ALA對刺葡萄愈傷組織生長及主要抗氧化物質(zhì)積累的影響

張靜 潘紅 賴呈純 賴恭梯 黃賢貴 王琦 高慧穎 陳桂信

摘 ?要：以刺葡萄紅色愈傷組織為材料，研究不同濃度ALA處理對刺葡萄愈傷組織生物量及主要抗氧化物質(zhì)（黃酮類化合物、原花青素和花色苷）積累量的影響，明確ALA與刺葡萄愈傷組織生長、主要抗氧化活性物質(zhì)合成的相關(guān)性。結(jié)果表明：中低濃度（0.05～1.0 mg/L）ALA可促進(jìn)刺葡萄愈傷組織生長，顯著增加刺葡萄愈傷組織的生物量;同時，中低濃度ALA能顯著增加刺葡萄細(xì)胞中黃酮類化合物、原花青素和花色苷的含量;高濃度（2.0～5.0 mg/L）ALA會抑制刺葡萄愈傷組織生長，并最終導(dǎo)致褐變死亡;刺葡萄愈傷組織主要抗氧化物質(zhì)積累也存在顯著的培養(yǎng)階段差異，在ALA最適濃度0.05 mg/L時，刺葡萄細(xì)胞中黃酮類化合物含量最高可達(dá)272.48 μg/g（培養(yǎng)45 d）、花色苷含量最高達(dá)107.24 μg/g（培養(yǎng)35 d）、原花青素含量最高達(dá)1630.16 μg/g（培養(yǎng)45 d）。由結(jié)果可知，ALA可以定向調(diào)控刺葡萄愈傷組織細(xì)胞中主要抗氧化物質(zhì)的生物合成。

關(guān)鍵詞：刺葡萄;愈傷組織;抗氧化物質(zhì);花色苷;5-氨基乙酰丙酸（ALA）

Abstract： In order to determine the correlation between ALA （5-aminolevulinic acid） and the growth of spine grape callus and the synthesis of its main antioxidant bioactive substances， the effects of different ALA concentrations on the biomass of spine grape callus and its main antioxidants content， including flavonoids， proanthocyanidins， and anthocyanins， were investigated using the red callus of spine grape. The results showed that medium or low ALA concentration （0.05 to 1.0 mg/L） could promote the growth of spine grape callus and increase the biomass significantly. Meanwhile， the content of flavonoids， proanthocyanidins and anthocyanins in the cells of the spine grape callus could be significantly increased at medium or low concentrations of ALA. But the growth of spine grape callus was strongly inhibited under high levels of ALA concentrations （2.0 to 5.0 mg/L）， and eventually browning to death. The main antioxidants were also significant differences in the cell cultures of spine grape callus at different stages of culture. At the optimal ALA concentration of 0.05 mg/L， the maximum flavonoids content in the cells of spine grape callus was 272.48 μg/g （cultured for 45 days）， the maximum anthocyanins content was 107.24 μg/g （cultured for 35 days）， and the maximum proanthocyanidins content was 1630.16 μg/g （cultured for 45 days）. It indicated that ALA can regulate the biosynthesis of main antioxidants in the cells of spine grape callus.

Keywords： spine grape [Vitis davidii （Roman. du Caill.） Fo?x.]; callus; antioxidants; anthocyanins; 5-aminolevulinic acid （ALA）

刺葡萄[Vitis davidii （Roman. du Caill.） Fo?x.]為葡萄科（Vitaceae）葡萄屬（Vitis）的木質(zhì)藤本植物，其果肉呈紫黑色，富含酚類化合物、黃酮類化合物、白藜蘆醇、齊墩果酸、鞣質(zhì)等天然生物活性物質(zhì)[1]，其中刺葡萄皮中的花色苷不僅是優(yōu)良的天然色素，與刺葡萄籽中的原花青素一樣，是優(yōu)良的天然抗氧化劑[2]，在食品、醫(yī)藥和化妝品等工業(yè)有廣泛的應(yīng)用。隨著人們對植物天然生物活性物質(zhì)有利于人類身體健康生理功能重視，市場對于植物天然活性物質(zhì)，尤其是花青素和原花青素等抗氧化生物活性物質(zhì)的需求越來越大，需要尋找一種可以持續(xù)不斷規(guī)?；a(chǎn)提取原料的途徑。研究表明，植物細(xì)胞培養(yǎng)是獲取植物天然生物活性物質(zhì)的有效技術(shù)手段，并已在商業(yè)化應(yīng)用上得以實(shí)施[3]。因此，通過葡萄細(xì)胞的周年培養(yǎng)是獲取葡萄花色苷及其他天然生物活性物質(zhì)的可行途徑之一[4-5]。然而，在葡萄細(xì)胞培養(yǎng)中，穩(wěn)定提高細(xì)胞中花色苷和原花青素等生物活性物質(zhì)含量的技術(shù)措施還有待進(jìn)一步優(yōu)化和完善。前人的研究表明，葡萄幼果期和轉(zhuǎn)色期噴布不同濃度的5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）對葡萄果皮花青素含量、果實(shí)生長和品質(zhì)[6-8]及抗逆性[9]等都有顯著影響。

ALA是四氫吡咯的前綴化合物，是葉綠素、血紅素、維生素B12等生物體合成不可或缺的物質(zhì)[10-11]。ALA是一種天然、無毒、可生物降解且對環(huán)境友好的新型植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，在農(nóng)業(yè)實(shí)踐生產(chǎn)中有著重要的應(yīng)用價值，可作為植物生長促進(jìn)劑或抗逆增強(qiáng)劑[12]。近年來國內(nèi)外關(guān)于ALA生物學(xué)功能的研究很多，主要在植物光合作用、抗低溫、耐鹽等生理方面[13]。ALA具有生長素和細(xì)胞分裂素的雙重性質(zhì)，在組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中具有良好的應(yīng)用前景[14]，有研究表明，ALA能促進(jìn)紫杉愈傷組織生長并增加紫杉醇的產(chǎn)量[15]。本研究以刺葡萄松散型紅色愈傷組織為材料，用不同濃度的ALA處理刺葡萄愈傷組織，以期篩選出ALA誘導(dǎo)刺葡萄愈傷組織花色苷積累的最適濃度，并研究ALA對刺葡萄愈傷組織生長狀態(tài)及主要抗氧化活性物質(zhì)含量的影響。以期為刺葡萄愈傷組織花色苷等次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)與開發(fā)，及葡萄果實(shí)色澤調(diào)控提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)支撐，具有重要的理論意義和實(shí)踐價值。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

以福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所誘導(dǎo)并長期繼代保存的具高產(chǎn)花青素和原花青素的刺葡萄紅色愈傷組織細(xì)胞系[16]為實(shí)驗(yàn)材料。

主要試劑：5-氨基乙酰丙酸、原花青素、矢車菊-3-葡萄糖苷，Sigma-Aldrich公司;蘆丁，BBI公司;其他試劑為國產(chǎn)分析純。

主要儀器設(shè)備：CLARIOstar多功能酶標(biāo)儀，德國BMG Labtech;800KDE超聲波儀，昆山市超聲儀器有限公司;Heraeus Multifuge X3R高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo Fisher Scientific;BSG-12水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?培養(yǎng)基配制 ?本研究所用培養(yǎng)基為附加2，4-D 1.0 mg/L、蔗糖30.0 g/L、瓊脂粉6.0 g/L和不同濃度ALA的固體MS培養(yǎng)基。

ALA母液配制：準(zhǔn)確稱取50 mg的ALA粉末，加入100?mL的蒸餾水進(jìn)行溶解，配制濃度為0.5?mg/mL的ALA母液，將配制好的ALA母液于超凈工作臺內(nèi)采用0.22 μm過濾器過濾滅菌，備用。

將滅菌好的附加2，4-D 1.0 mg/L的MS培養(yǎng)基置于超凈工作臺內(nèi)冷卻至50?℃左右，然后用移液器加入一定量的ALA母液，配制成ALA濃度分別為0（CK）、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L的MS固體培養(yǎng)基。

1.2.2 ?刺葡萄愈傷組織的培養(yǎng)與處理 ?刺葡萄紅色愈傷組織培養(yǎng)20 d后，選取形態(tài)一致的細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基中，每瓶接種6團(tuán)大小均勻一致的細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞團(tuán)大小為0.1 g左右，每個濃度梯度各接30瓶，然后將培養(yǎng)瓶置于光照強(qiáng)度2000～2500?lx、溫度為（25±1）℃、相對濕度50%～ 60%、每天光照12 h的條件下培養(yǎng)。各處理的刺葡萄愈傷組織培養(yǎng)到25、35、45 d分別取樣，取樣時進(jìn)行拍照，稱重，收集過程去除培養(yǎng)基，用濾紙吸附多余水分，裝入自封袋，放在液氮中速凍，貯藏于–80?℃超低溫冰箱內(nèi)，備用。

1.2.3 ?黃酮類化合物含量測定 ?刺葡萄愈傷組織黃酮類化合物含量測定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法，在周丹蓉等[17]的基礎(chǔ)上稍作改動。黃酮類化合物提?。簻?zhǔn)確稱取細(xì)胞鮮重樣品0.2 g，加入80%（V/V）的乙醇水溶液1.0 mL?；靹?，置于超聲波儀器中（功率100%，溫度30?℃）超聲45 min。7000 r/min離心5 min，取上清至新的10 mL離心管中。重復(fù)提取3次，混合3次上清，待測。

分別精確吸取300?μL提取液，各加入5%亞硝酸鈉溶液300?μL，搖勻后靜置6?min;分別加入10%硝酸鋁溶液300?μL，搖勻后靜置6 min;再分別加入4%氫氧化鈉溶液400?μL，搖勻;最后用50%乙醇稀釋至刻度，靜置15 min。以試劑空白為空白對照，利用酶標(biāo)儀于510 nm下測定各待測樣品的吸光度。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.0036x+0.0012，R2=0.9934，根據(jù)回歸方程計算出樣品提取液黃酮類化合物濃度。

1.2.4 ?原花青素含量測定 ?原花青素含量測定采用正丁醇-鹽酸法，在董瑞霞等[18]的方法上進(jìn)行改動，采用超聲波-乙醇提取法對刺葡萄愈傷組織的原花青素進(jìn)行提取，原花青素提取液反應(yīng)后于546 nm處測定其吸光值。以原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（UV≥95%）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.0063x + 0.0158，R2=0.9937，根據(jù)回歸方程計算出樣品提取液原花青素濃度;然后根據(jù)公式計算原花青素含量：

原花青素含量=（CV/W）×10式中，C為樣品花色苷提取液的濃度（μg/mL）;V為反應(yīng)液體積（mL）;10為提取液總體積與反應(yīng)液體積的比值;W為提取時所用的細(xì)胞鮮重（g）。

1.2.5 ?花色苷含量測定 ?參考馬志本等[19]的方法，并適當(dāng)改進(jìn)。采用超聲波-乙醇甲酸提取法對刺葡萄愈傷組織細(xì)胞中花色苷進(jìn)行提取。以定溶劑做空白調(diào)零，于酶標(biāo)儀中測定波長530、620、650?nm下的吸光值，用Greey公式準(zhǔn)確計算出花色苷的吸光值：

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用DPS對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，使用Excel 2010作圖。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同濃度ALA對刺葡萄愈傷組織生物量的影響

刺葡萄愈傷組織在不同濃度ALA培養(yǎng)基中生物量的變化情況見圖1。由圖1可以看出，隨ALA濃度增加，其對刺葡萄愈傷組織生物量增長總體的變化趨勢是先增加后略微下降，再增加后迅速下降，直至愈傷組織褐變死亡。從圖1還可以看出，ALA處理濃度在0～1.0 mg/L時，與對照相比能顯著促進(jìn)刺葡萄愈傷組織的生長，同時培養(yǎng)早期（25 d）、中期（35 d）中濃度ALA（0.5 mg/L和1.0 mg/L）更有利于刺葡萄愈傷組織生物量的增加，25?d時，刺葡萄愈傷組織生物量分別為11.75 g和11.26 g，是對照（ALA濃度0 mg/L）的1.26倍和1.21倍;35 d時，生物量分別為13.33?g和13.40 g，是對照的1.25倍和1.26倍。而在培不同小寫字母表示同一時間不同ALA濃度處理的樣品差異顯著（P<0.05）。

養(yǎng)后期（45 d）低濃度ALA（0.05 mg/L）更有利于刺葡萄愈傷組織生物量的增長，生物量為15.32?g，是對照的1.11倍;ALA濃度達(dá)到或超過2.0?mg/L，與對照相比會顯著抑制愈傷組織的生長，培養(yǎng)中能明顯觀察到愈傷組織出現(xiàn)褐變和水漬狀，并且這種情況會隨ALA濃度的增大而迅速增多;ALA濃度達(dá)到4.0 mg/L及以上時，對刺葡萄愈傷組織致死率達(dá)到100%。以上分析表明，若僅考慮刺葡萄愈傷組織生物量，采用不同ALA處理刺葡萄愈傷組織時，短中期培養(yǎng)以0.5?mg/L的使用濃度較為合適，如果是較長時間培養(yǎng)，則以低濃度0.05?mg/L較為宜。由于高濃度ALA（2.0?mg/L及以上）會強(qiáng)烈抑制刺葡萄愈傷組織生長，并最終致死，所以后續(xù)分析選用ALA處理濃度為0～1.0 mg/L。

2.2 ?不同濃度ALA處理對刺葡萄愈傷組織黃酮類化合物含量的影響

2.2.1 ?刺葡萄愈傷組織細(xì)胞中黃酮類化合物含量變化 ?刺葡萄愈傷組織在不同ALA濃度下培養(yǎng)，細(xì)胞中黃酮類化合物含量變化情況見圖2。從培養(yǎng)時間看，相同ALA濃度下，刺葡萄愈傷組織細(xì)胞中黃酮類化合物含量隨培養(yǎng)時間延長而不斷增加。從不同ALA處理濃度看，與對照（ALA濃度0?mg/L）相比，低濃度ALA能較明顯地促進(jìn)刺葡萄愈傷組織細(xì)胞中黃酮類化合物的生物合成，在早期培養(yǎng)階段（25?d），ALA處理濃度為不同小寫字母表示同一時間不同ALA濃度處理的樣品差異顯著（P<0.05）。0.05、0.1、0.25 mg/L時，黃酮類化合物含量分別為148.45、150.53、135.64 μg/g，對照黃酮類化合物含量為124.64 μg/g，其他處理濃度黃酮類化合物含量均略低于對照;在培養(yǎng)的中、后期（35?d和45 d），0.05 mg/L ALA處理的刺葡萄愈傷組織細(xì)胞中黃酮類化合物含量均高于對照，培養(yǎng)35?d時為202.72 μg/g，45 d為272.48 μg/g，對照則分別為196.57、250.64 μg/g，其他ALA處理濃度低于或略低于對照。由此可見，僅從刺葡萄愈傷組織細(xì)胞中黃酮類化合物含量考察，以ALA處理濃度為0.05 mg/L為佳。

2.2.2 ?刺葡萄愈傷組織黃酮類化合物產(chǎn)量的變化 ?將刺葡萄愈傷組織細(xì)胞中黃酮類化合物含量結(jié)合生物量考察黃酮化合物產(chǎn)量，結(jié)果見圖3。在刺葡萄愈傷組織培養(yǎng)早期（25?d），不同濃度ALA（0.05～1.00 mg/L）處理的愈傷組織黃酮類化合物產(chǎn)量均顯著高于對照（0 mg/L）。培養(yǎng)中期（35 d），除了ALA濃度為1.00 mg/L處理時黃酮類化合物產(chǎn)量顯著低于對照，其他處理黃酮類化合物產(chǎn)量雖略高于對照，但沒有達(dá)到顯著水平。培養(yǎng)后期（45?d），低濃度ALA（0.05?mg/L）處理下的刺葡萄愈傷組織黃酮類化合物產(chǎn)量顯著高于對照，達(dá)到4173.48 μg，對照為3448.81 μg，而其他濃度處理的黃酮類化合物產(chǎn)量略低于對比，但沒有達(dá)到顯著水平。這說明，在刺葡萄愈傷組織培養(yǎng)早期，在一定的ALA濃度范圍內(nèi)，ALA可顯著增加刺葡萄愈傷組織黃酮類化合物產(chǎn)量，但培養(yǎng)到中后期，尤其是培養(yǎng)后期，只有低濃度的ALA處不同小寫字母表示同一時間不同ALA濃度處理的樣品差異顯著（P<0.05）。理才能有效地增加葡萄愈傷組織黃酮類化合物產(chǎn)量，這可能與中高濃度ALA促進(jìn)細(xì)胞加速老化有關(guān)。從刺葡萄愈傷組織黃酮類化合物產(chǎn)量看，ALA濃度以0.05 mg/L為佳。

2.3 ?不同ALA濃度處理對刺葡萄愈傷組織花色苷含量的影響

2.3.1 ?刺葡萄愈傷組織細(xì)胞中花色苷含量的變化 ?將刺葡萄愈傷組織在附加不同濃度ALA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，刺葡萄愈傷組織細(xì)胞中花色苷含量變化情況見圖4。在刺葡萄愈傷組織培養(yǎng)早期（25?d），與對照相比，中低濃度ALA（0.05、0.10、0.25 mg/L）處理能顯著提高刺葡萄愈傷組織細(xì)胞中花色苷含量，其中濃度0.25 mg/L ALA處理后的花色苷含量最高，為87.70 μg/g;較高濃度ALA（0.50、1.00?mg/L）處理與對照差異不顯著。在培養(yǎng)的中期（35?d），不同濃度ALA處理及對照的刺葡萄愈傷組織細(xì)胞中花色苷含量均達(dá)到3個培養(yǎng)階段的最高值;同時，中低濃度ALA處理的細(xì)胞中花色苷含量均略高于對照，分別為107.24、110.77、112.07 μg/g，但與對照（101.07?μg/g）相比，差異不顯著;較高濃度ALA處理則顯著低于對照。在培養(yǎng)后期（45?d），不同濃度ALA處理及對照細(xì)胞中花色苷含量與35 d對比都不同程度的下降;中低濃度ALA處理細(xì)胞中花色苷含量與對照相比差異不顯著，但都顯著高于較高濃度ALA處理。以上分析表明，培養(yǎng)早期，適當(dāng)濃度不同小寫字母表示同一時間不同ALA濃度處理的樣品差異顯著（P<0.05）。

花色苷含量的變化的ALA（0.05～0.25?mg/L）處理，能顯著促進(jìn)刺葡萄細(xì)胞中花色苷的合成;刺葡萄愈傷組織培養(yǎng)中期，ALA處理對其花色苷合成的促進(jìn)作用不明顯;培養(yǎng)后期，低濃度的ALA（0.05?mg/L）處理與其他處理濃度相比，能有效的延緩刺葡萄細(xì)胞中花色苷含量的下降。

2.3.2 ?刺葡萄愈傷組織花色苷產(chǎn)量的變化 ?將刺葡萄愈傷組織細(xì)胞花色苷含量結(jié)合生物量進(jìn)行考察，獲得刺葡萄愈傷組織花色苷產(chǎn)量，結(jié)果見圖5。在刺葡萄愈傷組織培養(yǎng)早期（25?d），不同濃度ALA處理的刺葡萄愈傷組織花色苷產(chǎn)量均顯著高于對照，并且中低濃度ALA（0.05、0.10、0.25 mg/L）處理的花色苷產(chǎn)量顯著高于較高濃度ALA（0.50、1.00 mg/L）處理。培養(yǎng)中期35 d時，中濃度ALA（0.10、0.25 mg/L）處理的刺葡萄愈傷組織花色苷產(chǎn)量分別為1412.69、1408.35 μg，顯著高于對照及較高濃度ALA處理，而與低濃度ALA（0.05 mg/L）處理差異不明顯。培養(yǎng)后期45?d時，低濃度ALA處理和對照刺葡萄愈傷組織花色苷產(chǎn)量比35?d時有較大幅度增加，而中高濃度ALA處理的卻呈現(xiàn)一定幅度的下降，此時期產(chǎn)量最高的為ALA 0.05?mg/L處理的刺葡萄愈傷組織，為1561.94?μg，顯著高于對照及中高濃度ALA處理。以上分析表明，若考慮刺葡萄愈傷組織花色苷產(chǎn)量和培養(yǎng)時間，短中期培養(yǎng)（25?d或35?d）以中低濃度ALA處理為佳，而較長時間培養(yǎng)（45?d）則以低濃度ALA處理為宜。

不同小寫字母表示同一時間不同ALA濃度處理的樣品差異顯著（P<0.05）。

2.4 ?不同ALA濃度處理對刺葡萄愈傷組織原花青素含量的影響

2.4.1 ?刺葡萄愈傷組織細(xì)胞中原花青素含量的變化 ?將刺葡萄愈傷組織培養(yǎng)于附加不同濃度ALA的培養(yǎng)基中，細(xì)胞中原花青素含量變化情況見圖6。刺葡萄愈傷組織培養(yǎng)至25 d時（早期），0.05 mg/L和0.10 mg/L ALA處理的細(xì)胞中原花青素含量略高于對照且與對照相比差異不顯著，但顯著高于其他ALA濃度處理。培養(yǎng)至中期35 d，0.05 mg/L濃度ALA處理的刺葡萄細(xì)胞中原花青素含量與對照相比無顯著差異，但顯著高于其他濃度ALA處理，此時0.05 mg/L濃度ALA處理的原花青素含量為950.26 μg/g。培養(yǎng)到后期45 d時，0.05 mg/L ALA處理的刺葡萄愈傷組織細(xì)胞中原花青素含量顯著高于對照，含量為1630.16?μg/g，其他濃度ALA處理的顯著低于對照。分析結(jié)果表明，低濃度ALA（0.05 mg/L）有利于刺葡萄愈傷組織原花青素的合成。

2.4.2 ?刺葡萄愈傷組織原花青素產(chǎn)量的變化 ?刺葡萄愈傷組織細(xì)胞中原花青素含量結(jié)合愈傷組織生物量來考察其原花青素產(chǎn)量，結(jié)果見圖7。刺葡萄愈傷組織培養(yǎng)早中晚期，不同濃度ALA處理變化趨勢與刺葡萄愈傷組織細(xì)胞中原花青素含量變化高度一致。培養(yǎng)中期（35?d），低濃度ALA（0.05?mg/L）處理的原花青素產(chǎn)量為11821.27?μg，顯著高于對照和其他濃度ALA處理。培養(yǎng)后期（45?d），低濃度ALA（0.05?mg/L）處理的原花青素產(chǎn)量高達(dá)24968.62?μg，顯著高于對照（17516.66?μg），其他濃度ALA處理均顯著低于對照。這說明低濃度ALA（0.05 mg/L）能有效地增加刺葡萄愈傷組織原花青素產(chǎn)量。

3 ?討論

植物仍然是許多重要天然活性物質(zhì)的主要來源，現(xiàn)代天然活性藥物成分有25%～28%來源于高等植物，尤其是抗癌藥物有60%直接或間接來源于植物[20]。雖然植物細(xì)胞培養(yǎng)是獲取植物天然活性物質(zhì)的可行手段，但真正通過植物細(xì)胞培養(yǎng)獲取植物天然活性物質(zhì)并商業(yè)化應(yīng)用的并不多，主要有花青素、熊果苷、黃連素、甜菜紅素、紫錐菊多糖、香葉醇、皂苷、紫杉醇等[21]。許多植物的細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模還達(dá)不到商業(yè)化應(yīng)用的要求，主要原因在于這些植物細(xì)胞產(chǎn)生的天然活性產(chǎn)物含量低且不穩(wěn)定，為了克服這些問題，研究人員通常采用添加誘導(dǎo)子來定向調(diào)控植物細(xì)胞培養(yǎng)物中的天然活性物質(zhì)含量，并保證細(xì)胞持續(xù)穩(wěn)定高產(chǎn)，取得了良好的效果[22]。本研究發(fā)現(xiàn)ALA作為誘導(dǎo)子，可有效的定向調(diào)控刺葡萄愈傷組織主要抗氧化生物活性物質(zhì)的合成，如黃酮類化合物、花色苷和原花青素等。ALA作為誘導(dǎo)子調(diào)控刺葡萄主要抗氧化生物活性物質(zhì)合成有兩個方面，一方面，ALA作為一種激素類物質(zhì)，低濃度下能促進(jìn)刺葡萄細(xì)胞增殖，顯著增加刺葡萄細(xì)胞培養(yǎng)物的生物量;這在其他作物上有類似的報道，如黃瓜[23]、水稻[24]、花椰菜[25]、草莓[26]和蘋果[27]等作物施用ALA后可促進(jìn)植物光合作用、枝葉和果實(shí)生長、增加生物量，同時ALA還可以增加植物生物活性物質(zhì)含量[28-29];在植物細(xì)胞培養(yǎng)方面，研究表明ALA可促進(jìn)紫杉[15]、海帶孢子體[30]和蘋果[31]愈傷組織的生長和增殖。另一方面，合適濃度的ALA能增強(qiáng)刺葡萄細(xì)胞花色苷和原花青素等生物活性物質(zhì)的合成能力，當(dāng)ALA濃度在0.05?mg/L時，類黃酮、原花青素和花色苷的積累量達(dá)到最大;類似的情況也出現(xiàn)在其他作物上，蘋果著色研究發(fā)現(xiàn)，采收前噴施ALA，能夠促進(jìn)果實(shí)著色[32]，同時無論是大田或是離體的蘋果，ALA都能顯著促進(jìn)果皮花青素積累[33]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，不同濃度ALA處理和不同培養(yǎng)階段對刺葡萄愈傷組織次生代謝產(chǎn)物的積累具有顯著影響。ALA處理濃度過高，會顯著抑制刺葡萄愈傷組織生長，并最終導(dǎo)致褐變死亡;同時，刺葡萄愈傷組織主要抗氧化生物活性物質(zhì)也會隨培養(yǎng)時間延長而較大幅度增加，不同ALA濃度處理增加的幅度存在顯著差異。研究結(jié)果表明，ALA濃度為0.05?mg/L時，對主要抗氧化生物活性物質(zhì)花色苷、原花青素和黃酮類化合物等的促進(jìn)效果最佳，但在0～0.05?mg/L之間ALA濃度還存在研究空白，在后續(xù)的研究中，將進(jìn)一步考察該ALA濃度范圍對刺葡萄細(xì)胞生長和主要抗氧化生物活性物質(zhì)合成的影響。本研究結(jié)果為刺葡萄愈傷組織花色苷等次生代謝產(chǎn)物的積累及葡萄果實(shí)色澤調(diào)控提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)支撐，具有重要的理論意義和實(shí)踐價值。

參考文獻(xiàn)

Meng J F， Fang Y L， Qin M Y， et al. Varietal differences among the phenolic profiles and antioxidant properties of four cultivars of spine grape （Vitis davidii Foex.） in Chongyi County （China）[J]. Food Chemistry. 2012， 134（4）： 2049-2056.

Han F， Ju Y， Ruan X， et al. Color， anthocyanin， and antioxidant characteristics of young wines produced from spine grapes （Vitisdavidii Foex.） in China[J]. Food & Nutrition Research， 2017， 61（1）： 1339552.

Ochoa-Villarreal M， Howat S， Hong S， et al. Plant cell culture strategies for the production of natural products[J]. BMB Reports， 2016， 49（3）： 149-158.

Zhang W， Furusaki S. Production of anthocyanins by plant cell cultures[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering， 1999， 4（4）： 231-252.

Ananga A， Georgiev V， Ochieng J， et al. Production of anthocyanins in grape cell cultures： a potential source of raw material for pharmaceutical， food， and cosmetic industries[M]//Poljuha D， Sladonja B. The mediterranean genetic code - grapevine and olive. 2013： 247-287.

Watanabe K， Nishihara E， Watanabe S， et al. Enhancement of growth and fruit maturity in 2-year-old grapevines cv. Delaware by 5-aminolevulinic acid[J]. Plant Growth Regulation， 2006， 49（1）： 35-42.

張夢燕， 孫軍利， 趙寶龍， 等. 外源ALA對葡萄果實(shí)品質(zhì)及PAL活性的影響[J]. 中外葡萄與葡萄酒， 2017（3）： 16-19.

張夢燕， 孫軍利， 趙寶龍. 外源ALA對克瑞森無核葡萄葉片光合特性及果實(shí)品質(zhì)的影響[J]. 西北植物學(xué)報， 2018， 38（3）： 493-500.

趙寶龍， 劉 ?鵬， 王文靜， 等. 5-氨基乙酰丙酸（ALA）對鹽脅迫下葡萄葉片中AsA-GSH循環(huán)的影響[J]. 植物生理學(xué)報， 2015， 51 （3）： 385-390.

Wu Y， Liao W， Dawuda M M， et al. 5-Aminolevulinic acid （ALA） biosynthetic and metabolic pathways and its role in higher plants： A review[J]. Plant Growth Regulation， 2019， 87： 357-374.

Zhao A， Zhai M. Production of 5-aminolevulinic acid from glutamate by overexpressing HemA1 and pgr7 from Arabidopsis thaliana in Escherichia coli[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology， 2019， 35： 175.

Akram N A， Ashraf M. Regulation in plant stress tolerance by a potential plant growth regulator， 5-aminolevulinic acid[J]. Journal of Plant Growth Regulation， 2013， 32（3）： 663-679.

謝 ?荔， 成學(xué)慧， 馮新新， 等. 氨基酸肥料對‘夏黑葡萄葉片光合特性與果實(shí)品質(zhì)的影響[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2013， 36（2）： 31-37.

Bindu R C， Vivekanandan M. Hormonal activities of 5-aminolevulinic acid in callus induction and micropropagation[J]. Plant Growth Regulation， 1998， 26（1）： 15-18.

Yamamoto S， Hayashi S， Furusaki S， et al. 5-Aminolevulinic acid promotes callus growth and paclitaxel production in light-grown Taxus cuspidata suspension cultures[J]. Engineering in Life Sciences， 2015， 15（1）： 116- 121.

賴呈純， 范麗華， 黃賢貴， 等. 刺葡萄幼胚愈傷組織誘導(dǎo)及其高產(chǎn)原花青素細(xì)胞系篩選[J]. 植物生理學(xué)報， 2014， 50 （11）： 1683-1691.

周丹蓉， 方智振， 廖汝玉， 等. 李果皮花色素苷、類黃酮和類胡蘿卜素含量及抗氧化性研究[J]. 營養(yǎng)學(xué)報， 2013， 35（6）： 571-576.

董瑞霞， 李立祥， 王 ?茜， 等. 植物中原花青素含量測定[J]. 茶業(yè)通報， 2008， （2）： 67-69.

馬志本， 程玉娥. 關(guān)于蘋果果實(shí)表面花青素含量的化學(xué)測定方法[J]. 中國果樹， 1984， （4）： 49-51.

Gon?alves S and Romano A. Production of plant secondary metabolites by using biotechnological tools [M]//Vijayakumar R， Raja S S S. Secondary metabolites-sources and applications. 2018： 81-99.

Espinosa Leal C A， Puente Garza C A， García Lara S. In vitro plant tissue culture： means for production of biological active compounds[J]. Planta， 2018， 248： 1-18.

Wang J， Li J， Li J， et al. Production of active compounds in medicinal plants： From plant tissue culture to biosynthesis[J]. Chinese Herbal Medicines， 2017， 9（2）： 115-125.

Anwar A， Yan Y， Liu Y， et al. 5-Aminolevulinic acid improves nutrient uptake and endogenous hormone accumulation， enhancing low-temperature stress tolerance in cucumbers[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2018， 19（11）： 3379.

Nunkaew T， Kantachote D， Kanzaki H， et al. Effects of 5-aminolevulinic acid （ALA）-containing supernatants from selected Rhodopseudomonas palustris strains on rice growth under NaCl stress， with mediating effects on chlorophyll， photosynthetic electron transport and antioxidative enzymes [J]. Electronic Journal of Biotechnology， 2014， 17（1）： 19-26.

Ahmad R， Ali S， Hannan F， et al. Promotive role of 5-aminolevulinic acid on chromium-induced morphological， photosynthetic， and oxidative changes in cauliflower （Brassica oleracea botrytis L.）[J]. Environmental Science and Pollution Research， 2017， 24： 8814-8824.

Sun Y P， Liu J， Cao R X， et al. Effects of 5-aminolevulinic acid treatment on photosynthesis of strawberry[J]. Photosynthetica， 2017， 55（2）： 276-284.

Zheng J， An Y Y， Feng X X， et al. Rhizospheric application with 5-aminolevulinic acid improves coloration and quality in ‘Fuji apples[J]. Scientia Horticulturae， 2017， 224： 74-83.

Liu L， Xiong L， An Y， et al. Flavonols induced by 5-aminolevulinic acid are involved in regulation of stomatal opening in apple leaves[J]. Horticultural Plant Journal， 2016， 2（6）： 323-330.

An Y， Feng X， Liu L， et al. ALA-induced flavonols accumulation in guard cells is involved in scavenging H2O2 and inhibiting stomatal closure in Arabidopsis cotyledons[J]. Frontiers in Plant Science， 2016， 7： 1713.

Tabuchi K， Mizuta H， Yasui H. Promotion of callus propagation by 5-aminolevulinic acid in a Laminaria japonica sporophyte[J]. Aquaculture Research， 2009， 41： 1-10.

Zheng J， An Y， Wang L. 24-Epibrassinolide enhances ALA-induced anthocyanin and flavonol accumulation in calli of ‘Fuji apple flesh[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2018， 134： 319-330.

汪良駒， 王中華， 李志強(qiáng)， 等. 5-氨基乙酰丙酸促進(jìn)蘋果果實(shí)著色的效應(yīng)[J]. 果樹學(xué)報， 2004（6）： 512-515.

王中華， 湯國輝， 李志強(qiáng)， 等. 5-氨基乙酰丙酸和金雀異黃素促進(jìn)蘋果果皮花青素形成的效應(yīng)[J]. 園藝學(xué)報， 2006（5）： 1055-1058.

責(zé)任編輯：崔麗虹