表面增強(qiáng)拉曼光譜法分析米魚肌肉中組胺

余志引， 藺磊

(1.浙江杰力惠農(nóng)業(yè)科技有限公司，浙江 杭州 310015； 2.浙江農(nóng)藝師學(xué)院，浙江 杭州 310021；3.浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品學(xué)院，浙江 杭州 310058)

生物胺是一類非揮發(fā)性的脂肪族、脂環(huán)族或雜環(huán)類的含氮有機(jī)化合物的總稱，具有一定的生物活性，廣泛存在于生物體及多種食品中[1]。機(jī)體中適量的生物胺具有重要的生理活性，如調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的分泌、控制血壓、參與免疫反應(yīng)等[2-4]。但當(dāng)生物胺攝入過高或在體內(nèi)大量累積時(shí)則可能對機(jī)體產(chǎn)生毒性。其中，組胺是毒性最強(qiáng)的生物胺，攝入組胺含量為80～400 mg·kg-1的魚肉就可能產(chǎn)生輕微中毒反應(yīng)[3]，而當(dāng)攝入濃度超過1 000 mg·kg-1時(shí)便會有嚴(yán)重中毒反應(yīng)，癥狀包括嘔吐、頭暈、腹瀉、過敏等，嚴(yán)重的還可導(dǎo)致休克，甚至危及生命[5]。我國衛(wèi)生部發(fā)布的國家標(biāo)準(zhǔn)《鮮、凍動物性水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[6]規(guī)定組胺含量鮐魚≤1 000 mg·kg-1、其他魚類≤300 mg·kg-1；而歐盟限定魚肉中組胺的平均含量≤100 mg·kg-1[7]。此外，美國FDA還將組胺含量超過50 mg·kg-1作為評判魚肉變質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)[5]。因此，準(zhǔn)確快速地檢測魚肉中組胺的含量，對保證魚肉品質(zhì)及消費(fèi)者的健康安全具有重要意義。

傳統(tǒng)對于魚肉中組胺的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、熒光定量法、離子交換色譜法、毛細(xì)管電泳法和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等[8-11]，這些方法雖然靈敏度較高，但由于實(shí)驗(yàn)前處理繁瑣、檢測耗時(shí)較長、儀器攜帶不便和試劑價(jià)格貴等原因均具有一定的局限性。表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)是一種高靈敏度的指紋圖譜，“表面增強(qiáng)”一詞是指化合物分子吸附到某些納米級粗糙金屬(如金、銀、銅)的表面或溶膠中，其拉曼信號成幾何倍數(shù)的增強(qiáng)[12-14]，因此，SERS技術(shù)能實(shí)現(xiàn)對微量樣品和單分子的快速檢測。同時(shí)，SERS具有前處理方法簡單、儀器攜帶方便且檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)產(chǎn)品殘留農(nóng)藥的快速篩查[15]、食品中痕量物質(zhì)的檢測[16]、環(huán)境中危害物的檢測[17]等方面應(yīng)用廣泛。Gao等[18]采用分子印跡聚合物(MIPs)法結(jié)合SERS技術(shù)，以金納米粒子為增強(qiáng)基底，成功建立了快速檢測金槍魚罐頭中組胺含量的方法，檢測范圍為3～90 mg·kg-1；Xie等[19]采用SERS聯(lián)合薄層色譜(TLC)法建立了快速篩查魚肉中組胺的方法，其準(zhǔn)確度和靈敏度可以媲美歐盟(EU)官方使用的HPLC；Zhang等[20]利用SERS技術(shù)分析了芽孢桿菌的生物標(biāo)志物二皮考啉酸鈣(CaDPA)的含量，結(jié)果表明以銀納米球?yàn)榛?，僅5 s的數(shù)據(jù)采集便可快速分析得到相當(dāng)于104孢子量的CaDPA，顯示出SERS在環(huán)境危害物檢測方面較好的應(yīng)用前景。然而，采用SERS技術(shù)檢測新鮮魚肉中組胺含量的研究報(bào)道較少。因此，本文以石首科新鮮米魚肌肉為載體，模擬魚肉在儲存過程中組胺的變化，以金納米溶膠為基底，利用SERS技術(shù)結(jié)合密度泛函理論對魚肉中組胺含量進(jìn)行定性定量分析，并用國標(biāo)法進(jìn)行驗(yàn)證；最后，采用SERS對4 ℃下放置了1、4、7 d的米魚肉中組胺的含量進(jìn)行預(yù)測，用國標(biāo)法進(jìn)行結(jié)果評判。

1 材料與方法

1.1 材料

組胺(分析純99.7%，Sigma-Aldrich)；硝酸銀、高氯金酸、檸檬酸三鈉、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、三氯乙酸、正己烷、碳酸鈉、正丁醇、氯仿、谷氨酸鈉、丙酮、乙醚、甲醇等化學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純(上海晶純實(shí)業(yè)有限公司)；新鮮米魚由奉化興洋水產(chǎn)食品有限公司提供，捕自寧波奉化海產(chǎn)品捕撈基地，冰溫條件下12 h內(nèi)運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室-20 ℃凍存。實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

1.3 樣品制備

內(nèi)標(biāo)液為濃度200 mg·L-1組胺標(biāo)準(zhǔn)品。配置組胺的標(biāo)準(zhǔn)液分別設(shè)置濃度為0.5、1、10、5、25、50、75、100 mg·L-1。制作17份米魚肉樣本，配置組胺濃度為1、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、75、80、90、95、100 mg·L-1，預(yù)留空白樣本。

選取4 ℃下放置1、4、7 d的米魚肉各5份，參照GB/T 5009.208—2008中HPLC濃度檢測檢驗(yàn)方法準(zhǔn)確度。

取米魚背部肌肉切碎，每份5 g。樣品勻漿后按1∶5的料液比加入12%濃度的三氯乙酸，60 W功率下超聲提取15 min，3 600 r·min-1離心5 min，取上清用定量濾紙過濾，重復(fù)提取1次，合并上清液，用三氯乙酸定容至50 mL(樣本制備40 min完成，取待測液預(yù)備拉曼上機(jī))。

除脂：取10 mL待測液于25 mL具塞試管中，加入等體積正己烷，渦旋振蕩5 min，除去有機(jī)相，重復(fù)進(jìn)行2次。

萃?。簩⑸鲜龀笕芤杭尤脒m量氯化鈉使其飽和，準(zhǔn)確移取2.0 mL于15 mL離心管中，用2 mol·L-1的NaOH溶液調(diào)pH至12，加入2.0 mL正丁醇-氯仿(1∶1)混合溶液，渦旋振蕩5 min后于3 600 r·min-1離心5 min，取上層有機(jī)相，重復(fù)萃取2次。合并萃取液，加入2滴1 mol·L-1的鹽酸并混合，于40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈?，加?.1 mol·L-1的鹽酸1.0 mL溶解殘留物。

衍生：取上述待衍生溶液0.5 mL于10 mL具塞試管中，加入1.5 mL飽和碳酸鈉溶液(現(xiàn)配)和1.0 mL丹磺酰氯(10 mg·mL-1丙酮溶液)衍生溶液，振蕩混勻后于60 ℃烘箱中反應(yīng)30 min，中間振蕩2次。取出后加入100 μL谷氨酸鈉(50 mg·mL-1飽和碳酸氫鈉溶液)，振蕩混勻，60 ℃保溫15 min，加入1 mL超純水，于40 ℃水浴下氮?dú)獯等ケ?，加? mL乙醚萃取，得乙醚相，重復(fù)萃取2次，合并乙醚萃取液，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?.0 mL甲醇溶解殘留物，0.22 μm濾膜過濾(樣本制備7 h完成，用HPLC測定)。

胎兒期動脈導(dǎo)管開放，又無肺氣的干擾，經(jīng)連續(xù)三血管切面及弓降部冠狀切面的綜合掃查，能較快速發(fā)現(xiàn)血管環(huán)并經(jīng)弓降部冠狀切面進(jìn)行確認(rèn)及進(jìn)一步診斷，同時(shí)可觀察氣管受壓的情況及有無其他畸形。對胎兒出生后能否得到及時(shí)、有效治療，提高胎兒存活率有重要的意義。

1.4 銀納米溶膠和金納米溶膠基底制備

金納米溶膠基底制備采用文獻(xiàn)[12]中的檸檬酸三鈉加熱還原法，其制作過程如下：將一定濃度的高氯金酸溶液(10 mg高氯金酸溶于200 mL超純水中)倒入燒瓶中，放在恒溫磁力攪拌器上，溫度控制在120 ℃恒定加熱至沸騰后，迅速加入一定濃度的檸檬酸三鈉溶液(20 mg檸檬酸三鈉溶于4 mL超純水)，同時(shí)以100 r·min-1轉(zhuǎn)速快速攪拌，制備成的金納米溶膠顏色為酒紅色。待溶液冷卻后，將上述適量膠溶液倒入離心管中，離心后倒掉少量上清液，再往離心管中加入適量超純水，用超聲振蕩混勻，經(jīng)多次提純后，避光保存。

銀納米溶膠基底制備采用Lee-Meisel的檸檬酸三鈉加熱還原法，參照相關(guān)文獻(xiàn)[13]制作：將一定濃度的硝酸銀溶液(36 mg硝酸銀溶于200 mL超純水)倒入燒瓶中，放在恒溫磁力攪拌器上，高溫迅速加熱到沸騰，在2 min內(nèi)逐步滴入濃度為1%的檸檬酸三鈉溶液(60 mg檸檬酸三鈉溶于6 mL超純水)，同時(shí)以200 r·min-1的轉(zhuǎn)速攪拌，此時(shí)溶液慢慢由透明變淡棕色，反應(yīng)25 min后得到灰綠色液體，避光保存。

1.5 高效液相色譜試驗(yàn)條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)；檢測器為光電二極管陣列檢測器(DAD)；流動相：A-甲醇，B-水；流速：0.3 mL·min-1；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；洗脫程序見表1。

表1 高效液相色譜試驗(yàn)梯度洗脫的程序

1.6 拉曼光譜采集

拉曼光譜數(shù)據(jù)采集之前，用乙腈校正儀器采用785 nm激發(fā)波長。參數(shù)如下：功率為200 mW，掃描范圍200～3 300 cm-1，光學(xué)分辨率2 cm-1，積分時(shí)間10 s，采集3次取平均光譜值。將組胺粉末用載玻片壓平在石英板上，用配套顯微鏡平臺進(jìn)行組胺固體采集。向2 mL石英瓶中依次加入500 μL納米增強(qiáng)劑、100 μL待測液、100 μL氯化鈉，放入配套液體樣品池進(jìn)行SERS采集。所有數(shù)據(jù)分析基于MATAB R2014a、Gaussian.v 09、OMNIC v8.2、Origin v8.0、SPSS v17.0平臺完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 組胺的拉曼光譜

圖1 組胺的分子結(jié)構(gòu)

圖2是組胺的拉曼光譜，其中圖2中a為組胺標(biāo)準(zhǔn)品固體的拉曼光譜，圖2中b是采用密度泛函理論計(jì)算模擬得到的組胺拉曼光譜。從圖可看出，譜峰321、376、647、811、1 032、1 099、1 376、1 432、1 477 cm-1與密度泛函理論計(jì)算譜峰319、379、648、811、1 030、1 098、1 291、1 377、1 433、1 478 cm-1基本一致。對組胺進(jìn)行譜峰歸屬[14-16](表2)，其中譜峰321、376 cm-1為組胺分子中骨架表面外彎曲振動，譜峰647和811 cm-1是組胺分子表面外環(huán)振動，譜峰1 032 cm-1為組胺分子的C—H表面內(nèi)變形振動，譜峰1 099 cm-1為組胺分子的C—N伸縮振動，譜峰1 376、1 477 cm-1為組胺分子環(huán)伸縮振動，譜峰1 432 cm-1是組胺分子的環(huán)振動和N—H基團(tuán)的表面內(nèi)彎曲振動共同作用。這些譜峰可作為組胺的拉曼特征峰。

圖2 (a)組胺粉末及其分子模擬(b)計(jì)算得到的拉曼光譜

2.2 不同納米增強(qiáng)基底對組胺標(biāo)準(zhǔn)品分子的增強(qiáng)效果

圖3中a和b分別是濃度為100 mg·L-1的組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液銀納米基底和金納米基底SERS光譜，圖3中c和d為組胺溶液拉曼光譜和三氯乙酸溶劑的拉曼光譜圖。組胺普通拉曼光譜所獲得譜峰為溶劑三氯乙酸有效特征峰432、749、844、939、1 339 cm-1。而在SERS光譜圖中a和b獲得953、992、1 030、1 106、1 186、1 262、1 317、1 425、1 593 cm-1處的組胺拉曼峰較強(qiáng)，這些特征峰的譜峰歸屬結(jié)果見表2。

表2 組胺分子的拉曼譜峰歸屬

通過使用TEM透射電鏡表征2種增強(qiáng)劑。對比圖3中a和b，銀納米粒子直徑約60 nm，金納米粒子直徑40 nm，2種納米粒子的粒徑大小都較均勻。金納米溶膠對組胺分子的拉曼信號強(qiáng)度更高，在953、992、1 262、1 106、1 262、1 317、1 425、1 593 cm-1處增強(qiáng)效果明顯，說明金納米基底能夠有效吸附陰性組胺分子，獲得更強(qiáng)信號效果，后續(xù)研究采用金納米增強(qiáng)基底。由于不同種類物質(zhì)的拉曼增強(qiáng)效應(yīng)差異較大，且不同增強(qiáng)基底對同一物質(zhì)的增強(qiáng)效應(yīng)不同[16]。在今后研究中，可進(jìn)一步探討適合于組胺的納米增強(qiáng)基底，以提高方法的靈敏度。

對組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的表面增強(qiáng)拉曼光譜進(jìn)行平滑、基線校正等預(yù)處理，以去除噪聲和基線漂移的影響，圖4為經(jīng)預(yù)處理后不同濃度組胺標(biāo)準(zhǔn)品SERS譜圖。從圖中可看出，隨著組胺濃度的降低，組胺分子953、992、1 030、1 106、1 186、1 262、1 317、1 425、1 593 cm-1的9處拉曼峰強(qiáng)度逐漸減弱，易識別；濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，無法檢測到有效譜峰，譜圖與三氯乙酸SERS信號一致。由此表明，利用金納米溶膠增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)檢測組胺溶液的最低濃度為1 mg·L-1。

A—組胺溶液銀納米溶膠；b—組胺溶液金納米溶膠；c—組胺;d—溶劑三氯乙酸。圖3 組胺溶液的SERS光譜及組胺、三氯乙酸的拉曼光譜

a～h依次為100、75、50、25、10、5、1、0.5 mg·L-1。圖4 不同濃度組胺溶液的SERS光譜

2.3 米魚中組胺的表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測結(jié)果

圖5是經(jīng)過光譜預(yù)處理后不同組胺含量的米魚肉提取液SERS譜圖，從圖中可以發(fā)現(xiàn)，受米魚肉提取液中含有大量蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)的影響，獲得大量拉曼譜峰信號，扣除圖5中q米魚空白SERS光譜信號，可明顯識別5處組胺分子拉曼特征峰(953、992、1 106、1 262、1 317 cm-1)，隨著濃度降低，譜峰強(qiáng)信號逐漸減弱。當(dāng)濃度在1 mg·L-1時(shí)，依然可以識別。由此斷定，這5個(gè)譜峰可作為米魚肉中組胺定性定量判別的依據(jù)，利用SERS方法對米魚中的組胺最低檢測濃度為1 mg·kg-1。國際標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定米魚中組胺最大殘留量為100 mg·kg-1，此方法能達(dá)到定性定量分析的要求。

a～q依次為100、95、90、80、75、70、60、50、40、30、25、20、15、10、5、1、0 mg·L-1。圖5 經(jīng)過光譜預(yù)處理后不同濃度含量組胺的米魚肉提取液SERS曲線

由于1 262 cm-1處特征峰的峰強(qiáng)較高，且附近沒有疊峰和雜峰影響，選用該特征峰的峰強(qiáng)度建立米魚中組胺含量的定量分析模型。圖6和圖7是以1 262 cm-1處組胺SERS特征峰強(qiáng)度與組胺濃度制作的一元線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，在濃度范圍為0～100 mg·L-1時(shí)，線性方程為y=27.889x+106.25，相關(guān)系數(shù)R2=0.980 6，線性相關(guān)性良好。

圖6 米魚中不同組胺含量在1 262 cm-1特征峰處的峰強(qiáng)度

圖7 以1 262 cm-1處組胺SERS特征峰強(qiáng)度與組胺濃度擬合得到的一元線性標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 模型準(zhǔn)確度驗(yàn)證

為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度，本實(shí)驗(yàn)對米魚肉中組胺真實(shí)含量進(jìn)行預(yù)測，選取4 ℃下放置1、4、7 d的米魚肉各5份，共計(jì)15個(gè)樣本，分別采集SERS信號，每個(gè)樣本采集6次。并用HPLC國標(biāo)方法測定15個(gè)樣本的真實(shí)值，比較真實(shí)值與預(yù)測值。表3為米魚肉中組胺的真實(shí)值與預(yù)測值對比結(jié)果，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%～4.7%，回收率為87.0%～117.3%。SERS技術(shù)的預(yù)測值與HPLC方法的測量值基本一致，表明利用表面增強(qiáng)拉曼光譜方法快速檢測米魚肉中組胺含量是可行的。說明所建立方法的精密度、準(zhǔn)確度較好，可靠性較高。

表3 米魚肉中組胺含量所測得真實(shí)值與預(yù)測值

3 小結(jié)與結(jié)論

采用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)和快速溶劑提取前處理方法檢測米魚中組胺含量，找到組胺的5處拉曼特征峰(953、992、1 106、1 262、1 317 cm-1)，將這些特征峰作為組胺的定性定量判別依據(jù)，對比不同納米增強(qiáng)劑效果，得出金納米粒子對組胺分子的增強(qiáng)效果更好，該方法對米魚中組胺最低檢測濃度為1 mg·L-1，在組胺1 262 cm-1特征峰峰強(qiáng)與組胺濃度建立線性方程，呈良好的線性相關(guān)性，方法的回收率為87.0%～117.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.6%～4.7%。

用3個(gè)放置不同天數(shù)的15個(gè)米魚肉樣本驗(yàn)證預(yù)測模型的精確性，結(jié)果表明，SERS技術(shù)的預(yù)測值與HPLC方法的測量值基本一致；預(yù)測值與實(shí)際測量值之間無顯著差異，說明采用該方法檢測米魚肉中的組胺是準(zhǔn)確可靠的。研究結(jié)果表明，SERS技術(shù)能夠?qū)γ佐~中組胺檢測提供快速、新穎、準(zhǔn)確的研究思路。