上皮性卵巢癌患者中叉頭盒D1 的表達水平及其臨床意義

陳琳，左亞敏，趙松蘭，沈亞杰

鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002

上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）是世界范圍內(nèi)導致女性腫瘤相關性死亡的最常見原因之一。由于臨床癥狀隱匿，不少卵巢癌患者發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)是晚期，且疾病進展迅速，EOC 患者的臨床預后并不理想，其5 年生存率低于50%。因而，探索EOC 發(fā)生、發(fā)展過程中涉及的分子機制，并且尋找早期或者特異性分子診斷標志，對EOC 的早期診斷和治療至關重要。叉頭盒（forkhead box，F(xiàn)OX）轉(zhuǎn)錄因子位于染色體5q13.2，全長2.27 kb，在細胞生長、分化、遷移等生命過程中發(fā)揮重要作用。作為FOX 家族的重要成員，叉頭盒D1（FOXD1）可促進腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移，影響腫瘤細胞的化療抗性，并且與腫瘤患者預后不良有關。然而，有關EOC 中

FOXD1

表達情況的臨床研究目前尚未見報道。因此，本研究檢測EOC 患者腫瘤組織中

FOXD1

表達情況，分析其與臨床特征和EOC 患者預后之間的關系，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2007 年10 月至2016 年12 月于鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院就診的未經(jīng)化療的65 例EOC 患者。納入標準：首次發(fā)現(xiàn)并經(jīng)病理學活檢確診為EOC。排除標準：既往接受過放療或化療；合并其他惡性腫瘤。選擇同期28 例行卵巢切除術的卵巢良性疾病患者作為對照。納入標準：首次發(fā)現(xiàn)并經(jīng)病理學活檢確診為卵巢良性疾病。排除標準：合并包含卵巢在內(nèi)的其他組織惡性腫瘤。EOC 患者年齡36～88 歲，中位年齡59 歲；根據(jù)2000 年國際婦產(chǎn)科聯(lián) 盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期標準，Ⅰ～Ⅱ期19 例，Ⅲ～Ⅳ期46 例；分化程度：高分化15 例，中分化24 例，低分化26 例。卵巢良性疾病患者年齡32～85 歲，中位年齡60 歲。EOC 患者和卵巢良性疾病患者的年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（

P

﹥0.05），具有可比性。收集EOC 患者的EOC 組織65 例和卵巢良性疾病患者的卵巢組織28 例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有患者均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 組織RNA 提取和cDNA 合成

首先通過研磨組織獲取細胞，總RNA 按照Trizol 法提取，通過比色后將所有標本濃度調(diào)節(jié)一致。逆轉(zhuǎn)錄參照Thermo 公司的RevertAid RT Reverse Transcription Kit 說明書進行，反應體系離心后進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR），程序包括三步：①25 ℃5 min；②42 ℃60 min；③70 ℃5 min。收集PCR 產(chǎn)物置于4 ℃保存待用。

1.3 實時定量聚合酶鏈反應（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測FOXD1 表達水平

應 用qRT-PCR 法（SYBRPremix Ex Taq試劑）檢測

FOXD1

的轉(zhuǎn)錄本水平，具體的PCR 反應體系及反應條件參照說明書，每次PCR 實驗均帶有陽性和陰性質(zhì)控，

FOXD1

表達水平通過2法進行計算分析。

FOXD1

引物序列：上游5'-GCGAGGACGAAGAAGACGAGGAA-3'，下游5'-GAGGTTGTGGCGGATGCTGTT-3'，產(chǎn)物長度為458 bp；內(nèi)參基因

GAPDH

引物序列：上游5'-GAAGGTCGGAGTCAACGG-3'，下游5'-TGGAAGATGGTGATGGGAT-3'，產(chǎn)物長度為222 bp。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，不滿足正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)[

M

（

P

，

P

）]表示，組間比較采用Mann Whitney

U

檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用

χ

檢驗；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線進行診斷價值分析，計算ROC曲線下面積（area under the curve，AUC）；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank 檢驗；以

P

﹤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 卵巢良性疾病患者和EOC 患者中FOXD1 表達水平的比較

FOXD1

在EOC 組織中的表達水平為0.574（0.352，0.958），明顯高于卵巢良性疾病患者的0.123（0.051，0.355），差 異 有 統(tǒng) 計 學 意 義（

U

=318.000，

P

﹤0.01）。采用X+2SD（本研究中均數(shù)+2倍標準差為0.788）的分組方法，將65 例EOC 患者分 為

FOXD1

高 表 達（

FOXD1

≥0.788，

n

=21）和

FOXD1

低表達（

FOXD1

﹤0.788，

n

=44）。

2.2 FOXD1 表達水平對EOC 的診斷價值

ROC 曲線分析結果顯示，

FOXD1

表達水平診斷EOC 的AUC 為0.825（95%CI：0.730～0.921，

P

﹤0.01），其靈敏度和特異度分別為0.738 和0.786。（圖1）

圖1 FOXD1表達水平診斷EOC的ROC曲線

2.3 不同F(xiàn)OXD1 表達情況EOC 患者臨床特征的比較

FOXD1 高表達和低表達EOC 患者的腫瘤直徑、腫瘤分化程度、血漿糖類抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）水平及淋巴結轉(zhuǎn)移情況比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）；而FOXD1高表達和低表達EOC 患者的年齡、FIGO 分期及腹腔積液情況比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P ﹥0.05）。（表1）

表1 不同F(xiàn)OXD1 表達情況EOC 患者臨床特征的比較

2.4 生存情況的比較

FOXD1 高表達EOC 患者的中位總生存期為30.62（12.22，44.26）個月，

FOXD1

低表達EOC 患者的中位總生存期為24.62（9.89，45.47）個月，盡管

FOXD1

高表達患者的中位總生存期稍高于

FOXD1

低表達患者，但生存曲線分析結果顯示，

FOXD1

低表達患者的總生存情況優(yōu)于

FOXD1

高表達患者，差異有統(tǒng)計學意義（

χ

=5.739，

P

=0.017）（圖2）。

FOXD1

高表達EOC 患者的中位無進展生存期為11.17（8.95，27.84）個月，

FOXD1

低表達EOC 患者的中位無進展生存期為13.83（8.57，23.06）個月，生存曲線分析結果顯示，

FOXD1

低表達和

FOXD1

高表達患者的無進展生存情況比較，差異無統(tǒng)計學意義（

χ

=1.951，

P

=0.162）（圖3）。

圖2 FOXD1低表達（n=44）與FOXD1高表達（n=21）EOC患者的總生存曲線

圖3 FOXD1低表達（n=44）與FOXD1高表達（n=21）EOC患者的無進展生存曲線

3 討論

FOXD1

基因作為一種轉(zhuǎn)錄因子可能參與多種生理過程，在腫瘤的發(fā)生中也扮演重要的作用。已有文獻報道

FOXD1

可參與細胞生長、侵襲等生物學過程，從而賦予腫瘤特性。Wu 等發(fā)現(xiàn)

FOXD1

可以通過間接調(diào)節(jié)黑色素瘤細胞中的基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）和Ras 相關C3 肉毒梭菌毒素1B（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1B，RAC1B）影響腫瘤細胞的侵襲和遷移。過表達

FOXD1

可以通過激活胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2 或蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）等通路促進結腸癌發(fā)生發(fā)展。此外，在其他實體腫瘤如前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、非小細胞肺癌、宮頸癌中

FOXD1

表達上調(diào)，并可作為重要因子介導腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等。本研究通過qRT-PCR的方法檢測了EOC 患者腫瘤組織中

FOXD1

表達水平，發(fā)現(xiàn)其較非腫瘤患者顯著上調(diào)。ROC 曲線分析提示

FOXD1

異常表達有助于EOC 的診斷，具有潛在的臨床應用價值。此外，

FOXD1

高表達可能與腫瘤直徑、腫瘤分化程度及血漿CA125 水平等密切相關。以上結果也提示

FOXD1

可能促進EOC 細胞增殖以及細胞分化。當然，上述結果仍需深入的體外和體內(nèi)研究證實。除了作為腫瘤診斷分子標志，

FOXD1

異常表達也可影響實體腫瘤患者的預后。Nakayama 等發(fā)現(xiàn)

FOXD1

表達上調(diào)與非小細胞肺癌患者不良預后相關。在高級別膠質(zhì)瘤的臨床標本中，

FOXD1

和醛脫氫酶1 家族成員A3（aldehyde dehydrogenase 1 family member A3，ALDH1A3）表達水平呈正相關，且兩者異常高表達可影響患者的預后。而本研究發(fā)現(xiàn)

FOXD1

表達與EOC 患者的預后有關，提示

FOXD1

可以作為監(jiān)測EOC 患者預后情況的重要分子標志。與本文研究不同的是，Wang等發(fā)現(xiàn)低表達

FOXD1

與高級別漿液性卵巢癌患者預后不良相關，出現(xiàn)這種情況可能與標本的選擇不同有關，上述研究對象為高級別漿液性卵巢癌，僅是EOC 中的一個特殊亞型，而本文分析的是整個EOC 群體，因而可能出現(xiàn)

FOXD1

表達水平的差異。當然，本研究也存在一些不足之處。本研究涉及的樣本數(shù)量較少，且重點分析的是EOC 患者中

FOXD1

mRNA 水平，而無充足的標本以分析FOXD1 蛋白情況，因而僅是初步探索了EOC 中該基因的表達態(tài)勢，后續(xù)還需擴大樣本進一步分析以驗證上述結論。綜上所述，

FOXD1

高表達在EOC 患者中常見，可以作為EOC 的輔助診斷依據(jù)，并且

FOXD1

高表達與EOC 患者預后不良相關。