結(jié)直腸癌中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的表達(dá)及與Ki-67 的關(guān)系研究△

林琳，李奇棟，張忠慧，孫利君，許慶文，徐飛鵬

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科，廣東 湛江 524000

結(jié)直腸癌發(fā)病率居全球惡性腫瘤第三位，2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，中國結(jié)直腸癌新發(fā)56萬例，病死29 萬例。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，結(jié)直腸癌診斷率和治療效果明顯提高，但由于結(jié)直腸癌患者的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率較高，有研究發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者的5 年生存率明顯降低，接受根治性手術(shù)的結(jié)直腸癌患者中，仍有20%～45%的患者可能出現(xiàn)復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，由此可見，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響結(jié)直腸癌患者遠(yuǎn)期生存的重要因素，因此，深入探討結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移機(jī)制，有助于結(jié)直腸癌的診斷和治療。

1869 年，Ashworth 首次提出了循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）的概念，指實(shí)體腫瘤細(xì)胞在多種細(xì)胞因子的作用和調(diào)控下，從腫瘤組織脫落或進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，這其中絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞在免疫系統(tǒng)及自身凋亡的作用下死亡，只有極少數(shù)的腫瘤細(xì)胞能夠存活下來，這些存活下來的細(xì)胞具有極高的侵襲性和轉(zhuǎn)移傾向，其可發(fā)生黏附、聚集并在特定的條件下形成腫瘤微栓，實(shí)現(xiàn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使外周血CTC 檢測成為可能。Ki-67 又稱細(xì)胞增殖核抗原，因其只表達(dá)于增殖細(xì)胞中，表明其表達(dá)水平與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。本研究采用CanPatrol二代檢測技術(shù)分離富集和分析鑒定結(jié)直腸癌患者外周血中的CTC，檢測結(jié)直腸癌中CTC 及其分型的表達(dá)情況，并分析CTC、mCTC、Ki-67 與患者臨床特征的關(guān)系，分析結(jié)直腸癌患者CTC 及其分型的表達(dá)與Ki-67 表達(dá)的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年12 月至2019 年12 月廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的結(jié)直腸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)內(nèi)鏡病理或手術(shù)切除病理明確診斷為結(jié)直腸癌，且均為初次診斷；均行標(biāo)準(zhǔn)結(jié)直腸癌根治手術(shù)治療。排除合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤的患者。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入230 例結(jié)直腸癌患者，其中男147 例，女83 例；年齡23～89 歲，中位年齡63 歲；TNM 分期：Ⅰ期27 例，Ⅱ期96 例，Ⅲ期107 例；腫瘤部位：升結(jié)腸63 例，降結(jié)腸19 例，乙狀結(jié)腸58 例，直腸90 例；腫瘤最大徑：≥5 cm 89例，﹤5 cm 141 例；分化程度：低分化58 例，中分化144 例，高分化28 例；浸潤深度：T期10 例，T期28例，T期78 例，T期114 例；合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移107例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移123 例；神經(jīng)侵犯98 例，無神經(jīng)侵犯132 例；脈管侵犯53 例，無脈管侵犯177 例。

1.2 方法

1.2.1 CTC 的檢測方法 抽取230例結(jié)直腸癌患者空腹外周靜脈血5 ml，置于乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）試管中，800～1000 r/min離心5～8 min，加入紅細(xì)胞裂解液后再次離心，移除破碎的紅細(xì)胞，加入4%多聚甲醛固定液固定10 min。使用由真空歧管連接裝有8 μm 孔校準(zhǔn)膜的過濾器和迷你臺式真空泵過濾樣本，壓力為0.08 MPa，再次置于含4%甲醛的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）中固定60 min，完成CTC 的分離富集。CTC 的分型檢測于24 孔板上進(jìn)行，采用多重mRNA 原位分析法，使用多種特異性針對CTC 的RNA探針，分別對表達(dá)上皮表型基因[如上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）、CK8、CK18、CK19]的CTC 和表達(dá)間質(zhì)表型基因[波形蛋白（vimentin）、twist]的CTC 以及區(qū)別CTC 和白細(xì)胞的特異性核酸探針（CD45）進(jìn)行不同熒光染色標(biāo)記。具體操作過程如下：對分離富集后的樣本進(jìn)行透化和消化處理，加入3 組探針工作液置于恒溫培養(yǎng)箱中靜置120 min，后進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增（30%馬血清、1.5%十二烷基硫酸鈉、3 mmol/L pH=8.0的三羥甲基氨基甲烷緩沖液、0.5 fmol 預(yù)擴(kuò)增序列）、擴(kuò)增（30%馬血清、1.5%十二烷基硫酸鈉、3 mmol/L pH=8.0 的三羥甲基氨基甲烷緩沖液、1.0 fmol的擴(kuò)增序列）、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色及4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4', 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色處理，以上步驟過程均使用PBS 沖洗3次，每次2 min。最后采用熒光顯微鏡觀察并分析熒光信號。

1.2.2 免疫組化法檢測Ki-67 表達(dá)情況 取230 例結(jié)直腸癌患者的結(jié)直腸癌組織，置于10%福爾馬林固定液中固定24～48 h，清水沖洗后將其浸泡于不同濃度的乙醇溶液中脫水，經(jīng)二甲苯透明，病理組織包埋機(jī)石蠟包埋，切片，厚度為4 μm。經(jīng)過烤片、二甲苯、乙醇脫水及水化處理，加入檸檬酸修復(fù)液加熱，冷卻至室溫，PBS 沖洗3 次，加入3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS 沖洗3 次后滴加Ki-67 抗體，4 ℃孵育過夜；加入羊抗兔多克隆免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體，室溫孵育30 min，PBS 沖洗3 次，DAB 顯色，自來水重復(fù)沖洗2～3 次。蘇木素復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封片后，顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.3 結(jié)果判定 不同特異性探針雜交染色后，識別不同的熒光信號點(diǎn)，可將CTC 分為上皮型CTC（epithelial CTC，eCTC）、混合型CTC（biophenotypic CTC，bCTC）和間質(zhì)型CTC（mesenchymal CTC，mCTC）（圖1）。將結(jié)直腸癌患者外周血CTC≥3/5 ml判定為陽性，﹤3/5 ml 判定為CTC 陰性；eCTC、bCTC、mCTC≥1/5 ml 判定為陽性，﹤1/5 ml 判定為陰性；Ki-67 主要定位于細(xì)胞核，細(xì)胞核呈棕黃色染色判定為陽性。

圖1 熒光顯微鏡下結(jié)直腸癌患者外周血CTC分型（熒光染色，×400）

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用

χ

檢驗(yàn)，以

P

﹤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌患者CTC 表達(dá)情況

230 例結(jié)直腸癌患者中，207 例患者檢出CTC，檢出率為90%（207/230），其中159例檢出CTC陽性，陽性率為69.13%（159/230）；CTC 計(jì)數(shù)0～143/5 ml，平均12.6/5 ml，中位5/5 ml。eCTC、bCTC、mCTC陽性率分別為50.00%（115/230）、66.96%（154/230）、71.30%（164/230）；不同TNM 分期結(jié)直腸癌患者CTC 表達(dá)情況結(jié)果顯示，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌患者CTC 陽性率分別為55.56%、64.58%、76.64%，mCTC 陽 性 表 達(dá) 率 分 別 為51.85% 、66.71% 、79.44%，CTC、mCTC 陽性表達(dá)率隨臨床分期的升高而逐漸升高（表1）。

表1 不同臨床分期結(jié)直腸癌患者CTC 及其分型的陽性表達(dá)情況[n（%）]

2.2 不同臨床特征結(jié)直腸癌患者CTC、mCTC、Ki-67 表達(dá)情況比較

230 例結(jié)直腸癌患者中，Ki-67≥60%患者195例，Ki-67﹤60%患者35 例。不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大徑、浸潤深度、神經(jīng)侵犯情況、脈管侵犯情況結(jié)直腸癌患者CTC、mCTC、Ki-67 表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹥0.05）。不同分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM 分期結(jié)直腸癌患者血清CTC 陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=7.606、5.281、5.281，

P

﹤0.05）。不同分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM 分期結(jié)直腸癌患者血清mCTC 陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=14.852、6.471、6.471，

P

﹤0.05）。不同分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM 分期結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中Ki-67≥60%表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=8.283、5.347、5.347，

P

﹤0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征結(jié)直腸癌患者的CTC、mCTC、Ki-67 表達(dá)情況

2.3 不同Ki-67 表達(dá)水平結(jié)直腸癌患者CTC 及分型陽性表達(dá)情況比較

Ki-67≥60%與Ki-67﹤60%結(jié)直腸癌患者CTC、eCTC、bCTC 陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹥0.05）。Ki-67≥60%結(jié)直腸癌患者mCTC 陽性表達(dá)率為73.85%（144/195），高于Ki-67﹤60%患者的57.14%（20/35），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=4.046，

P

﹤0.05）。（表3）

表3 不同Ki-67 表達(dá)水平結(jié)直腸癌患者CTC 及分型陽性表達(dá)情況比較

3 討論

目前，結(jié)直腸癌的輔助診斷、療效評估及預(yù)后監(jiān)測手段主要包括血清腫瘤標(biāo)志物[如癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）]檢測、影像學(xué)檢查[如CT、MRI、超聲、正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像（position emission tomography，PET）-CT]、內(nèi)鏡及病理組織活檢等。但上述檢查手段或多或少存在著一些不足，CEA 水平升高表明消化道腫瘤、泌尿系腫瘤、乳腺癌及肺癌等惡性腫瘤的存在，但在結(jié)腸炎、胰腺炎等良性病變中也存在CEA 水平升高，長期合并心腦血管疾病、糖尿病等慢性疾病患者的血清CEA 水平也會升高，表明CEA 的特異度較低。CT、MRI、PET-CT 及內(nèi)鏡等影像學(xué)檢查雖然能夠直觀地顯示腫瘤病灶，但并不能及時發(fā)現(xiàn)隱匿性、轉(zhuǎn)移灶或微小的術(shù)后殘留病灶，具有一定的滯后性。組織活檢是結(jié)直腸癌的診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但存在多次反復(fù)取檢、創(chuàng)傷較大、特殊部位難以取檢、存在一定假陰性或無法動態(tài)監(jiān)測的可能。因此，亟需尋找一種能早期發(fā)現(xiàn)腫瘤、動態(tài)監(jiān)測療效、預(yù)后評估的生物學(xué)指標(biāo)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞經(jīng)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）后，其原有上皮表型的蛋白表達(dá)下調(diào)，而間質(zhì)型表型的蛋白表達(dá)上調(diào)，即細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞極性丟失，從而增強(qiáng)了細(xì)胞的運(yùn)動能力，使其從原腫瘤組織脫落，或進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，形成CTC，為腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移打下基礎(chǔ)。Wong 等納入132 例結(jié)直腸癌患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，62%的患者呈CTC 陽性，且CTC 計(jì)數(shù)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)。吳志清納入60 例結(jié)直腸癌患者發(fā)現(xiàn)，外周血CTC 陽性表達(dá)率與TNM 分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、分化程度密切相關(guān)。葛祖蔭等研究發(fā)現(xiàn)，低中分化結(jié)直腸患者的CTC陽性表達(dá)率高于高分化的結(jié)直腸癌患者。本研究納入230 例結(jié)直腸癌患者，結(jié)果顯示，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌患者CTC 陽性率分別為55.56%、64.58%、76.64% ，mCTC 陽 性 表 達(dá) 率 分 別 為51.85% 、66.71%、79.44%，表明CTC、mCTC 陽性表達(dá)率隨結(jié)直腸癌患者病情的進(jìn)展而升高。此外，本研究結(jié)果顯示，不同分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM 分期結(jié)直腸癌患者CTC、mCTC 陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.05），表明CTC 及mCTC可能對結(jié)直腸癌患者的預(yù)后評估有重要意義。發(fā)生脈管侵犯的結(jié)直腸癌患者的mCTC 陽性表達(dá)率高達(dá)81.13%，高于無脈管侵犯患者的68.36%，雖然差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹥0.05），但也提示，mCTC 可能參與結(jié)直腸癌的血行轉(zhuǎn)移過程。Ki-67 由

MKI

-

67

基因編碼，是一種存在于細(xì)胞核的非組蛋白，其不表達(dá)于細(xì)胞周期G期，而在G期開始表達(dá)，S 期及G期開始增加，至M 期達(dá)到頂峰，隨后表達(dá)水平迅速降低，往復(fù)循環(huán)。有研究認(rèn)為，Ki-67 的表達(dá)水平與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，但其表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系尚未完全闡明。趙巖等納入50 例結(jié)直腸癌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ki-67 表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、分化程度及Dukes 分期有關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤最大徑和浸潤深度無關(guān)。王曉元等的研究發(fā)現(xiàn)，Ki-67 的表達(dá)水平與浸潤深度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、脈管侵犯情況有關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤最大徑和分化程度無關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者Ki-67 表達(dá)情況與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大徑、浸潤深度、神經(jīng)侵犯情況、脈管侵犯情況可能無關(guān)，與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM 分期可能有關(guān)。表明Ki-67 在結(jié)直腸癌進(jìn)展、侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)水平較高提示腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，患者的預(yù)后不良。

本研究進(jìn)一步探討CTC 及其分型的表達(dá)與Ki-67 表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ki-67≥60%與Ki-67﹤60%結(jié)直腸癌患者CTC、eCTC、bCTC 陽性表達(dá)率無明顯差異，但Ki-67≥60%結(jié)直腸癌患者的mCTC陽性表達(dá)率為73.85%，高于Ki-67﹤60%患者的57.14%。Gasinska 等的研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤細(xì)胞的EMT 可能與vimentin、N-鈣黏素（N-cadherin）、Ki-67、survivin 的高表達(dá)及E-鈣黏素（E-cadherin）和磷酸酶張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）的低表達(dá)有關(guān)。此外，惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，常伴隨腫瘤微環(huán)境的改變，其中腫瘤細(xì)胞過快增殖導(dǎo)致組織缺氧和腫瘤細(xì)胞壞死所致的炎性反應(yīng)也是特征表現(xiàn)。而在缺氧的條件下，腫瘤細(xì)胞可通過缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）激活twist 的表達(dá)從而啟動EMT過程。白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）可通過JAK-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transduction and activator of transcription，STAT）通路誘導(dǎo)snail1 的表達(dá)來促進(jìn)EMT 過程。上述研究均表明，Ki-67 高表達(dá)可能與EMT 密切相關(guān)，為證實(shí)Ki-67 表達(dá)與CTC 及mCTC 有關(guān)的假設(shè)提供了理論可能。

綜上所述，結(jié)直腸癌患者外周血中檢測到CTC 及mCTC 的表達(dá)提示腫瘤進(jìn)展及潛在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的可能，對評估患者的預(yù)后有一定的參考價值，Ki-67 表達(dá)水平與mCTC 的表達(dá)可能有關(guān)，但仍需進(jìn)一步深入研究。