百解藤抗炎作用及最大耐受量的實(shí)驗(yàn)研究

周賢強(qiáng)，蔣偉哲，孔曉龍，付書(shū)婕，廖萬(wàn)忠，唐 婕，謝佳佳

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021；2.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000）

百解藤為防己科植物輪環(huán)藤屬粉葉輪環(huán)藤Cy?clea hypoglauca（Schauer）Diels，又名銀不換、金鑰匙等，瑤族稱其為“金線風(fēng)”（僅俊崩），屬于常用瑤藥“七十二風(fēng)”之一［1］。目前地方性標(biāo)準(zhǔn)中僅收載了百解藤根部的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，然而，百解藤的莖葉也是瑤族常用的藥用部位，具有清熱解毒、祛風(fēng)止痛的功效，常用于治療風(fēng)熱感冒、咳嗽、咽喉腫痛、風(fēng)火牙痛、痢疾、風(fēng)濕疼痛、瘡瘍腫毒、毒蛇咬傷和尿路感染等［2］。經(jīng)查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，有關(guān)百解藤的藥理學(xué)研究報(bào)道較少［3-6］，未見(jiàn)其抗炎作用和最大耐受量方面的研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)百解藤莖葉的抗炎作用及最大耐受量進(jìn)行初步的藥理學(xué)研究，為百解藤的后續(xù)研究提供基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)KM小鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量18~22 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK桂2014-0002。飼養(yǎng)溫度為25℃，相對(duì)濕度為40%~70%，予動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2 儀器 打孔器（8 mm）；計(jì)時(shí)器、分析天平（型號(hào)：BSM-220.4；上海卓精電子科技有限公司）；移物槍（100μl）。

1.3 試劑及藥物 二甲苯（廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心，批號(hào)：20170818）；醋酸地塞米松片（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)：190804；規(guī)格：每片0.75 mg）；百解藤莖葉采自玉林市博白縣，經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院余麗瑩教授鑒定為防己科輪環(huán)藤屬植物百解藤Cyclea hypoglauca（Schauer）Diels的莖和葉。取百解藤莖和葉粉末100 g，按料液比1∶8加入純水，加熱沸騰后持續(xù)提取1 h，濾過(guò)，濾渣再加入4倍量水繼續(xù)提取30 min，濾過(guò)，合并濾液，常壓濃縮至50 ml，得濃度為2.0 g/ml生藥水提物，置于冰箱內(nèi)4~6℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 抗炎實(shí)驗(yàn)［7］將50只小鼠隨機(jī)分為5組：模型組、醋酸地塞米松對(duì)照組及百解藤水提物高、中、低劑量組，每組10只。百解藤水提物高、中、低劑量組分別給予百解藤水提物高劑量（4.5 g/kg）、中劑量（3.0 g/kg）、低劑量（1.5 g/kg），醋酸地塞米松對(duì)照組給予醋酸地塞米松水溶液0.5 mg/kg，模型組灌胃給予生理鹽水。連續(xù)灌胃給藥7 d，灌胃容積均為20 ml/kg。末次給藥1 h后，每只小鼠右耳涂以二甲苯100μl，以左耳對(duì)照，1 h后頸椎脫臼處死，沿耳廓基線剪下兩耳，用8 mm直徑打孔器分別在同一部位打下圓耳片，精密稱量。以兩耳片重量差值作為腫脹度指標(biāo)，并計(jì)算出腫脹抑制率。腫脹度（mg）=右耳片重（mg）-左耳片重（mg）；腫脹抑制率（%）=（模型組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度）/模型組平均腫脹度×100%。

2.2 最大耐受量（MTD）實(shí)驗(yàn)［8］取20只小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為2組：空白對(duì)照組和百解藤莖葉水提取物組，每組按性別分籠飼養(yǎng)，禁食不禁水12 h后，每鼠按最大灌胃量20 ml/kg給藥，百解藤莖葉水提取物組給予水提物最大濃度藥液（2.0 g/ml）灌胃，空白對(duì)照組以生理鹽水灌胃，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃和觀察7 d，記錄此期間小鼠的毒性反應(yīng)、死亡情況、體質(zhì)量變化和飼料消耗量，7 d后脫頸椎處死并解剖小鼠，肉眼觀察臟器是否病變。體質(zhì)量變化=給藥后第7天體質(zhì)量-給藥前體質(zhì)量；最大耐受量=小鼠平均給藥量/小鼠平均體質(zhì)量×成人體質(zhì)量（60 kg）/成人日用劑量（10 g）。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組內(nèi)比較采用ANOVA單因素方差分析，組間比較采用LSD方法分析。以P<0.05或P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 百解藤莖葉水提物對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響 見(jiàn)表1。

表1 百解藤莖葉水提物對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響 （±s，n=10）

表1 百解藤莖葉水提物對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響 （±s，n=10）

注：與模型組比較，①P<0.05，②P<0.01

組 別模型組醋酸地塞米松對(duì)照組百解藤水提取物高劑量組百解藤水提取物中劑量組百解藤水提取物低劑量組劑量（g/kg）—0.000 5 4.5 3.0 1.5腫脹度（mg）11.99±2.13 2.29±1.58②5.59±1.92②7.12±1.73②8.22±1.75①腫脹抑制率（%）—80.90 53.38 40.55 31.40

百解藤水提取物的高、中、低劑量組對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹均有明顯的抑制作用（P<0.05或P<0.01），且抑制作用與劑量呈正相關(guān)。

3.2 最大耐受量（MTD）的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 小鼠的一般情況 空白對(duì)照組在灌胃后1 h內(nèi)，大部分小鼠會(huì)出現(xiàn)活動(dòng)減少、臥伏，對(duì)外應(yīng)激反應(yīng)減少的現(xiàn)象；1.5 h后，小鼠的活動(dòng)和反應(yīng)才恢復(fù)正常。7 d內(nèi)小鼠飲食、大小便正常，體重小幅度增長(zhǎng)，未見(jiàn)其他異常反應(yīng)。百解藤水提取物組小鼠在灌胃后1 h內(nèi)，大部分小鼠會(huì)出現(xiàn)活動(dòng)減少、臥伏現(xiàn)象，對(duì)外應(yīng)激反應(yīng)減少，口、鼻、眼、外陰等無(wú)分泌物，無(wú)震顫或抽搐等現(xiàn)象，少數(shù)鼠的呼吸頻率加快，可見(jiàn)明顯的呼吸動(dòng)作；1~2 h內(nèi)，小鼠行為活動(dòng)逐漸增多，部分小鼠開(kāi)始嗅飼料和飲水，給藥組小鼠的糞便、尿液色澤偏黃，糞便較濕潤(rùn)，未見(jiàn)腹瀉；給藥2.5 h后，小鼠活動(dòng)基本恢復(fù)正常。在7 d觀察期內(nèi)，小鼠反應(yīng)基本正常，體重變化不大，僅日均消耗的飼料量有逐漸減少的趨勢(shì)。見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 百解藤莖葉水提物對(duì)小鼠體重的影響

圖2 百解藤莖葉水提物對(duì)小鼠進(jìn)食量的影響

3.2.2 小鼠臟器情況 給藥后第7 d將小鼠進(jìn)行解剖，與空白對(duì)照組比較，肉眼可見(jiàn)百解藤莖葉水提物組小鼠心、肝、脾、肺和腎的顏色、大小、質(zhì)地、表面皆正常，無(wú)壞死組織、結(jié)節(jié)、炎癥和腫瘤等病變；胃、大腸和小腸的顏色、形狀、大小正常，無(wú)氣脹、充血、壞死和腫物。

3.2.3 小鼠死亡情況 給藥7 d內(nèi)，空白對(duì)照組及百解藤莖葉水提物給藥組的20只小鼠均無(wú)死亡。

3.2.4 最大耐受量（MTD）測(cè)定結(jié)果 由實(shí)驗(yàn)可知，百解藤莖葉水提物以最大濃度2.0 g/ml給藥，小鼠未出現(xiàn)死亡和明顯的中毒癥狀，小鼠對(duì)百解藤莖葉水提物的最大耐受量（MTD）為40 g/kg，相當(dāng)于成人日用劑量的235倍。

4 討論

小鼠耳廊腫脹致炎實(shí)驗(yàn)是驗(yàn)證藥物抗炎作用的經(jīng)典方法，在抗炎實(shí)驗(yàn)中，不同劑量的百解藤水提取物和醋酸地塞米松對(duì)二甲苯所引起小鼠耳廓腫脹均有一定的抑制作用（P<0.05或P<0.01），表明百解藤莖葉水提取物具有較好的抗炎作用。

百解藤含多種生物堿（如左旋筒箭毒次堿、輪環(huán)藤寧堿、異谷樹(shù)堿、異粉防己堿等）、黃酮類、9-β-D-呋喃核糖嘌呤、胡蘿卜苷、β-谷甾醇、棕櫚酸甘油酯、γ-谷甾醇、油酸、亞油酸、菜油甾醇、14-甲基十五烷酸和豆甾醇等物質(zhì)［9-11］，究竟是以上哪種或多種化學(xué)物質(zhì)在發(fā)揮抗炎作用，還有待深入探究。

本實(shí)驗(yàn)曾按急性毒性實(shí)驗(yàn)的要求進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)小鼠可承受的最大灌胃體積20 ml/kg一次性灌胃給予百解藤莖葉水提取物藥液（2.0 g/ml），給藥后常規(guī)飼養(yǎng)，連續(xù)觀察7 d，但此期間小鼠的行為反應(yīng)、飲食和體重變化等均無(wú)異常，生命健康狀況良好，均未出現(xiàn)死亡，因此無(wú)法測(cè)得百解藤莖葉水提取物對(duì)小鼠的半數(shù)致死量（LD50）。在無(wú)法測(cè)得半數(shù)致死量（LD50）的情況下，最大給藥量的耐受倍數(shù)反映了該藥的安全性，依據(jù)中藥毒性和安全試驗(yàn)方法，小鼠能耐受人用劑量100倍以上即認(rèn)為中藥組方安全［12］，百解藤莖葉最大給藥量的耐受倍數(shù)相當(dāng)于成人日用劑量的235倍，表明其毒性相當(dāng)小，安全性高。