小葉丁香可開發(fā)成具有養(yǎng)肝護(hù)肝功效的飼料或飼料添加劑，用于畜禽規(guī)模養(yǎng)殖。