生長抑制因子4 對宮頸癌細胞CaSki 增殖和凋亡的影響及作用機制研究

王明輝，李永杰，李道宏，牟婧祎

1開封市婦產(chǎn)醫(yī)院婦科，河南 開封 475000

2河南省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，鄭州 450003

宮頸癌是常見婦科惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率均較高，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。研究顯示，基因表達異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，這些異常表達的基因可參與調(diào)控腫瘤細胞的惡性增殖過程，這也是腫瘤靶基因治療研究領(lǐng)域的重點。生長抑制因子4（inhibitor of growth family member 4，ING4）是腫瘤生長抑制因子家族成員，有核定位信號，可參與調(diào)控細胞生長。

ING4

在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用，具有抵抗細胞生長和誘導凋亡的作用，其在卵巢癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤中表達下調(diào)。ING4 的作用機制較為復雜，能通過調(diào)控多種信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)揮生物學功能。既往研究顯示，ING4 通過影響WNT 信號通路參與調(diào)控肺腺癌細胞的生長。目前，臨床對ING4 在宮頸癌中的表達及其對宮頸癌細胞生物學行為的調(diào)控機制尚不清楚。本研究首先初步探討ING4 在宮頸癌組織和細胞中的表達差異，通過慢病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)

ING4

的表達，探討ING4 對宮頸癌細胞增殖、凋亡的影響和調(diào)控機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年7 月至2018 年12 月開封市婦產(chǎn)醫(yī)院收治的宮頸癌患者。納入標準：①經(jīng)病理學檢查確診為原發(fā)性宮頸癌；②術(shù)前均未行放化療和免疫治療等相關(guān)治療；③臨床資料完整。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②合并精神疾病或精神疾病家族史；③合并智力或認知功能障礙。依據(jù)納入和排除標準，本研究共納入50 例宮頸癌患者，年齡28～78 歲，中位年齡59 歲；臨床分期：Ⅰ期24例，Ⅱ期15 例，Ⅲ期11 例。取50 例宮頸癌患者的宮頸癌組織及相應(yīng)癌旁組織。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞、主要試劑和儀器 宮頸癌細胞系Hela、SiHa 均購自中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫，宮頸癌細胞系CaSki 購自無錫欣潤生物科技有限公司，正常宮頸細胞系Ect1/E6E7 購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。caspase 3 抗體、β-catenin 抗體均購自碧云天生物技術(shù)有限公司，互補DNA（complementary DNA，cDNA）合成試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，ING4 抗體、c-myc 抗體均購自美國Abcam 公司，膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡測定試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，陰性對照慢病毒和

ING4

過表達慢病毒由湖南豐暉生物科技有限公司構(gòu)建。1.2.2 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription- polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測宮頸癌組織和細胞中

ING4

的相對表達量 分別取宮頸癌組織、癌旁組織、宮頸癌細胞 系Hela、SiHa、CaSki 和 正 常 宮 頸 細 胞 系Ect1/E6E7，采用Trizol 法提取組織和細胞中的RNA，紫外分光光度計測定RNA 的光密度（optical density，OD），OD/OD比值為1.8～2.0。采用cDNA 合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取適量的cDNA，以SYBR Green qRT-PCR 進行定量PCR。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃反應(yīng)15 s，55 ℃孵育30 s，72 ℃孵育30 s。以

β

-

actin

作為內(nèi)參，采用2法計算

ING4

mRNA的相對表達量。

β

-

actin

上游引物：5'-CGAAACTACCTTCAACTCCATCA-3'，下 游 引 物：5'-CGGACTCGTCATACTCCTGCT-3'；

ING4

上游引物：5'-GGACCTGAAGGCTGAAATTGAC-3'，下游引物：5'-GTCACTGAGGGCATCCCATAC-3'。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測宮頸癌細胞中ING4 蛋白的相對表達量 利用放射免疫沉淀（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）蛋白提取試劑提取宮頸癌細胞系Hela、SiHa、CaSki 和正常宮頸細胞系Ect1/E6E7 中的總蛋白。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠采用10%的分離膠及4%的濃縮膠，常規(guī)方法配制。將提取的蛋白樣品進行變性（與loading buffer 混合煮沸5 min）處理，上樣孔內(nèi)蛋白樣品量為40 μg，設(shè)置濃縮膠中電壓為80 V，分離膠中電壓為120 V。肉眼觀察染料跑出凝膠底部時停止電泳。按照1 mA/cm進行電轉(zhuǎn)膜。取出聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，經(jīng)過5%牛血清白蛋白室溫封閉后，將PVDF 膜轉(zhuǎn)移到一抗稀釋液（NG4 一抗以1∶600 稀釋）中，4 ℃孵育過夜，然后將PVDF膜放置于二抗稀釋液[辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記，以1∶3000 稀釋]中，室溫中孵育1 h。電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）法顯色，利用Labworks 4.6掃描灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算ING4蛋白的相對表達量。

1.2.4 慢病毒轉(zhuǎn)染和分組方法 取

ING4

mRNA 和ING4 蛋白相對表達量最低的宮頸癌細胞CaSki 進行轉(zhuǎn)染，將宮頸癌細胞CaSki 接種至24 孔板，以MOI=20 的慢病毒轉(zhuǎn)染細胞，24 h 后換液，培養(yǎng)72 h后觀察熒光表達情況，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染效率﹥90%，分別將轉(zhuǎn)染

ING4

過表達的慢病毒和穩(wěn)定陰性對照慢病毒的細胞作為Lv-ING4 組和Lv-NC 組，將沒有轉(zhuǎn)染慢病毒的細胞作為對照組。

1.2.5 CCK8 法檢測細胞增殖能力 取對照組、Lv-NC 組、Lv-ING4 組宮頸癌細胞CaSki，接種至96 孔板，接種28 h 后取出細胞培養(yǎng)板，添加100 μl 的CCK8 溶液，然后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。采用酶標儀測定450 nm 波長處的OD 值。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡能力 取對照組、Lv-NC 組、Lv-ING4 組宮頸癌細胞CaSki，0.25%的胰蛋白酶消化，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）將細胞沉淀重懸洗滌2 次，最后將細胞懸浮于500 μl 的結(jié)合緩沖液中，然后依次添加Annexin V-FITC 和PI 染液，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.7 Western blot 法 檢 測 細 胞caspase 3、βcatenin、c-myc 蛋白的相對表達量 取對照組、Lv-NC 組、Lv-ING4 組宮頸癌細胞CaSki，按照1.2.3 中Western blot 法檢測各組細胞caspase 3、β-catenin、cmyc 蛋白的相對表達量，其中caspase 3、β-catenin、c-myc一抗的稀釋倍數(shù)分別為1∶400、1∶600、1∶600。1.2.8 WNT/β-catenin 信號通路激活劑LiCl 處理對

ING4

過表達的宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響 收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

ING4

過表達的Lv-ING4 組宮頸癌細胞，分別以0、20 mmol/L 的WNT/β-catenin 信號通路激活劑LiCl 處理培養(yǎng)，分別作為Lv-ING4 組和Lv-ING4+LiCl 組，培養(yǎng)48 h 后，采用上述CCK8 法檢測細胞增殖能力，流式細胞儀檢測細胞凋亡能力，Western blot 法測檢測各組細胞caspase 3、βcatenin、c-myc 蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 不同組織和細胞中ING4 mRNA 和ING4 蛋白相對表達量的比較

宮頸癌組織中

ING4

mRNA 的相對表達量為（0.32±0.02），明顯低于癌旁組織的（1.42±0.06），差異有統(tǒng)計學意義（

t

=17.93，

P

﹤0.01）。宮頸癌細胞Hela、CaSki、SiHa 中

ING4

mRNA 和ING4 蛋白的相對表達量均明顯低于正常宮頸細胞Ect1/E6E7，宮頸癌細胞CaSki 中

ING4

mRNA 和ING4 蛋白的相對表達量均明顯低于宮頸癌細胞Hela、SiHa，差異均有統(tǒng)計學意義（

P

﹤0.01）（表1）。

表1 宮頸癌細胞Hela、CaSki、SiHa 和正常宮頸細胞Ect1/E6E7 中ING4 mRNA 和ING4 蛋白相對表達量的比較（±s）

2.2 各組宮頸癌細胞CaSki 中ING4 mRNA 和ING4 蛋白相對表達量的比較

取

ING4

mRNA 和ING4 蛋白相對表達量最低的宮頸癌細胞CaSki 進行轉(zhuǎn)染，慢病毒轉(zhuǎn)染后，Lv-ING4 組宮頸癌細胞CaSki 中

ING4

mRNA 和ING4蛋白相對表達量均明顯高于對照組和Lv-NC 組，差異均有統(tǒng)計學意義（

P

﹤0.01）；對照組與Lv-NC組宮頸癌細胞CaSki 中

ING4

mRNA 和ING4 蛋白的相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（

P

﹥0.05）。（表2）

表2 各組宮頸癌細胞CaSki 中ING4 mRNA 和ING4 蛋白相對表達量的比較（±s）

2.3 ING4過表達對宮頸癌細胞CaSki增殖和凋亡的影響

慢病毒轉(zhuǎn)染后，Lv-ING4 組宮頸癌細胞CaSki的OD 值明顯低于對照組和Lv-NC 組，細胞凋亡率明顯高于對照組和Lv-NC 組，差異均有統(tǒng)計學意義（

P

﹤0.01）；對照組與Lv-NC 組宮頸癌細胞CaSki的OD 值和凋亡率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（

P

﹥0.05）。（表3、圖1）

表3 ING4過表達對宮頸癌細胞CaSki的OD值和凋亡率的影響（±s）

圖1 流式細胞儀檢測ING4過表達對宮頸癌細胞CaSki凋亡的影響

2.4 ING4過表達對宮頸癌細胞CaSki中caspase 3、β-catenin、c-myc 蛋白相對表達量的影響

慢病毒轉(zhuǎn)染后，Lv-ING4 組宮頸癌細胞CaSki中caspase 3 蛋白的相對表達量明顯高于對照組和Lv-NC 組，β-catenin、c-myc 蛋白的相對表達量均明顯低于對照組和Lv-NC 組，差異均有統(tǒng)計學意義（

P

﹤0.01）；對照組與Lv-NC 組宮頸癌細胞CaSki中caspase 3、β-catenin、c-myc 蛋白的相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（

P

﹥0.05）。（表4）

表4 ING4 過表達對宮頸癌細胞CaSki 中caspase 3、βcatenin、c-myc 蛋白相對表達量的影響（±s）

2.5 WNT/β-catenin 信號通路激活劑LiCl 處理對ING4過表達的宮頸癌細胞CaSki增殖和凋亡的影響

Lv-ING4+LiCl 組宮頸癌細胞OD 值明顯高于Lv-ING4 組，凋亡率明顯低于Lv-ING4 組，差異均有統(tǒng)計學意義（

P

﹤0.01）。（表5、圖2）

圖2 流式細胞儀檢測WNT/β-catenin信號通路激活劑LiCl處理對ING4過表達宮頸癌細胞CaSki凋亡的影響

表5 WNT/β-catenin信號通路激活劑LiCl處理對ING4過表達宮頸癌細胞CaSki的OD值和凋亡率的影響（±s）

2.6 WNT/β-catenin 信號通路激活劑LiCl 處理對ING4 過表達宮頸癌細胞CaSki 中β-catenin、cmyc、caspase 3 蛋白相對表達量的影響

Lv-ING4+LiCl 組宮頸癌細胞caspase 3 蛋白相對表達量低于明顯Lv-ING4 組，β-catenin、c-myc 蛋白相對表達量均明顯高于Lv-ING4 組，差異均有統(tǒng)計學意義（

P

﹤0.01）。（表6）

表6 WNT/β-catenin 信號通路激活劑LiCl 處理對ING4 過表達宮頸癌細胞CaSki 中β-catenin、c-myc、caspase 3蛋白相對表達量的影響（±s）

3 討論

ING4 首先在人體垂體組織中發(fā)現(xiàn)，其編碼蛋白質(zhì)的C 末端具有高度保守性和核定位作用，ING4 具有廣泛的生物學作用，參與腫瘤細胞的生長過程。研究表明，ING4 可抑制多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，腫瘤組織中ING4 表達下調(diào)與腫瘤細胞的惡性增殖有關(guān)。ING4 在子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、前列腺癌等腫瘤組織中表達下調(diào)，具有抑制腫瘤細胞體外惡性生長的作用。本研究結(jié)果表明，

ING4

在宮頸癌組織和細胞中表達下調(diào)，上調(diào)

ING4

的表達后，宮頸癌細胞的增殖能力降低，這可能提示，ING4在宮頸癌進展中發(fā)揮類似抑癌基因的作用。腫瘤細胞凋亡率降低是腫瘤細胞惡性生長的基礎(chǔ)，而細胞凋亡是一個復雜的過程，需要細胞內(nèi)一系列基因通過復雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共同誘導。目前，臨床對細胞凋亡的研究發(fā)現(xiàn)，caspase 與細胞凋亡關(guān)系密切，caspase 由多個蛋白成員組成，這些蛋白成員被激活后可以形成一個凋亡級聯(lián)反應(yīng)，最終誘導細胞凋亡。caspase 3 在凋亡級聯(lián)反應(yīng)中位于最下游，也是細胞凋亡執(zhí)行的關(guān)鍵蛋白，正常情況下，caspase 沒有活性，只有被激活后形成caspase 3 才可以誘導細胞凋亡的發(fā)生，caspase 3 活化也被認為是凋亡不可逆的標志之一。本研究結(jié)果顯示，慢病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)

ING4

的表達后，宮頸癌細胞中caspase 3 蛋白的相對表達量升高，細胞凋亡率也升高，提示上調(diào)

ING4

的表達可以誘導宮頸癌細胞發(fā)生凋亡，

ING4

在宮頸癌進展中可能扮演抑癌基因的作用。本實驗進一步探討了ING4 的作用機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過慢病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)

ING4

的表達還可以降低宮頸癌細胞CaSki 中β-catenin、c-myc 蛋白的相對 表 達 量。β-catenin 是 經(jīng) 典WNT/β-catenin 信 號通路的調(diào)控因子，其表達水平的高低與WNT/βcatenin 信號通路的激活水平直接相關(guān)。

c

-

myc

是位于WNT/β-catenin 信號通路的下游基因，WNT/β-catenin 信號通路激活可以促進c-myc 蛋白的表達。本實驗結(jié)果顯示，上調(diào)

ING4

的表達能夠抑制宮頸癌細胞CaSki 中WNT/β-catenin 信號通路激活。既往研究發(fā)現(xiàn)，WNT/β-catenin 信號通路在惡性腫瘤中過度激活，其活化水平升高可以促進惡性腫瘤的進展，阻斷WNT/β-catenin 信號通路可以抑制腫瘤細胞的生長并誘導細胞凋亡。本實驗發(fā)現(xiàn)，WNT/β-catenin 信號通路激活劑LiCl可以逆轉(zhuǎn)上調(diào)

ING4

對宮頸癌細胞增殖抑制和凋亡促進的作用，表明上調(diào)

ING4

的表達可能通過調(diào)控WNT/β-catenin 信號通路影響宮頸癌細胞的增殖和凋亡。既往研究報道顯示，ING4 作用機制與細胞內(nèi)多種信號通路有關(guān)，其可以通過影響WNT 信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)控A549 細胞的生長過程。本實驗結(jié)果表明，ING4 參與宮頸癌進展可能與WNT/βcatenin 信號通路有關(guān)。

綜上所述，ING4 在宮頸癌中表達下調(diào)，ING4能夠抑制宮頸癌細胞的增殖并誘導其凋亡，其作用機制可能與下調(diào)WNT/β-catenin 信號激活程度有關(guān)，這為今后進一步研究ING4 在宮頸癌進展中的作用和具體調(diào)控機制提供了參考資料。