水酶法提取黃刺玫籽油的工藝條件優(yōu)化

◎ 殷春燕，謝廣明，韓博洋，張獻忠，李 丹，董占軍

（1.邯鄲學院 生命科學與工程學院，河北 邯鄲 056005；2.河北美臨多維糧油貿易有限公司，河北 邯鄲 056600）

黃刺玫（Rosa xanthinaLindl）屬薔薇科薔薇屬野生落葉灌木，晉南地區(qū)民間將其稱為馬茹子，廣泛分布于南太行山區(qū)[1-2]。研究表明，黃刺玫果實營養(yǎng)豐富，含有維生素、黃酮、蘆丁等物質，具有調節(jié)人體機能、抗氧化等功能[3]。黃刺梅果質量的50%～60%為黃刺玫籽，其中黃刺玫籽中含脂肪11%左右。黃刺玫籽油中富含維生素E、維生素A等多種微量元素和不飽和脂肪酸（約94%）[4]，其中亞油酸和亞麻酸的含量分別為53.88%、24.06%，因此黃刺玫籽油可作為一種新興油脂產品，具有廣闊的發(fā)展前景。

黃刺玫鮮果資源十分豐富，每667 m2產量為60～80 kg[2]，因相關研究較少，對其開發(fā)利用不足，導致大量的黃刺玫籽被白白浪費，因此有效利用黃刺玫籽，建立一種綠色高效的黃刺玫籽油提取方法顯得尤為重要。目前，植物油的提取方法主要包括壓榨法、溶劑萃取法、超聲輔助法、水酶法以及超臨界CO2萃取法等[5-8]。其中水酶法因反應條件溫和、無溶劑殘留、對環(huán)境友好等優(yōu)點被廣泛用于胡麻籽油[9]、牡丹籽油[10]、山核桃油[11]等植物油脂的提取。黃刺玫籽油作為一種新興油脂產品，相關研究還較少，目前只有溶劑萃取法[12]和超臨界CO2萃取法[4]被用于黃刺玫籽油的提取，水酶法在黃刺玫籽油提取中的應用在國內外還沒有相關報道。因此，本文以水酶法作為提取方法，采用單因素實驗分析5個因素（酶的種類、料液比、酶解時間、pH及酶添加量）對黃刺玫籽油提取率的影響，并在單因素基礎上選出影響較大的因素，利用響應面Box-Behnken設計建立模型，對黃刺玫籽油提取工藝條件進行優(yōu)化，確定水酶法提取黃刺玫籽油的最佳工藝，以便為黃刺玫籽油的開發(fā)利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃刺玫籽，市售；纖維素酶（≥30 000 U·g-1）、堿性蛋白酶（≥30 000 U·g-1）、中性蛋白酶（≥200 000 U·g-1）、半纖維素酶（≥2 000 U·g-1）、果膠酶（≥30 000 U·g-1），合肥博美生物有限公司。

1.2 儀器與設備

YS-08高速粉碎機，北京燕山正德機械設備有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科貿有限公司；N-1100旋轉蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；80-2型臺式電動離心機，國華電器有限公司；GRX-200電熱恒溫鼓風干燥箱，西安禾普生物科技有限公司；2004-21（61）超級恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；FA2104N電子天平，上海精密科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 黃刺玫籽油的提取

選擇正常并經自然干燥，無霉爛的黃刺玫籽，置于60 ℃烘箱中，烘干30 min。將黃刺玫籽用萬能粉碎機進行粉碎，過篩（60目），備用。

準確稱取一定質量的黃刺玫籽粉末，加入蒸餾水（料液比1∶8）作為分散相，用0.1 mol·L-1的HCl 和0.1 mol·L-1的NaOH調節(jié)pH，加酶，混勻，酶解5 h后，95 ℃保溫10 min滅酶，將酶解液在5 000 r·min-1的條件下離心20 min，取上清液即為黃刺玫籽油。對得到的黃刺玫籽油進行稱重，按式（1）計算提取率[13]。

式中：m1-黃刺玫籽油質量，g；m0-黃刺玫粉的質量，g。

1.3.2 單因素試驗

針對黃刺玫籽酶解過程中涉及的5個主要酶解條件進行單因素試驗，各個條件梯度設置如表1所示。

表1 單因素試驗設計表

1.3.3 響應面實驗設計

在單因素實驗基礎上，選取對提取率影響較大的3個因素，利用響應面Box-Behnken設計，以黃刺玫籽油提取率y為響應值，優(yōu)化水酶法提取黃刺玫籽油的工藝。

1.4 數(shù)據處理

所有實驗數(shù)據均做3次平行實驗，使用SPSS 20.0對數(shù)據進行方差分析，結果以均值±標準差表示。采用Origin8.0繪圖，響應面實驗設計及分析采用Design Expert8.0。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 酶的種類

酶的種類顯著影響植物油脂的提取率。LIU Z等[14]采用超聲輔助水酶法提取無患子種仁中油脂時，發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶（65.23%±1.45%）和纖維素酶（60.95%±1.45%）的提取效果最佳，果膠酶（42.52%±0.97%）和α-葡聚糖酶（38.91%±0.89%）的提取率較低。楊瑞[15]研究發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶比中性蛋白酶、纖維素酶更適用于奇亞籽油的提取。

在各酶最適溫度和pH下，分別考察果膠酶（50 ℃，pH4.0）、中性蛋白酶（45 ℃，pH7.5）、纖維素酶（50 ℃，pH4.5）、堿性蛋白酶（45 ℃，pH10）和半纖維素酶（50 ℃，pH5.0）對黃刺玫籽油提取率的影響，結果如圖1所示。由圖1可知，單類酶中，纖維素酶（6.43%±0.09%）和中性蛋白酶（6.32%±0.08%）的提取率最高且兩者沒有顯著差異，其次為果膠酶（6.10%±0.10%）和堿性蛋白酶（5.92%±0.16%），半纖維素酶（5.41%±0.08%）的提取率最低。相關研究表明，復合酶可以產生協(xié)同作用，增加油脂的提取率[14,16]，故在50 ℃，pH6.0條件下測定復合酶（纖維素酶∶中性蛋白酶=1∶1）的提取率。結果發(fā)現(xiàn)，復合酶的提取率顯著高于單一酶，故在后續(xù)研究中，選用纖維素酶和中性蛋白酶按照1∶1的比例進行黃刺玫籽油的提取。

圖1 酶的種類對黃刺玫籽油提取率的影響圖

2.1.2 料液比

不同料液比下，黃刺玫籽油的提取率變化情況如圖2所示。由圖2知，料液比＜1∶8時，溶劑比例越大，黃刺玫籽油的提取率越高。當料液比＞1∶8時，提取率開始呈現(xiàn)降低趨勢?？赡苡捎诹弦罕鹊脑龃螅瑢е旅概c底物濃度的降低，從而引起酶解效率下降[17]，因此在后續(xù)提取過程中選擇料液比為1∶8。

圖2 料液比對黃刺玫籽油提取率的影響圖

2.1.3 酶解時間

不同的酶解時間時黃刺玫籽油的提取率變化情況如圖3所示。隨著酶解時間從2 h增加至5 h，黃刺玫籽油的提取率由2.35%±0.10%增加至6.63%±0.09%。酶解時間大于5 h后，提取率不再發(fā)生明顯變化（p＜0.05）。綜合提取率和時間成本來看，水酶法提取黃刺玫籽油的最佳酶解時間為5 h。

圖3 酶解時間對黃刺玫籽油提取率的影響圖

2.1.4 pH

在不同pH下，黃刺玫籽油的提取率變化情況如圖4所示。隨著pH由4.0增加至6.0，黃刺玫籽油的提取率從4.11%±0.12%增加至最大值6.63%±0.09%，當pH由6.0繼續(xù)增加時，提取率開始下降。在pH為8.0時，提取率比pH為6.0時下降了33.18%。在適宜的pH下，酶才能發(fā)揮活性[9]。纖維素酶和中性蛋白酶的最適pH不同，分別為4.5和7.5。在提取過程中，pH偏高或偏低都會影響兩種酶的活力，結果表明在pH為6.0時兩種酶的綜合活力達到最大，因此所用復合酶的最適pH為6.0。

圖4 pH對黃刺玫籽油提取率的影響圖

2.1.5 酶添加量

不同酶添加量時黃刺玫籽油的提取率變化情況如圖5所示。在酶添加量為1%～3%，隨著酶添加量的增加，黃刺玫籽油的提取率由5.25%±0.08%增加至6.85%±0.09%，當添加量到達3%時，黃刺玫籽油的提取率達到最高。酶添加量為3%和4%時的提取率沒有顯著差異，但當酶添加量超過4%時，提取率開始下降。呂秋冰等[18]利用葡聚糖酶提取冬瓜籽油以及楊瑞[15]用堿性蛋白酶提取奇亞籽油時也得到同樣的結果?？赡苡捎诿柑砑恿窟^大，使得酶的活性部位不能充分暴露，減少了酶與黃刺玫籽粉末的接觸機會，酶作用受到限制[17-18]，因此復合酶最佳添加量為3%。

圖5 酶添加量對黃刺玫籽油提取率的影響圖

2.2 響應面優(yōu)化實驗

2.2.1 響應面模型的建立

在單因素實驗基礎上，固定條件為酶解溫度50 ℃、料液比1∶8、復合酶（纖維素酶∶中性蛋白酶）比1∶1，選擇酶解時間、pH、酶添加量3個因素進行Box-Behnken響應面實驗設計，對提取工藝條件進行優(yōu)化。響應面試驗因素水平如表2所示，響應面試驗設計及結果如表3所示。

表2 響應面試驗因素水平表

表3 響應面試驗設計與結果表

對表3中實驗結果進行多元回歸擬合，模型為：提取率y=-47.249 5+2.753 8A+14.640 5B+1.140 2C-0.017 5AB+0.020 0AC+0.057 5BC-0.259 0A2-1.191 5B2-0.254 0C2。方差分析具體情況如表4所示。

表4 方差分析表

由方差分析結果可知，模型p＜0.000 1，失擬項p=0.117 4＞0.05，說明模型具有極高的顯著性。決定系數(shù)R2=0.996 5，校正決定系數(shù)R2=0.992 0，預測R2=0.957 1，說明模型適用于預測不同反應條件下黃刺玫籽油的提取率。所選擇的3個因素都顯著影響黃刺玫籽油的提取率（p＜0.05），且影響大小依次為B（pH）＞A（酶解時間）＞C（加酶量）。此外，模型中二次項A2、B2、C2對黃刺玫籽油提取率的影響極顯著（p＜0.000 1），AB、AC、BC對提取率沒有顯著影響（p＞0.05），說明因素間沒有交互作用。

2.2.2 各因素交互作用的響應面圖

不同因素交互作用對黃刺玫籽油提取率影響的響應面圖如圖6所示。響應面圖能夠直觀反映因素水平改變時提取率的變化情況，響應曲面越陡峭說明該因素水平變化時，提取率的變化越大，因素對提取率的影響越顯著[19-20]。

圖6 不同因素對黃刺玫籽油提取率影響的響應面圖

從圖6中可以看出，所有的響應曲面均存在最高峰，說明在所選擇的因素水平范圍內存在最大值，所選擇的因素水平合理[21]。圖6（a）為固定酶添加量在0水平（3%）時，提取率隨酶解時間和pH改變時的變化情況。當酶添加量不變時，隨著酶解時間和pH的增加，提取率都呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。與酶解時間相比，pH改變時提取率的響應曲面更陡峭。圖6（b）為pH固定在0水平（pH6.0）時，提取率隨酶添加量和酶解時間改變時的變化情況。當酶添加量為3%、酶解時間為5 h時提取率達到峰值，酶添加量和酶解時間的繼續(xù)增加不會引起提取率的升高，反而導致提取率下降。酶解時間對提取率的響應曲面更陡峭。圖6（c）為固定酶解時間0水平（5 h）時，提取率隨酶添加量和pH改變時的變化情況。與上述結果類似，當pH不變時，提取率隨酶添加量的增加，呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，在酶添加量為3%時，提取率達到最大值。同樣，當酶添加量不變時，提取率隨pH變化的趨勢類似隨酶添加量的變化。與酶添加量相比，pH對提取率的響應曲面更陡峭，說明pH的影響更顯著。這與表4中方差分析的結果相吻合。

2.2.3 驗證實驗結果分析

由回歸方程求得黃刺玫籽油提取的最優(yōu)工藝為：酶解時間5 h、酶添加量3.20%、pH6.17，在此工藝條件下，提取率預測為6.94%。并做3組平行實驗作為驗證實驗?？紤]實際實驗條件，將工藝條件調整為酶解時間5 h、酶添加量3.20%、pH6.2，得到提取率為7.05%±0.12%，與預測值相差1.56%，可信度較高，表明回歸模型可以對不同因素條件下黃刺玫籽油的提取率進行預測。

3 結論

本文利用水酶法對黃刺玫籽中的油脂進行提取，采用單因素實驗和響應面實驗探討不同的酶解條件對黃刺玫籽油提取率的影響，并確定水酶法提取黃刺玫籽油的最佳工藝。最佳工藝條件為固定料液比為1∶8、酶解溫度50 ℃、復合酶（纖維素酶∶中性蛋白酶）比1∶1、酶解時間5 h、pH6.2以及酶添加量3.20%，在此條件下，提取率為7.05%±0.12%，與預測值相差1.56%，表明回歸模型可以較好地預測不同因素條件下黃刺玫籽油的提取率。方差分析結果表明，所選擇的3個因素都顯著影響黃刺玫籽油的提取率（p＜0.05），且影響大小依次為pH＞酶解時間＞加酶量。