布魯氏菌BAB-RS25305蛋白對(duì)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響

朱德馨， 吳 潔， 郭 嘉， 陶婷婷， 李 佳， 王梓行， 邱潤(rùn)輝，張 輝*

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第八師畜牧獸醫(yī)工作站，新疆石河子 832000)

布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌屬的細(xì)菌侵入機(jī)體引起傳染-變態(tài)反應(yīng)性的人獸共患傳染病[1]。動(dòng)物布魯氏菌病的主要特征為關(guān)節(jié)炎、母畜流產(chǎn)、公畜睪丸炎等[2]；布魯氏菌在人類(lèi)宿主中表現(xiàn)為潛伏期長(zhǎng)，導(dǎo)致慢性、虛弱的感染，并伴有嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)，如發(fā)熱、致炎、肝腫大和脾腫大等[3]。

布魯氏菌主要感染吞噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞[4]。當(dāng)布魯氏菌侵入宿主機(jī)體后，首先是持續(xù)7 d～15 d的急性感染期，導(dǎo)致宿主發(fā)生菌血癥[5]，宿主細(xì)胞的模式識(shí)別受體NLRP3炎性小體感知布魯氏菌病原體相關(guān)的分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，如布魯氏菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和鞭毛蛋白等[6]，并激活caspase-1，導(dǎo)致白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素-18(IL-18)等促炎細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而引起炎癥反應(yīng)，而炎癥反應(yīng)的發(fā)生有利于宿主抵御布魯氏菌的入侵[7-10]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥發(fā)生也與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)有關(guān)，1995年P(guān)ahl H L等[11]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)積累引起的內(nèi)部壓力也誘導(dǎo)NF-κB DNA結(jié)合和NF-κB依賴(lài)的核基因表達(dá)。Maarten F等研究發(fā)現(xiàn)布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)(type Ⅳ secretion system，T4SS)分泌蛋白VceC可以觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而導(dǎo)致布魯氏菌炎癥反應(yīng)[12]。

本研究使用NCBI以及牛布魯氏菌2308基因組的推導(dǎo)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)prodoric release對(duì)BAB-RS25305基因進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)BAB-RS25305基因?qū)儆谕ㄓ脩?yīng)激蛋白家族，具有USP結(jié)構(gòu)域。當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激環(huán)境下其表達(dá)增強(qiáng)，并且能夠增強(qiáng)細(xì)胞的存活率，但其在布魯氏菌中具體功能研究甚少。本研究通過(guò)對(duì)BAB-RS25305基因進(jìn)行原核表達(dá)并純化，用其刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，檢測(cè)其對(duì)炎癥因子的影響，為初步探究BAB-RS25305蛋白的表達(dá)以及功能奠定基礎(chǔ)，也為揭示布魯氏菌的胞內(nèi)生存以及致病機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒E.coliDH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；T-Vector PMD19(simple),購(gòu)自TaKaRa公司；pET-32a(+)載體，由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院保存。

1.1.2 試劑 2×Taqmaster mix(Dye)、細(xì)胞RNA提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒，康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒，北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ，TaKaRa公司產(chǎn)品；EtEraserSE內(nèi)毒素去除試劑盒，廈門(mén)鱟試劑生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 恒溫?fù)u床(SY-2230)，深圳市塞亞泰科儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；電泳儀(CIea-ver)，諾王(上海)生物科技有限公司產(chǎn)品；PCR儀(Mastercycler nexus gradient)，德國(guó)EPPENDORF公司產(chǎn)品；超靈敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Fluor Chem E)，普諾森生物Protein Simple公司產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)儀(Infinite 200M/F Pro)，瑞士帝肯(TECAN)公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)(Thermo Heraeus Biofuge Stratos)，賽默飛世爾公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中GenBank所提供的BAB-RS25305基因序列，使用Primer 5.0生物軟件設(shè)計(jì)引物(引物序列見(jiàn)表1)，引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。

表1 BAB-RS25305基因引物序列

1.2.2 BAB-RS25305基因PCR擴(kuò)增 以滅活的布魯氏菌S2308為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為20 μL：ddH2O 7.6 μL，上、下游引物各0.2 μL，模板2.0 μL，2×Taqmastermix(Dye)10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 40 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)目的條帶進(jìn)行回收。將回收產(chǎn)物與T-Vector PMD19載體16 ℃水浴過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞后涂布于氨芐抗性的平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。篩選陽(yáng)性克隆菌，搖菌，菌液進(jìn)行PCR鑒定并送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 BAB-RS25305重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將測(cè)序成功的PMD19-T-BAB-RS25305重組質(zhì)粒和pET-32a(+)載體進(jìn)行雙酶切，酶切體系為20 μL：質(zhì)粒10 μL，ddH2O6 μL，1×M buffer 2 μL，Hind Ⅲ 1 μL、EcoRⅠ 1 μL。酶切條件：37 ℃，酶切4 h。酶切產(chǎn)物回收后與pET-32a(+)載體16 ℃水浴鍋過(guò)夜連接，然后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆菌進(jìn)行雙酶切鑒定和送往公司測(cè)序。將測(cè)序和雙酶切驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，涂布氨芐平板后篩選陽(yáng)性菌進(jìn)行菌液PCR鑒定和送往公司測(cè)序。

1.2.4 BAB-RS25305重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將PCR鑒定和測(cè)序正確的克隆菌接種于20 mL含20 μL氨芐抗性的 LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。取過(guò)夜培養(yǎng)菌液1 mL重新接種于氨芐抗性LB中，搖菌直至OD600 nm約為0.4左右。加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，分別在0、2、4、6、8 h時(shí)間點(diǎn)各收取菌液1 mL，12 000 r/min離心1 min，棄上清，于沉淀中加入80 μL ddH2O后，再加入20 μL 5×SDS-PAGE Loding buffer，吹打混勻，煮樣10 min后進(jìn)行SDS-PAGE。觀察電泳結(jié)果，確定BAB-RS25305重組蛋白最佳表達(dá)時(shí)間，并在蛋白表達(dá)量最佳的時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。

1.2.5 BAB-RS25305重組蛋白的純化 將活化菌液轉(zhuǎn)接至120 mL LB液體培養(yǎng)基中，待其OD 600 nm達(dá)到0.6左右，以1 mmol/L的濃度加入IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，4 ℃離心機(jī)收集全部菌液，棄上清留下沉淀，然后用PBS緩沖液重懸菌體，并于液氮和42 ℃水浴鍋反復(fù)凍融3次后超聲破碎，離心后進(jìn)行蛋白可溶性分析，用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒對(duì)蛋白包涵體進(jìn)行純化，純化后的蛋白依次通過(guò)6、4、2、1 mol/L尿素和PBS緩沖液進(jìn)行透析復(fù)性,復(fù)性后的蛋白使用蔗糖進(jìn)行濃縮，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，最后用EtEraserSE 內(nèi)毒素去除試劑盒去除蛋白中內(nèi)毒素，蛋白濃度低于1 EU/mL可用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.6 RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞的培養(yǎng) 從液氮罐中取出凍存的RAW264.7細(xì)胞，放入37 ℃水浴鍋中，不停攪拌至完全融化，細(xì)胞懸液移至15 mL離心管中，1 000 r/min、離心5 min。用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞吹打混勻后移入中號(hào)培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h；吸去上清，PBS沖洗3遍，加入胰酶消化，棄胰酶加入3 mL左右細(xì)胞培養(yǎng)液吹打細(xì)胞至懸浮，移至大號(hào)培養(yǎng)板中在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。

1.2.7 BAB-RS25305重組蛋白刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 將培養(yǎng)3 d后的細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，鋪6孔板。試驗(yàn)組分為：BAB-RS25305重組蛋白刺激組以及PBS陰性對(duì)照組。BAB-RS25305重組蛋白組：6孔板中加入終濃度為50 μL/mL的純化的BAB-RS25305蛋白；陰性對(duì)照組：加入等體積的PBS作為對(duì)照。鋪好板后，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.8 檢測(cè)巨噬細(xì)胞中NLRP3和caspase-1 RNA水平的表達(dá) 6孔板孵育24 h后，棄上清，用500 μL Trizol Reagent裂解細(xì)胞，收集于 RNase-Free 1.5 mL離心管中，按照RNA提取試劑盒提取RNA，Nanodrop-2000檢測(cè)RNA濃度。然后按照cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系為10 μL：SYBR Green Real-time PCR Master Mix 5 μL、ddH2O 3.6 μL、上、下游引物各0.2 μL、cDNA模板1 μL。每個(gè)樣品重復(fù)3次。以NAPDH為內(nèi)參，用2-△△Ct法來(lái)對(duì)NLRP3和caspase-1的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.2.9 檢測(cè)巨噬細(xì)胞中炎癥因子蛋白水平的表達(dá) 6孔板孵育24 h后，棄上清，PBS沖洗3遍，細(xì)胞刮刮下細(xì)胞。1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入250 μL RIPA Lysis buffer、2.5 μL PMSF和2.5 μL磷酸酶抑制劑的混合液，混勻后冰上裂解30 min，13 000 r/min離心10 min，收集上清，用BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度。加SDS-PAGE Loding buffer，煮樣備用。然后轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育，最后進(jìn)行蛋白檢測(cè)，保存圖片。

2 結(jié)果

2.1 BAB-RS25305基因PCR擴(kuò)增

BAB-RS25305基因以滅活的布魯氏菌全基因組DNA為模板，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)一條大小為450 bp左右的特異性目的條帶，與預(yù)期片段大小一致(圖1)。

2.2 BAB-RS25305重組質(zhì)粒的雙酶切

將構(gòu)建好的pET-32a-BAB-RS25305重組質(zhì)粒用Hind Ⅲ、EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)過(guò)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)2條條帶(圖2)，大小約為5 900 bp系pET-32a(+)載體條帶，450 bp左右系目的基因條帶。公司測(cè)序結(jié)果與GenBank中BAB-RS25305基因序列同源性達(dá)到100%，表明pET-32a-BAB-RS25305表達(dá)載體構(gòu)建成功。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～5.BAB-RS25305基因PCR產(chǎn)物；6.陰性對(duì)照

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 10 000;1、2.pET32a-BAB-RS25305Hind Ⅲ、EcoRⅠ的雙酶切鑒定；3.陰性對(duì)照

2.3 BAB-RS25305重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)以及純化

將構(gòu)建好的pET-32a-BAB-RS25305表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌感受態(tài)細(xì)胞DE3中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，在活化菌液中加入IPTG，分別在0、2、4、6、8 h收集菌液，并設(shè)置空菌以及空載，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，BAB-RS25305蛋白大小約為32 ku，并且在6 h時(shí)表達(dá)量最大(圖3)，經(jīng)過(guò)對(duì)BAB-RS25305蛋白進(jìn)行可溶性分析結(jié)果顯示，BAB-RS25305蛋白在主要以包涵體的形式進(jìn)行表達(dá)，利用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(包涵體蛋白)進(jìn)行純化(圖4)。

2.4 BAB-RS25305蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞NLRP3和caspase-1 mRNA水平表達(dá)的影響

根據(jù)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中炎癥因子結(jié)果顯示，在BAB-RS25305重組蛋白刺激小鼠巨噬細(xì)胞24 h后，BAB-RS25305蛋白試驗(yàn)組NLRP3的表達(dá)量極顯著高于PBS對(duì)照組(P<0.01)，caspase-1 mRNA表達(dá)量顯著高于PBS對(duì)照組(P<0.05)(圖5)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.E.coli BL21(DE3)陰性對(duì)照；2.PET-32a空載體誘導(dǎo)產(chǎn)物；3～7.表達(dá)菌誘導(dǎo)0、2、4、6、8 h

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～3.純化后rBAB-RS25305蛋白

2.5 BAB-RS25305蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞NLRP3和caspase-1蛋白水平表達(dá)的影響

根據(jù)Western blot檢測(cè)結(jié)果，與PBS對(duì)照組相比，BAB-RS25305蛋白刺激小鼠巨噬細(xì)胞24 h后NLRP3和caspase-1的蛋白表達(dá)量都極顯著的增加(P<0.01)(圖6)。

A.NLRP3；B.caspase-1

圖6 Western blot檢測(cè)炎癥因子NLRP3和caspase-1在24 h時(shí)蛋白的表達(dá)量

3 討論

布魯氏菌是一種兼性的胞內(nèi)病原體，可抵抗中性粒細(xì)胞的殺傷，也可在巨噬細(xì)胞和“非專(zhuān)業(yè)”吞噬細(xì)胞中復(fù)制，并與宿主細(xì)胞保持長(zhǎng)期相互作用[13]。布魯氏菌的一個(gè)關(guān)鍵致病特征是它們?cè)诿庖呒?xì)胞中生存并在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的組織中持續(xù)存在的能力。與其他革蘭氏陰性菌相比，一旦感染布魯氏菌并沒(méi)有立即導(dǎo)致受侵襲部位產(chǎn)生炎癥，而是在出現(xiàn)癥狀之前有一個(gè)2周～4周的潛伏期[5]，所以布魯氏菌在黏膜表面和全身擴(kuò)散的過(guò)程中，必須逃避先天免疫來(lái)躲避宿主檢測(cè)，進(jìn)而在細(xì)胞中大量的增殖[14-15]，因此，更好地了解布魯氏菌與宿主免疫系統(tǒng)之間的相互作用，對(duì)研究布魯氏菌的致病機(jī)制以及治療方法尤為重要。

宿主先天性免疫系統(tǒng)的第一個(gè)防御機(jī)制是通過(guò)模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)感應(yīng)病原體，并通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞因子和抗微生物中間體迅速做出反應(yīng)[16]。由PRR介導(dǎo)的微生物可識(shí)別病原體相關(guān)的分子模式，保守的微生物成分[17]和源于危險(xiǎn)的信號(hào)(危險(xiǎn)相關(guān)的分子模式)[18]。最常見(jiàn)的PAMP是細(xì)菌脂蛋白、肽聚糖、LPS、鞭毛蛋白，以及源自細(xì)菌、病毒、真菌和原生動(dòng)物的核酸[19]。而模式識(shí)別受體參與誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，這對(duì)于宿主抵抗各種病原體是非常重要的。NLRP3炎癥小體作為布魯氏菌侵襲細(xì)胞的主要模式識(shí)別受體，它屬于NOD樣受體家族(nucleotide binding oligomerization domain like receptors,NLR)，其激活一部分與布魯氏菌感染誘導(dǎo)的線粒體活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生有關(guān)，ROS的產(chǎn)生誘導(dǎo)硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)與NLRP3相互作用，導(dǎo)致其激活釋放caspase-1，最終產(chǎn)生IL-1β[20-21]。布魯氏菌激活NLRP3炎癥小體的另一條途徑是布魯氏菌在感染期間誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活了未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)的肌醇需求酶1ɑ(inositol-requiring transmembrane kinase /endonuclease-1 ɑ，IRE1ɑ)途徑，導(dǎo)致TXNIP和NLRP3募集到線粒體，在那里它們以一種獨(dú)立于caspase-1的機(jī)制參與線粒體ROS的產(chǎn)生[22]。但是有研究表明,炎性小體過(guò)多的激活可能會(huì)導(dǎo)致一些與神經(jīng)布魯氏菌病癥狀相關(guān)的疾病[23]。本試驗(yàn)首先對(duì)布魯氏菌BAB-RS25305基因進(jìn)行原核表達(dá)，將純化好的布魯氏菌BAB-RS25305蛋白刺激小鼠巨噬細(xì)胞導(dǎo)致NLRP3和caspase-1的表達(dá)水平都顯著提高。說(shuō)明BAB-RS25305蛋白刺激巨噬細(xì)胞后，引起了NLRP3炎性小體的激活來(lái)識(shí)別布魯氏菌病原體相關(guān)分子模式，進(jìn)而活化caspase-1，從進(jìn)下游細(xì)胞因子的分泌與成熟產(chǎn)生。但是BAB-RS25305蛋白刺激后NLRP3的激活是與線粒體ROS的產(chǎn)生有關(guān)還是通過(guò)未折疊蛋白反應(yīng)的IRE1ɑ途徑，目前還不清楚。

總之，本研究證明布魯氏菌BAB-RS25305蛋白侵入宿主細(xì)胞后，炎癥因子NLRP3和caspase-1的表達(dá)顯著提高，進(jìn)一步說(shuō)明此蛋白可能參與炎癥反應(yīng)，為研究布魯氏菌的胞內(nèi)生存以及致病機(jī)制提供了理論依據(jù)。但是BAB-RS25305蛋白刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥因子的釋放的機(jī)制，以及炎癥反應(yīng)的發(fā)生是否與未折疊蛋白反應(yīng)有關(guān)還需要進(jìn)一步研究。