牛病毒性腹瀉病毒兩種基因型雙重RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

王 勤，何 博，歐云文，劉俐君，楊 磊，潘 琴，張 杰

(1.達州職業(yè)技術(shù)學院，四川達州 635001；2.開江縣動物疫病預防控制中心，四川達州 636250；3.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，甘肅蘭州 730046；4.達州市動物疫病預防控制中心，四川達州 635000)

牛病毒性腹瀉(Bovine viral diarrhea，BVD)又稱黏膜病(Mucosal disease，MD)，是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，BVDV除感染牛外，還可感染豬、羊、鹿以及野生動物，可減少宿主動物外周循環(huán)系統(tǒng)和組織內(nèi)中性粒細胞數(shù)量，導致淋巴細胞功能異常，進而機體發(fā)生免疫抑制[1]。BVDV感染宿主動物后主要引起腹瀉、急慢性黏膜感染、繁殖和免疫障礙，同時伴有其他病原的繼發(fā)感染與混合感染。懷孕母牛感染后可引起流產(chǎn)和死胎，耐過犢牛則成為持續(xù)感染動物(PI)，PI牛終生帶毒且不斷向外排毒，成為BVDV的重要傳染源，難以凈化[2-3]。目前，該疫病世界范圍內(nèi)流行，流行趨勢呈明顯上升態(tài)勢，給養(yǎng)牛業(yè)的安全生產(chǎn)帶來了嚴重的挑戰(zhàn)，是進出口重點檢疫的動物疫病[4-5]。

BVDV為單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)，病毒基因組全長約12 kb～13 kb，由5′端非編碼區(qū)(5′-UTR)、3′端非編碼區(qū)(3′-UTR)和1個開放閱讀框(ORFs)組成，其中5′-UTR在BVDV不同毒株間具有高度保守性[6-7]。因此，根據(jù)5′-UTR的序列差異可將BVDV分為2種基因型，即BVDV-1型和BVDV-2型。我國的主要流行亞型為BVDV-1，近年來相關(guān)監(jiān)測數(shù)據(jù)表明BVDV-2感染情況逐步增多[8-10]。BVDV-1和BVDV-2之間具有一定交叉保護作用，但無法達到高效保護，BVDV-1疫苗無法對BVDV-2提供完全保護作用，也無法完全抵抗BVDV-2感染[11-13]。鑒于BVDV-1和BVDV-2型臨床癥狀高度相似，加強BVDV-1和BVDV-2的實驗室分型診斷對其綜合防控至關(guān)重要。本研究根據(jù)BVDV-1(AF091605.1、KF501393.1、MK204904.1、MN513404.1和MG923683.1)和BVDV-2 (AF502399.1、MG436782.1、 AF145969.1、KC176777.1和MN513411.1)流行毒株5′-UTR序列設(shè)計特異性引物，摸索和優(yōu)化RT-PCR反應(yīng)條件，建立一種BVDV雙重RT-PCR檢測方法，為BVDV的實驗室診斷提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株及臨床樣品 BVDV-1(Oregon C24V毒株)、BVDV-2(HLJ-10毒株)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)、牛輪狀病毒(Bovine rotavirus,BRV)、牛冠狀病毒(Bovine coronavirus,BCV)、牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV-3)和豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)，均由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室保存；臨床樣品源自2017年-2019年采集于四川省達州及周邊地區(qū)養(yǎng)牛場。

1.1.2 主要試劑 一步法RT-PCR擴增試劑盒、DNA Marker DL2 000、病毒DNA/RNA提取試劑盒、pMD19-T載體，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小量制備試劑盒、DNA膠回收試劑盒、PCR清潔試劑盒，AxyPrep公司產(chǎn)品；TaqDNA聚合酶，F(xiàn)ermentas公司產(chǎn)品；牛腎傳代細胞(MDBK)、MEM細胞培養(yǎng)液，美國Gibco公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠粉，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；蛋白胨、酵母提取物，英國OXOID公司產(chǎn)品；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 PCR儀(T100)、凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；冷凍高速離心機，大龍公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；超微量蛋白核酸分析儀(NanoDrop2000)，美國Thermo公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank公布的BVDV-1(GenBank：AF091605.1、KF501393.1、MK204904.1、MN513404.1和MG923683.1)和BVDV-2 (GenBank：AF502399.1、MG436782.1、 AF145969.1、KC176777.1和MN513411.1)流行毒株5′-UTR保守序列，設(shè)計2對特異性引物(表1)，引物由重慶擎科生物有限公司合成。

表1 引物序列

1.2.2 病毒核酸提取 按照病毒DNA/RNA提取試劑盒使用說明書分別提取牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)、牛輪狀病毒(BRV)、牛冠狀病毒(BCV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、豬瘟病毒(CSFV)、BVDV-1和BVDV-2核酸，置-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 重組質(zhì)粒標準品的制備 分別以BVDV-1和BVDV-2總RNA為模板，P1、P2和P3、P4為引物，反應(yīng)程序：50 ℃ 30 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。進行RT-PCR擴增，RT-PCR產(chǎn)物克隆至pMD19-T載體，構(gòu)建pMD19-T-BVDV-1、pMD19-T-BVDV-2重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒送重慶擎科生物有限公司測序鑒定，并測定重組質(zhì)粒濃度。

1.2.4 單項RT-PCR反應(yīng)條件的建立及優(yōu)化 以重組質(zhì)粒pMD19-T-BVDV-1為模板，重組質(zhì)粒pMD19-T-BVDV-2、pMD19-T-BVDV-1+pMD19-T-BVDV-2等量混合物和ddH2O為對照組，P1、P2為引物，采用統(tǒng)計學方法依次對模板含量為10 μg、1 μg、0.1 μg、10 ng和1 ng，引物含量為0.25、0.5、0.75、1.0 mmol/L，退火溫度為52、53、54、55 ℃進行摸索、優(yōu)化，確定BVDV-1單項RT-PCR擴增的最適反應(yīng)條件。與此同時，以重組質(zhì)粒pMD19-T-BVDV-2為模板，重組質(zhì)粒pMD19-T-BVDV-1、pMD19-T-BVDV-1+pMD19-T-BVDV-2等量混合物和ddH2O為對照組，P3、P4為引物，按照上述方法摸索和優(yōu)化BVDV-2單項RT-PCR擴增的最適反應(yīng)條件，擴增產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5 雙重RT-PCR反應(yīng)條件的建立及優(yōu)化 以重組質(zhì)粒pMD19-T-BVDV-1和pMD19-T-BVDV-2等量混合物為模板，ddH2O為陰性對照組，P1、P2、P3、P4為引物，采用統(tǒng)計學方法依次對模板含量為10 μg、1 μg、0.1 μg、10 ng和1 ng，引物含量為0.25、0.5、0.75、1.0 mmol/L，退火溫度為52、53、54、55 ℃進行摸索、優(yōu)化，確定BVDV雙重RT-PCR擴增的最適反應(yīng)條件，RT-PCR擴增產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.6 特異性試驗 采用優(yōu)化的雙重RT-PCR最佳反應(yīng)條件依次對BVDV-1、BVDV-2、IBRV、BRV、BCV、BPIV3和CSFV的核酸，以及BVDV-1、BVDV-2核酸等量混合物進行RT-PCR擴增，對雙重RT-PCR檢測方法進行特異性分析。

1.2.7 敏感性試驗 采用優(yōu)化的雙重RT-PCR最佳反應(yīng)條件依次對不同稀釋度的BVDV-1、BVDV-2核酸分別進行RT-PCR擴增，稀釋比例為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍，對雙重RT-PCR檢測方法進行敏感性分析。

1.2.8 重復性試驗 采用優(yōu)化的雙重RT-PCR最佳反應(yīng)條件依次對BVDV-1、BVDV-2、IBRV、BRV、BCV、BPIV-3和CSFV核酸，以及BVDV-1、BVDV-2核酸等量混合物重復檢測3次，驗證雙重RT-PCR檢測方法的重復性。

1.2.9 臨床樣品檢測 采用優(yōu)化的雙重RT-PCR最佳反應(yīng)條件對2017年-2019年采集于達州及周邊地區(qū)332份具有腹瀉癥狀牛的新鮮糞便樣品進行檢測，了解四川省達州及周邊地區(qū)BVDV-1和BVDV-2流行形勢，并對雙重RT-PCR檢測方法進行臨床適用性分析。

2 結(jié)果

2.1 單項RT-PCR反應(yīng)條件的建立及優(yōu)化

對RT-PCR反應(yīng)條件進行優(yōu)化，確定了單項RT-PCR擴增反應(yīng)最適模板用量為5 μL(模板含量為0.1 μg)，上、下游引物最適用量各為0.5 μL(引物濃度為0.5 mmol/L)，其中BVDV-1最適退火溫度為54 ℃，BVDV-2最適退火溫度為53 ℃。單項RT-PCR反應(yīng)體系為：2×One step buffer 25 μL、One step Enzyme Mix 0.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、模板RNA 5.0 μL、補ddH2O至50 μL。RT-PCR反應(yīng)程序為：50 ℃ 30 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，54 ℃(或53 ℃) 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BVDV-1單項RT-PCR對BVDV-1組、BVDV-1+BVDV-2組均擴增出大小約為279 bp的特異性條帶，大小與預期相符，而BVDV-2組和陰性對照組均無目的條帶(圖1)；BVDV-2單項RT-PCR對BVDV-2組、BVDV-1+BVDV-2組均擴增出與預期大小相符的特異性條帶，大小約為180 bp，而BVDV-1組和陰性對照組均無目的條帶(圖2)。

M.DNA 標準DL 2 000;1.BVDV-1；2.BVDV-2；3.BVDV-1+BVDV-2；4.陰性對照

2.2 雙重RT-PCR反應(yīng)條件的建立及優(yōu)化

對RT-PCR反應(yīng)條件進行優(yōu)化，確定了雙重RT-PCR擴增反應(yīng)最適模板用量為5 μL(模板含量為0.1 μg)，引物P1、P2、P3、P4最適用量各為0.5 μL(引物濃度為0.5 mmol/L)，最適退火溫度為55 ℃。雙重RT-PCR反應(yīng)體系為：2×One step buffer 25 μL、One step Enzyme Mix 0.5 μL、引物P1 0.5 μL、引物P2 0.5 μL、引物P3 0.5 μL、引物P4 0.5 μL、模板RNA 5.0 μL、補ddH2O至50 μL。RT-PCR反應(yīng)程序為：50 ℃ 30 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BVDV-1組可擴增出大小約為279 bp的特異性條帶，BVDV-2組可擴增出大小約為180 bp的特異性條帶，BVDV-1+BVDV-2可同時擴增出大小約為279 bp和180 bp的2條特異性條帶，大小均與預期相符，而陰性對照組無目的條帶(圖3)。

M.DNA 標準DL 2 000;1.BVDV-1；2.BVDV-2；3.BVDV-1+BVDV-2；4.陰性對照

M.DNA 標準DL 2 000;1.BVDV-1；2：BVDV-2；3.BVDV-1+BVDV-2；4.陰性對照

2.3 特異性試驗結(jié)果

雙重RT-PCR方法對BVDV-1、BVDV-2可分別擴增出279 bp、180 bp目的片段，對BVDV-1+BVDV-2可擴增出2條特異性條帶，大小分別為279 bp和180 bp，而對IBRV、BRV、BCV、BPIV-3、CSFV均未擴增出任何特異性條帶(圖4)，表明BVDV雙重RT-PCR檢測方法具有良好的特異性。

M.DNA 標準DL 2 000;1.BVDV-1；2.BVDV-2；3.BVDV-1+BVDV-2；4.IBRV；5.BRV；6.BCV；7.BPIV3；8.CSFV；9.陰性對照

2.4 敏感性試驗結(jié)果

雙重RT-PCR方法對10-3倍稀釋的BVDV-1基因組可擴增出279 bp的目的條帶(圖5)，對10-4倍稀釋的BVDV-2基因組可擴增出180 bp的目的條帶(圖6)。經(jīng)紫外分光光度計測定核酸濃度，并計算拷貝數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該雙重RT-PCR方法對BVDV-1和BVDV-2的最低檢測量分別為1×103拷貝/μL和1×102拷貝/μL，表明BVDV雙重RT-PCR檢測方法具有良好的靈敏度。

M.DNA 標準DL 2 000;1.10-1；2.10-2；3.10-3；4.10-4；5.陰性對照

M.DNA 標準DL 2 000;1.10-1；2.10-2；3.10-3；4.10-4；5.10-5；6.陰性對照

2.5 重復性試驗結(jié)果

雙重RT-PCR方法對BVDV-1、BVDV-2、BVDV-1+BVDV-2、IBRV、BRV、BCV、BPIV-3、CSFV核酸重復檢測3次的結(jié)果完全一致(表2)，表明BVDV雙重RT-PCR檢測方法具有良好的重復性和穩(wěn)定性。

表2 雙重RT-PCR重復性試驗結(jié)果

2.6 臨床樣品檢測

應(yīng)用BVDV雙重RT-PCR檢測方法對2017年-2019年采集于四川省達州及周邊地區(qū)的332份臨床糞便樣品進行檢測，共檢測出BVDV-1陽性樣品26份，BVDV-2陽性樣品3份，BVDV-1+BVDV-2混合感染樣品0份，BVDV-1陽性率達7.83%，BVDV-2陽性率達0.90%，差異顯著(P<0.05)，其中2017年、2018年和2019年的BVDV-1陽性率分別為6.82%、8.49%和7.97%，差異不顯著(P>0.05)，BVDV-2陽性率分別為0、0.94%和1.44%，差異不顯著(P>0.05)(表3)。表明該地區(qū)存在一定程度BVDV-1和BVDV-2感染。

表3 臨床樣品檢測結(jié)果

3 討論

近年來，隨著我國養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，動物及其產(chǎn)品的跨地區(qū)調(diào)運日益頻繁，由此帶來的動物疫病傳播風險劇增，牛病毒性腹瀉作為一種重要的牛傳染性疫病，嚴重威脅養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展。因此，實驗室監(jiān)測和分子流行病學調(diào)查工作在BVDV防控中發(fā)揮重要作用。有學者采用PCR方法先后對我國南疆、天津地區(qū)奶牛和吉林地區(qū)肉牛，以及川藏部分高原地區(qū)牦牛樣品進行BVDV病原學分析，發(fā)現(xiàn)上述地區(qū)主要流行毒株為BVDV-1型[14-17]。對江浙地區(qū)奶牛腹瀉糞便進行檢測，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)同時存在BVDV-1和BVDV-2型感染，并且在江蘇地區(qū)發(fā)現(xiàn)一定程度的BVDV-1+BVDV-2型混合感染[18-19]。BVDV與CSFV同屬黃病毒屬，具有抗原相似性，可發(fā)生血清學交叉反應(yīng)。有關(guān)疫苗生產(chǎn)企業(yè)為掌握其2012年-2017年生產(chǎn)的豬瘟疫苗中BVDV污染情況，采用RT-PCR方法對豬瘟疫苗生產(chǎn)所用的原輔材料、半抗原及成品等進行BVDV檢測，發(fā)現(xiàn)新生牛血清、新生牛睪丸、豬瘟抗原和成品豬瘟疫苗均存在不同程度的BVDV污染。使用BVDV污染的豬瘟疫苗免疫豬群可導致其感染BVDV，并出現(xiàn)類似于非典型豬瘟癥狀。因此，帶有BVDV抗原的血清和牛睪丸嚴禁用于CSFV培養(yǎng)[20]。有學者發(fā)現(xiàn)豬群中存在BVDV感染的跡象，一旦BVDV強毒株在豬群內(nèi)流行，將會給養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展造成新威脅[21]。

BVDV-1和BVDV-2臨床癥狀極為相似，僅憑外部觀察無法對其做出準確的臨床診斷。因此，BVDV分型檢測方法在實驗室診斷中扮演重要角色。PCR方法具有操作簡單、成本低廉、靈敏特異等優(yōu)點，是當前最簡單、最常用的分子生物學技術(shù)，特別適合于基層獸醫(yī)實驗室進行動物疫病臨床診斷和流行病學分析，而雙重PCR方法是在同一個反應(yīng)體系中加入2種病原的特異性引物，根據(jù)不同病原擴增片段大小而實現(xiàn)2種病原的鑒別診斷。BVDV為單股RNA病毒，其在PCR擴增前需將病毒基因組反轉(zhuǎn)錄為cDNA，而一步法RT-PCR擴增試劑盒將反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增過程合并，只需一個反應(yīng)體系即可實現(xiàn)病毒基因組的快速擴增，大大縮短檢測時間，增加檢測靈敏度，可降低交叉污染的發(fā)生率。

本研究根據(jù)BVDV-1(AF091605.1、KF501393.1、MK204904.1、MN513404.1和MG923683.1)和BVDV-2 (AF502399.1、MG436782.1、 AF145969.1、KC176777.1和MN513411.1)流行毒株5′-UTR保守序列設(shè)計2對特異性引物，以BVDV-1和BVDV-2毒株基因組為模板，摸索、優(yōu)化反應(yīng)條件，建立BVDV雙重RT-PCR檢測方法，對檢測方法的特異性、敏感性和重復性進行驗證。試驗結(jié)果表明，建立的BVDV雙重RT-PCR方法對BVDV-1和BVDV-2可分別擴增出279 bp和180 bp目的條帶，與IBRV、BRV、BCV、BPIV-3和CSFV不發(fā)生交叉反應(yīng)；該雙重RT-PCR方法對BVDV-1和BVDV-2的最低檢測量分別為1×103拷貝/μL和1×102拷貝/μL；3次重復試驗結(jié)果完全一致，表明建立的檢測方法具有良好的特異性、敏感性和重復性，可用于BVDV的臨床診斷和分子流行病學調(diào)查。對2017年-2019年采于達州及周邊地區(qū)的332份臨床樣品進行檢測發(fā)現(xiàn)，BVDV陽性率為8.73%，其中2017年-2019年BVDV-1陽性率分別為6.82%、8.49%和7.97%，BVDV-2陽性率分別為0、0.94%和1.44%，3個年度BVDV-1陽性率為7.83%，BVDV-2陽性率為0.90%，并未檢出2種病原混合感染的臨床樣品，該地區(qū)BVDV陽性率顯著低于文獻報道的四川地區(qū)和國內(nèi)其他區(qū)域[16-17,22]。這與達州地區(qū)多年來對動物疫病防控工作的重視和辛勤付出密切相關(guān)，但該地區(qū)BVDV流行形勢復雜多變，主要流行毒株仍為BVDV-1，但近年來BVDV-2陽性感染時有發(fā)生，因此，加強BVDV的監(jiān)測和防控，特別是BVDV-2的監(jiān)測應(yīng)予以高度重視。