石韋不同極性萃取物體外降血糖活性研究

莊遠(yuǎn)杯　凌梅娣　魏愛紅　李榕娣　 劉小敏　聶華　張聲源

摘要：為進(jìn)一步明確石韋對α葡萄糖苷酶和α淀粉酶抑制作用機(jī)制，該研究以石韋95%乙醇提取物的不同極性萃取物為試材，阿卡波糖為陽性對照，采用pNPG法（pnitrophenylαDglucopyranoside， pNPG）、DNS法（3，5dinitro salicylic acid， DNS）考察石韋不同極性萃取物的α葡萄糖苷酶和α淀粉酶抑制活性，并采用酶促動(dòng)力學(xué)方法與LineweaverBurk曲線分析最強(qiáng)活性萃取物對α葡萄糖苷酶的抑制作用類型，以期為石韋的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。結(jié)果表明：石韋水萃取物對α葡萄糖苷酶和α淀粉酶的抑制作用最強(qiáng)，其IC50值分別為（4.71 ± 0.72）μg·mL1、IC50 =（48.40 ± 0.32）μg·mL1，并顯著強(qiáng)于其他萃取物（P<0.05），且對α葡萄糖苷酶抑制作用比阿卡波糖強(qiáng)，對α淀粉酶抑制作用弱于阿卡波糖。阿卡波糖對α葡萄糖苷酶和α淀粉酶抑制作用的IC50值分別為（2 857.36 ± 1.35）μg·mL1和（16.41 ± 0.63）μg·mL1。酶促動(dòng)力學(xué)顯示水萃取物對α葡萄糖苷酶為可逆性抑制，LineweaverBurk曲線顯示為競爭性抑制。綜上結(jié)果表明，石韋水萃取物具有較好的α葡萄糖苷酶和α淀粉酶抑制活性，是一種胃腸道副作用小、天然α葡萄糖苷酶抑制劑來源。

關(guān)鍵詞： 石韋， α葡萄糖苷酶， α淀粉酶， 阿卡波糖， 提取物

中圖分類號：Q946

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：10003142（2022）05085505

Hypoglycemic activities of different solvent extracts

from Pyrrosia lingua in vitro

Abstract：In order to further make clear the inhibition mechanism of Pyrrosia lingua on αglucosidase and αamylase， their inhibitory activities of different polar extracts of 95% ethanol extracts of P. lingua were investigated by using pnitrophenylαDglucopyranoside （pNPG） and 3，5dinitro salicylic acid （DNS） methods with acarbose as positive control. Enzyme kinetics method and LineweaverBurk curve were used to analyze the types of inhibition of αglucosidase for the most active extract. The results showed that the IC50 values of the water extract were （4.71 ± 0.72）μg·mL1 for αglucosidase and （48.40 ± 0.32）μg·mL1 for αamylase respectively， which were significantly stronger than those of the other extracts （P < 0.05）. The inhibition of αglucosidase was stronger than that of acarbose， while the inhibition of αamylase was weaker than that of acarbose. The IC50 values of acarbose on αglucosidase and αamylase were （2 857.36 ± 1.35） μg·mL1 and （16.41 ± 0.63）μg·mL1， respectively. The enzymatic kinetics showed that the inhibitory type on αglucosidase of water extract was reversible inhibition， while the LineweaverBurk curve showed a competitive inhibition. In conclusion， the water extract from P. lingua displays potential inhibitory activity on αglucosidase and αamylase， can be the natural sources of αglucosidase inhibitor with less gastrointestinal side effects.

Key words： Pyrrosia lingua， αglucosidase， αamylase， acarbose， extract

2019年全球20～79歲糖尿病患者約4.63億，中國約 1.164 億（International Diabetes Federation， 2019），糖尿病已成為嚴(yán)重威脅人類健康的第三大疾?。钗挠?，2018）。餐后血糖持續(xù)升高是引起糖尿病患者血管內(nèi)皮損傷、視網(wǎng)膜病變等并發(fā)癥的主要原因，因此有效控制餐后血糖上升有利于防治糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生（中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會，2018）。以α葡萄糖苷酶和α淀粉酶為降低餐后血糖有效分子靶標(biāo)開發(fā)的阿卡波糖、伏格列波糖等藥物已成為臨床降低餐后血糖的首選藥物。阿卡波糖對α淀粉酶具有強(qiáng)抑制作用，長期服用會引起腸胃脹氣、腹部不適等胃腸道副作用（袁向華等，2016;蘇青，2018），從中藥及天然藥物中尋找新型高效、副作用小的α淀粉酶和α葡萄糖苷酶抑制劑已引起醫(yī)藥工作者的關(guān)注，近年已取得了一系列研究成果（范莉等，2016）。C6C048C8-A9A8-4099-AD25-7A58209CA6AD

石韋（Pyrrosia lingua）為水龍骨科石韋屬植物，別名石劍、石葦，主產(chǎn)區(qū)為廣東、福建、臺灣等地，具有通淋利水、泄熱清肺等功效，臨床用于治療淋痛、尿血、尿路結(jié)石、腎炎等（國家藥典委員會，2015）。石韋為民間防治糖尿病的常用中草藥（周悅，2016），現(xiàn)代藥理研究也證實(shí)石韋可影響小鼠血糖、糖耐量（王兵和黃傳貴，2008），改善糖尿病和腎病（劉緒林等，2018）。此外，本課題組前期對梅州客家地區(qū)特色和優(yōu)勢藥用植物進(jìn)行了體外降血糖活性初步篩選，發(fā)現(xiàn)石韋具有較好的體外降血糖活性。為進(jìn)一步明確石韋對α葡萄糖苷酶和α淀粉酶抑制作用和作用機(jī)制，本研究以阿卡波糖為陽性對照，4硝基苯αD吡喃葡萄糖苷和淀粉為底物，評價(jià)石韋95%乙醇提取物的不同極性萃取物對α葡萄糖苷酶和α淀粉酶的抑制活性，并對活性最強(qiáng)的萃取物通過酶促動(dòng)力學(xué)方法與LineweaverBurk曲線明確其α葡萄糖苷酶的抑制作用類型，為進(jìn)一步開展石韋降血糖方面的化學(xué)成分和藥效學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

石韋于2016年4月采自廣東省梅州市陰那山自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院客家藥用生物資源研究所張聲源副教授鑒定為水龍骨科（Polypodiaceae）石韋屬（Pyrrosia）多年生草本植物石韋（Pyrrosia lingua）。

1.2 方法

1.2.1 石韋不同極性部位萃取物的制備石韋2.0 kg，50 ℃烘干，粉碎過40目篩，加2倍量的95%乙醇，超聲（200 W，40 kHz，45 ℃）提取30 min，重復(fù)3次，濃縮得浸膏（230 g）。200 g浸膏加蒸餾水混懸，萃取濃縮得石油醚萃取物（25 g），乙酸乙酯萃取物（66 g），正丁醇萃取物（53 g），水萃取物（50 g）。

1.2.2 對α淀粉酶的抑制活性參照丁華杰等（2020）的DNS法，測定不同極性部位萃取物對α淀粉酶的抑制活性，重復(fù)3 次，以阿卡波糖為陽性對照。

1.2.3 對α葡萄糖苷酶的抑制活性參照張聲源等（2018）的pNPG法，測定不同極性部位萃取物對α葡萄糖苷酶的抑制活性，重復(fù)3 次，以阿卡波糖為陽性對照。

1.2.4 對α葡萄糖苷酶抑制作用的動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

1.2.4.1 α葡萄糖苷酶酶活力和反應(yīng)時(shí)間的確定參照溫正輝等（2019）的方法，測定4.0 mmol·L1 pNPG溶液在不同酶活力（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 U·mL1）條件下的酶促反應(yīng)初速率。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，pNP峰面積為縱坐標(biāo)作圖。

1.2.4.2 α葡萄糖苷酶抑制類型的研究參考賴小燕等（2016）和李波等（2015）的方法，測定樣品溶液為0、5、7 μg·mL1，pNPG溶液為4.0 mmol·L1 ，α葡萄糖苷酶活力為0.06、0.10、0.14、0.18、0.22 U·mL1的反應(yīng)初速率。以酶活力為橫坐標(biāo)，反應(yīng)初速率為縱坐標(biāo)作圖，判斷其可逆或不可逆抑制類型。

可逆性抑制類型包括競爭性抑制、非競爭性抑制、反競爭性抑制和混合型抑制四種類型（宋菲等，2019）。測定樣品溶液為0、5、7 μg·mL1在0.1 U·mL1 α葡萄糖苷酶，pNPG濃度為1、2、4、8、16 mmol·L1 的反應(yīng)初速率。以pNPG濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，反應(yīng)初速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制LineweaverBurk曲線，判斷其具體抑制類型。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用Origin 8.5 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（x ±s）表示，并得到相應(yīng)的半數(shù)抑制濃度（IC50）。利用單因素方差分析和Duncan 法檢驗(yàn)多組數(shù)據(jù)間差異的顯著性（P<0.05或P<0.01）。

2結(jié)果與分析

2.1 石韋萃取物對α淀粉酶的抑制活性

由圖1可知，石韋不同極性萃取物和阿卡波糖對α淀粉酶均具有一定的抑制作用，抑制率隨質(zhì)量濃度的增大而升高，呈一定的量效關(guān)系。不同極性萃取物中，水萃取物對α淀粉酶抑制活性最強(qiáng)，其IC50值為（48.40 ± 0.32）μg·mL1，顯著低于正丁醇萃取物（530.89 ± 6.95）μg·mL1、乙酸乙酯萃取物（4 929.36 ± 1.56）μg·mL1和石油醚萃取物（50 148.70 ± 1.94）μg·mL1（P<0.05）。

2.2 石韋萃取物對α葡萄糖苷酶的抑制活性

由圖2可知，石韋不同極性萃取物和阿卡波糖對α葡萄糖苷酶均具有一定的抑制作用，抑制率隨質(zhì)量濃度的增大而升高，呈一定的量效關(guān)系。在不同極性萃取物中，水萃取物對α淀粉酶抑制活性最強(qiáng)，其IC50值為（4.71 ± 0.72）μg·mL1，顯著低于正丁醇萃取物（25.35 ± 0.12）μg·mL1、乙酸乙酯萃取物（193.77 ± 1.81）μg·mL1、石油醚萃取物（388.48 ± 4.71）μg·mL1、阿卡波糖（2 857.36 ± 1.35）μg·mL1（P<0.05）。

2.3 石韋水萃取物對α葡萄糖苷酶的抑制類型

2.3.1 α葡萄糖苷酶酶活力和反應(yīng)時(shí)間的確定由圖3可知，在反應(yīng)時(shí)間0～10 min范圍內(nèi)，0.02～0.12 U·mL1酶活力的酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線均具有良好的線性關(guān)系（各曲線在0～10 min進(jìn)行線性擬合，R2均達(dá)到0.999），呈現(xiàn)勻速狀態(tài)，故確定初速率測定采樣時(shí)間點(diǎn)為10 min。

2.3.2 可逆或不可逆抑制類型的確定由圖4可知，石韋水萃取物濃度為0、5、7 μg·mL1所得的直線均通過原點(diǎn)，且隨石韋水萃取物質(zhì)量濃度增大，直線的斜率越低，反應(yīng)初速率降低，為典型的可逆性抑制特征圖，由此可得石韋水萃取物對α葡萄糖苷酶屬于典型的可逆性抑制。C6C048C8-A9A8-4099-AD25-7A58209CA6AD

2.3.3 競爭性、非競爭性、反競爭性和混合型抑制類型的確定由圖5可知，三組直線交于縱軸，最大反應(yīng)速率Vmax不變，為0.006 6 mmol·L1·min1，斜率（米氏常數(shù)Km）隨抑制劑質(zhì)量濃度的增大而增大，為典型的競爭性類型，表明石韋水萃取物對α葡萄糖苷酶抑制作用為競爭性抑制。

3討論與結(jié)論

石韋為民間防治糖尿病的常用中草藥（周悅，2016），現(xiàn)代藥理研究顯示石韋可影響小鼠血糖、糖耐量（王兵和黃傳貴，2008），改善糖尿病腎?。▌⒕w林等，2018），但其作用靶點(diǎn)是否與抑制α葡萄糖苷酶和α淀粉酶有關(guān)的研究未見報(bào)道。實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)石韋95%乙醇提取物的不同溶劑萃取物對α葡萄糖苷酶和α淀粉酶具有良好的抑制活性，豐富了石韋發(fā)揮降血糖作用的靶點(diǎn)研究。

目前，臨床常用的α葡萄糖苷酶抑制劑由于對α淀粉酶的過度抑制，常導(dǎo)致胃腸道副作用（李波等，2015），顧覺奮和陳紫娟（2009）研究表明其抑制作用強(qiáng)度與假雙糖結(jié)構(gòu)連接的葡萄糖分子數(shù)目有關(guān)。本研究對石韋95%乙醇提取物的不同溶劑萃取物開展較為系統(tǒng)的體外α葡萄糖苷酶和α淀粉酶抑制活性評價(jià)，結(jié)果顯示石韋各萃取物對α葡萄糖苷酶和α淀粉酶抑制活性大小均為水萃取物>正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物>石油醚萃取物（P<0.05），且活性最強(qiáng)的水萃取物對α葡萄糖苷酶的抑制類型為競爭性抑制，與陽性對照阿卡波糖相同?？赡芘c石韋中具有與阿卡波糖抑制α葡萄糖苷酶和α淀粉酶所必須的假雙糖結(jié)構(gòu)有關(guān)。該結(jié)構(gòu)由環(huán)己糖醇及氨基糖構(gòu)成，為極性大的寡糖類似物（顧覺奮和陳紫娟，2009）。但是，石韋在體內(nèi)對α葡萄糖苷酶的抑制作用是否與阿卡波糖對α葡萄糖苷酶的抑制作用相同，還需要進(jìn)一步深入研究。此外，石韋萃取物對α葡萄糖苷酶的抑制活性較強(qiáng)，而對α淀粉酶抑制活性較弱，可能與石韋中發(fā)揮α淀粉酶抑制活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)連接的葡萄糖分子數(shù)目與阿卡波糖連接葡萄糖分子數(shù)目不同有關(guān)。

本研究揭示了石韋95%乙醇提取物的不同溶劑萃取物中水萃取物具有最強(qiáng)的α葡萄糖苷酶和α淀粉酶的抑制活性，且對α葡萄糖苷酶為可逆競爭性抑制，表明石韋大極性化學(xué)部位中富含抑制α葡萄糖苷酶和α淀粉酶的活性成分，是天然的、胃腸道副作用小的α葡萄糖苷酶抑制劑來源。但是，石韋中抑制α葡萄糖苷酶和α淀粉酶的具體活性成分、體內(nèi)外作用機(jī)制以及構(gòu)效關(guān)系等還不明確，后續(xù)研究應(yīng)重點(diǎn)對大極性化學(xué)部位開展系統(tǒng)的化學(xué)成分、作用機(jī)制、構(gòu)效關(guān)系等研究，有望闡明石韋降血糖作用的科學(xué)內(nèi)涵。

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（責(zé)任編輯李莉）

收稿日期：2021-02-23

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年基金（81703662）;廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2020B121201013）;梅州市醫(yī)藥衛(wèi)生科研課題 （2019B10）;梅州市社會發(fā)展科技計(jì)劃項(xiàng)目 （2018B057）;廣東省高等教育“沖補(bǔ)強(qiáng)” 提升計(jì)劃重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科（農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境）建設(shè)項(xiàng)目（粵教科函[2018]181號）;廣東省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（201910582267）

第一作者： 莊遠(yuǎn)杯（1994- ），實(shí)驗(yàn)員，主要從事天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，（Email）1294632773@qq.com。

通信作者：張聲源，博士，副教授，研究方向?yàn)橹兴幖疤烊凰幬锘钚猿煞?，（Email）mcdullzhang@yeah.net。C6C048C8-A9A8-4099-AD25-7A58209CA6AD