四君子湯含藥血清通過抑制RhoA/Rac1/Cdc42通路影響卵巢癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

李 凡張學(xué)林馮靜茹郝 潔周 蕾

(河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院,張家口 075100)

卵巢癌(ovarian cancer,OC)是全球第六大常見的女性婦科疾病,死亡率居?jì)D科惡性腫瘤之首[1-2]。由于OC患者發(fā)作時(shí)具有隱匿性,因此確診時(shí)70%處于晚期,為提高OC患者的生存率增加了挑戰(zhàn),因此開發(fā)新型有效藥物改善OC治療效果是當(dāng)務(wù)之急[3]。四君子湯由人參、白術(shù)、茯苓和炙甘草四味中藥材組成,對脾胃氣虛、調(diào)節(jié)腸道蠕動(dòng)和促進(jìn)消化等具有良好的治療效果[4]。此外,朱超等[5]研究發(fā)現(xiàn),四君子湯能夠抑制胃癌細(xì)胞株側(cè)群細(xì)胞的增殖和侵襲能力。Ras同源基因家族成員A(Ras homolog gene family member A,RhoA)、Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1)和細(xì)胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42,Cdc42)與細(xì)胞遷移和侵襲密切相關(guān),已被證實(shí)阻斷RhoA/Rac1/Cdc42信號途徑,能夠抑制風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞的遷移和侵襲行為,但四君子湯對卵巢癌遷移和侵襲的影響及其具體作用機(jī)制尚不明確[6]。本實(shí)驗(yàn)旨在探索四君子湯含藥血清對人卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響,并初步研究其與RhoA/Rac1/Cdc42信號通路的關(guān)聯(lián),為OC的臨床治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級SD大鼠50只,8周齡,體重(200±20)g,均為雌性,購自上海劍鈍生物科技有限公司[SCXK(滬)2019-0027],動(dòng)物飼養(yǎng)于河北北方學(xué)院(藥學(xué)系)[SYXK(冀)2019-004]。本研究經(jīng)河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(倫審IACUC2019-0307號),實(shí)驗(yàn)符合3R保護(hù)原則。

1.1.2 細(xì)胞

人卵巢癌細(xì)胞SKOV3購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫,批號TCHu185;人卵巢上皮細(xì)胞購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院,批號BNCC340096。

1.2 主要試劑與儀器

四君子湯顆粒(人參12 g,白術(shù)12 g,茯苓12 g,炙甘草6 g)由本院中藥房提供;舒尼替尼(原料藥,純度≥98%,批號20190109)購自武漢貝爾卡生物醫(yī)藥有限公司;McCOY’s 5A培養(yǎng)基(批號M9420)、RPMI 1640培養(yǎng)基(批號31800022)、噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑(批號M8180)、Matrigel膠(批號356234)、RIPA裂解液(批號R0010)、ECL發(fā)光液(批號PE0010)、TRIzol試劑盒(批號15596-018)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號T2210-200T)、無血清培養(yǎng)基(批號ML4011)均購自北京Solarbio公司;胎牛血清(批號C0225)、胰酶消化液(批號C0201)、上皮型鈣粘蛋白(E-cadherin)兔抗人多克隆抗體(批號AF6759)、波形蛋白(Vimentin)兔抗人單克隆抗體(批號AF1975)、神經(jīng)性鈣黏附蛋白(N-cadherin)兔抗人多克隆抗體(批號AF0243)、RhoA兔抗人單克隆抗體(批號AF2179)、Rac1兔抗人多克隆抗體(批號AF7854)、Cdc42兔抗人單克隆抗體(批號AF2794)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;GAPDH兔抗人多克隆抗體(批號PA1-16777)、山羊抗兔lgG(H+L)二級抗體(批號A32731)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

HeracellTM240i型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Multiskan Sky型全波長酶標(biāo)儀、GENESYSTM50型可見光/紫外分光光度計(jì)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;Gel DocTMXR+型凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司;2720型實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)儀購自美國ABI公司;LW300LFT-LED型熒光顯微鏡購自北京測維光電儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 含藥血清的制備

將50只SPF級雌性SD大鼠隨機(jī)分為5組:不含藥血清組、舒尼替尼陽性藥物組、2.07 g/kg(1/2等效劑量)四君子湯給藥組、4.14 g/kg(1倍等效劑量)四君子湯給藥組、8.28 g/kg(2倍等效劑量)四君子湯給藥組,每組10只,給藥劑量參照“人和動(dòng)物按體表面積折算的等效劑量比率表”計(jì)算。不含藥血清組給予生理鹽水灌胃,灌胃體積5 mL;舒尼替尼組給予10.14 g/kg舒尼替尼灌胃,每天1次,灌胃體積5 mL;各四君子湯組給予對應(yīng)劑量的四君子湯分別進(jìn)行灌胃處理,每天2次,每次2.5 mL;連續(xù)7 d,第8天末次給藥1 h,麻醉后,無菌環(huán)境下經(jīng)腹動(dòng)脈采血,4℃靜置2 h,離心(3000 r/min,15 min)3次,同組合并上清,56℃滅活30 min,過濾除菌,得不含藥血清、舒尼替尼含藥血清、四君子湯低、中、高劑量組含藥血清,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

將SKOV3細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清的McCOY’s 5A培養(yǎng)基,在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合80%左右,每隔1 d更換一次培養(yǎng)液。取對數(shù)期生長的SKOV3細(xì)胞,隨機(jī)分為空白對照組、舒尼替尼組、四君子湯I(xiàn)組、II組、III組,接種于96或6孔板,分別用體積分?jǐn)?shù)為20%的不含藥血清(空白對照組)、舒尼替尼含藥血清(舒尼替尼組)、四君子湯低劑量含藥血清(四君子湯I(xiàn)組)、四君子湯中劑量含藥血清(四君子湯I(xiàn)I組)和四君子湯高劑量含藥血清(四君子湯I(xiàn)II組),處理24 h,其中96孔板培養(yǎng)液量為每孔200 μL,6孔板培養(yǎng)液量為每孔2 mL,收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。另將用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的人卵巢上皮細(xì)胞接種于96孔板,按照上述方法分組并處理24 h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 MTT實(shí)驗(yàn)

向1.3.2各組SKOV3細(xì)胞孔板中加入5 μL 5 mg/mL MTT溶液,培養(yǎng)箱孵育4 h,吸去上清液,每孔添加100 μL二甲基亞砜,37℃搖床震蕩10 min,570 nm下測量各孔OD值,計(jì)算細(xì)胞存活率,以上每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔OD值-調(diào)零孔OD值)/(對照組OD值-調(diào)零孔OD值)。按照上述方法測定人卵巢上皮細(xì)胞的存活率。

1.3.4 劃痕實(shí)驗(yàn)

待1.3.2各組SKOV3細(xì)胞融合至85%左右,用200 μL槍頭垂直劃痕,PBS清洗3次,加入無血清培養(yǎng)基,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),顯微鏡下觀察并記錄0 h和24 h時(shí)劃痕變化情況,計(jì)算各組細(xì)胞愈合率。愈合率=(0 h劃痕距離-24 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%。

1.3.5 Transwell實(shí)驗(yàn)

收集1.3.2各組SKOV3細(xì)胞,調(diào)整濃度為每毫升2×105個(gè),取200 μL接種于預(yù)鋪設(shè)Matrigel基底膠的上室,下室添加每孔500 μL完全培養(yǎng)液,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱24 h,甲醛固定25 min,結(jié)晶紫染色25 min,隨機(jī)抽取6個(gè)視野,高倍(×200)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù).

1.3.6 蛋白免疫印跡分析實(shí)驗(yàn)

收集1.3.2各組SKOV3細(xì)胞,加入RIPA裂解液裂解,測量各組總蛋白含量。取等量蛋白上樣、12%聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂牛奶封閉4 h,洗膜,加入一抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、RhoA、Rac1、Cdc42和GAPDH(1∶1000),4℃孵化過夜,洗膜然后加入二抗(1∶5000),室溫封閉1 h,TBST洗膜,曝光顯影并記錄,計(jì)算目標(biāo)蛋白相對表達(dá)值。目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量=目標(biāo)條帶灰度值/GAPDH灰度值。

1.3.7 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

按照TRIzol說明書,提取1.3.2各組細(xì)胞總RNA,純化后,使用紫外分光光度儀計(jì)算RNA純度(OD260nm/OD280nm),逆轉(zhuǎn)錄(37℃60 min,95℃3 min)得cDNA。以各組cDNA為模板,進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min,95℃變性15 s,60℃退火40 s,95℃延伸15 s,共40次循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCT法分析RhoA、Rac1和Cdc42基因表達(dá)情況。RhoA、Rac1、Cdc42及GAPDH引物序列見表1,均由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 RhoA、Rac1、Cdc42和內(nèi)參GAPDH引物序列Table 1 Primer sequences of RhoA,Rac1,Cdc42 and internal reference GAPDH

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)描述,多組間比較使用單因素方差分析,進(jìn)一步兩組間比較行SNK-q檢驗(yàn),當(dāng)P<0.05時(shí),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四君子湯含藥血清對SKOV3細(xì)胞及人卵巢上皮細(xì)胞存活率變化影響

與空白對照組相比,舒尼替尼組SKOV3細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05),四君子湯I(xiàn)、II、III組SKOV3細(xì)胞存活率依次降低(P<0.05),呈劑量依賴性。四君子湯I(xiàn)II組與舒尼替尼組SKOV3細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組人卵巢上皮細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組SKOV3細(xì)胞及人卵巢上皮細(xì)胞存活率變化情況(ˉx±s,n=6)Table 2 Changes in survival rate of SKOV3 cells and human ovarian epithelial cells in each group

2.2 四君子湯含藥血清對SKOV3細(xì)胞遷移能力的影響

與空白對照組相比,舒尼替尼組SKOV3細(xì)胞劃痕愈合率顯著降低(P<0.05),四君子湯I(xiàn)、II、III組SKOV3細(xì)胞劃痕愈合率依次降低(P<0.05),呈劑量依賴性。四君子湯I(xiàn)II組與舒尼替尼組細(xì)胞劃痕愈合率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表3。

圖1 各組SKOV3細(xì)胞遷移圖片F(xiàn)igure 1 SKOV3 cell migration pictures of each group

表3 四君子湯含藥血清作用后各組SKOV3細(xì)胞劃痕愈合率(ˉx±s,n=6)Table 3 Healing rate of scratches of SKOV3 cells in each group after the effect of Sijunzi decoction-containing serum

2.3 四君子湯含藥血清對SKOV3細(xì)胞侵襲數(shù)量變化

與空白對照組相比,舒尼替尼組SKOV3細(xì)胞侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05),四君子湯I(xiàn)、II、III組SKOV3細(xì)胞侵襲數(shù)量依次降低(P<0.05),呈劑量依賴性。四君子湯I(xiàn)II組與舒尼替尼組細(xì)胞侵襲數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、表4。

表4 四君子湯含藥血清作用后各組SKOV3細(xì)胞侵襲數(shù)量(ˉx±s,n=6)Table 4 Number of SKOV3 cell invasion in each group after the effect of Sijunzi decoction

2.4 四君子湯含藥血清對SKOV3細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組相比,舒尼替尼組SKOV3細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05),N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),四君子湯I(xiàn)、II、III組SKOV3細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)依次升高(P<0.05),N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)依次降低(P<0.05)。四君子湯I(xiàn)II組與舒尼替尼組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3、表5。

表5 各組SKOV3細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)情況(ˉx±s,n=6)Table 5 E-cadherin,N-cadherin and Vimentin protein expression of SKOV3 cells in each group

2.5 四君子湯含藥血清對RhoA、Rac1和Cdc42表達(dá)的影響

與空白對照組相比,舒尼替尼組SKOV3細(xì)胞RhoA、Rac1、Cdc42 mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),四君子湯I(xiàn)、II、III組SKOV3細(xì)胞RhoA、Rac1、Cdc42 mRNA和蛋白表達(dá)依次降低(P<0.05)。四君子湯I(xiàn)II組與舒尼替尼組細(xì)胞RhoA、Rac1、Cdc42 mRNA和蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4、表6。

表6 各組SKOV3細(xì)胞RhoA、Rac1和Cdc42 mRNA表達(dá)情況(ˉx±s,n=6)Table 6 RhoA,Rac1 and Cdc42 protein expression of SKOV3 cells in each group

注:A:空白對照組;B:四君子湯I(xiàn)組;C:四君子湯I(xiàn)I組;D:四君子湯I(xiàn)II組;E:舒尼替尼組。圖2 四君子湯含藥血清對SKOV3細(xì)胞侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色)Note.A,Blank control group.B,Sijunzi Decoction I group.C,Sijunzi Decoction II group.D,Sijunzi Decoction III group.E,Sunitinib group.Figure 2 Effect of Sijunzi decoction-containing serum on the invasion ability of SKOV3 cells(Crystal violet staining)

注:A:空白對照組;B:四君子湯I(xiàn)組;C:四君子湯I(xiàn)I組;D:四君子湯I(xiàn)II組;E:舒尼替尼組。圖3 各組SKOV3細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)電泳圖Note.A,Blank control group.B,Sijunzi Decoction I group.C,Sijunzi Decoction II group.D,Sijunzi Decoction III group.E,Sunitinib group.Figure 3 E-cadherin,N-cadherin and Vimentin protein expression electrophoresis of SKOV3 cells in each group

注:A:空白對照組;B:四君子湯I(xiàn)組;C:四君子湯I(xiàn)I組;D:四君子湯I(xiàn)II組;E:舒尼替尼組。圖4 各組SKOV3細(xì)胞RhoA、Rac1和Cdc42蛋白表達(dá)電泳圖Note.A,Blank control group.B,Sijunzi Decoction I group.C,Sijunzi Decoction II group.D,Sijunzi Decoction III group.E,Sunitinib group.Figure 4 RhoA,Rac1 and Cdc42 protein expression electrophoresis of SKOV3 cells in each group

3 討論

OC具有骨盆腔廣泛擴(kuò)散的特征,癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是造成這種結(jié)果的重要原因[7]。目前,OC的治療主要以外科手術(shù)治療為基礎(chǔ),輔以化學(xué)療法,但大多數(shù)患者會在術(shù)后階段復(fù)發(fā),導(dǎo)致OC的5年生存率僅為44%[8]。血清藥理學(xué)是一種廣泛用于中藥和復(fù)方藥物藥效及藥理機(jī)制研究的實(shí)驗(yàn)方法,已證實(shí)臭牡丹含藥血清能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移[9]。

四君子湯四君子湯來源于宋代《太平惠民和劑局方》,由人參、白術(shù)、茯苓和甘草組成,主要含有多糖、皂苷和黃酮類等有效成分,具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤和抗衰老等作用[10]。近來研究顯示,四君子湯在抗腫瘤方面能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[11]。本研究結(jié)果顯示,與空白對照組相比,四君子湯含藥血清I、II、III組和舒尼替尼組人卵巢上皮細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示四君子湯含藥血清對人卵巢上皮細(xì)胞存活率無影響。黃曉燕等[12]和洪亞群等[13]研究發(fā)現(xiàn),四君子湯含藥血清或其有效成分對腸癌SW480細(xì)胞或胃癌細(xì)胞具有增殖抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn),與舒尼替尼組相比,四君子湯I(xiàn)II組SKOV3細(xì)胞存活率、愈合率、侵襲數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與空白對照組相比,四君子湯I(xiàn)、II、III組SKOV3細(xì)胞存活率、愈合率、侵襲數(shù)量依次降低,提示四君子湯含藥血清能有抑制人卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲行為,高濃度的四君子湯含藥血清和舒尼替尼作用相當(dāng)。

上皮-間質(zhì)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是惡性腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟,與腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移密切相關(guān)[14-15]。在該過程中,對上皮細(xì)胞黏附連接至關(guān)重要的E-cadherin蛋白表達(dá)下降,而間充質(zhì)標(biāo)記物N-cadherin和Vimentin表達(dá)升高[16]。本研究發(fā)現(xiàn),與空白對照組相比,四君子湯I(xiàn)、II、III組SKOV3細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)依次升高,N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)依次降低,提示四君子湯含藥血清可以抑制人卵巢癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程。Liu等[17]研究顯示,通過抑制EMT過程能夠調(diào)節(jié)卵巢癌的轉(zhuǎn)移能力,因此推測四君子湯含藥血清可能通過抑制EMT進(jìn)程,干預(yù)卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲,可能為四君子湯應(yīng)用于OC的輔助治療提供了參考。

Rho家族小分子鳥苷三磷酸酶(Small GTPases of Rho family,Rho GTPases)包含小型GTpases的Ras超家族的子家族,能夠誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)和基因轉(zhuǎn)錄的協(xié)調(diào)變化,驅(qū)動(dòng)細(xì)胞黏附、遷移、形態(tài)變化等[18-19]。RhoA、Rac1和Cdc42是Ras超家族的三個(gè)重要成員,在調(diào)節(jié)細(xì)胞EMT進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[20]。在乳腺癌腫瘤細(xì)胞中,抑制RhoA、Rac1和Cdc42表達(dá),能夠促進(jìn)細(xì)胞間質(zhì)向上皮樣轉(zhuǎn)變,并促進(jìn)E-cadherin表達(dá)[21]。本研究發(fā)現(xiàn),與空白對照組相比,四君子湯I(xiàn)、II、III組SKOV3細(xì)胞RhoA、Rac1、Cdc42 mRNA和蛋白表達(dá)呈劑量依賴性降低,四君子湯I(xiàn)II組作用效果與舒尼替尼作用效果相當(dāng),提示四君子湯對人卵巢癌細(xì)胞EMT過程的抑制作用,可能與抑制RhoA/Rac1/Cdc42信號通路相關(guān)。舒尼替尼是一種多靶點(diǎn)抗腫瘤藥物,可以通過抑制多個(gè)受體的酪氨酸激酶活性參與實(shí)體瘤的發(fā)生發(fā)展,本研究發(fā)現(xiàn)舒尼替尼能夠抑制RhoA/Rac1/Cdc42信號通路抑制卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)行為,推測舒尼替尼的抗腫瘤機(jī)制也可能與RhoA/Rac1/Cdc42信號通路或其相關(guān)蛋白有關(guān),但四君子湯含藥血清和舒尼替尼的具體作用靶點(diǎn)是否一致,仍待考究。另有研究顯示[22],RhoA、Rac1和Cdc42表達(dá)下調(diào)可以抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的成纖維滑膜細(xì)胞的遷移和侵襲,因此推測,四君子湯含藥血清可能通過抑制RhoA/Rac1/Cdc42信號通路,抑制細(xì)胞EMT發(fā)生,從而抑制人卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。此外,四君子湯含藥血清中含有人參皂苷Rb1、Re、Rg1、甘草酸、甘草次酸和甘草素葡萄糖醛酸六種化學(xué)成分[23-24],其中人參皂苷Rb1[25]和甘草酸[26]已分別被證實(shí)能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的EMT和遷移及侵襲,而人參皂苷Re對腫瘤細(xì)胞具有抑制作用[27],人參皂苷Rg1主要用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療[28],因此四君子湯含藥血清中調(diào)控RhoA/Rac1/Cdc42信號通路的具體有效成分尚不明確,需進(jìn)行更深入的研究和探索。

綜上所述,四君子湯含藥血清對人卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲行為的抑制作用,可能與抑制RhoA/Rac1/Cdc42信號通路,抑制EMT發(fā)生相關(guān),表明四君子湯在OC治療方向具有潛在治療或輔助治療價(jià)值,可能為臨床治療OC提供了新的思路和方法。但鑒于OC發(fā)病機(jī)制及四君子湯中藥成分的復(fù)雜性,本課題組將針對四君子湯中不同成分組合含藥血清對卵巢癌細(xì)胞的作用效果,以及四君子湯含藥血清有效成分對RhoA/Rac1/Cdc42信號通路及卵巢癌細(xì)胞的影響進(jìn)行更深入的研究和探索,以期能夠完善四君子湯含藥血清對卵巢癌藥理學(xué)分析。