香蕉TGA轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定及枯萎病菌脅迫下的表達分析

林萍 王明元 李雨晴 劉建福, 張華英 林思鍛

摘 ?要：尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. Cubense， Foc）引起的香蕉枯萎病是我國香蕉的主要病害之一，嚴(yán)重影響香蕉的產(chǎn)量和品質(zhì)。TGA防御反應(yīng)基因在香蕉應(yīng)對尖孢鐮刀菌脅迫的應(yīng)答轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中至關(guān)重要。本研究以擬南芥TGA轉(zhuǎn)錄因子家族成員蛋白為查詢序列，在香蕉基因組數(shù)據(jù)庫中Blast篩選出TGA轉(zhuǎn)錄因子家族成員，并對該家族成員進行生物信息學(xué)分析。共鑒定得到9個香蕉TGA家族成員，分別命名為MaTGA1～MaTGA9;香蕉TGA家族蛋白富含酸性氨基酸，大部分蛋白以α螺旋為主;亞細(xì)胞定位主要在細(xì)胞核內(nèi)。進化樹分析表明，香蕉MaTGA轉(zhuǎn)錄因子家族的9個成員可分為Class Ⅰ和Class Ⅱ兩類，基因結(jié)構(gòu)及功能結(jié)構(gòu)域的分布情況也呈現(xiàn)出高度一致。進一步通過RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)，MaTGA2、MaTGA3和MaTGA8在香蕉枯萎病菌侵染后的‘威廉斯（易感病）及‘南天黃（抗?。┲芯@著下調(diào)表達，MaTGA1、MaTGA6、MaTGA7和MaTGA9均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢;然而MaTGA4和MaTGA5僅在‘威廉斯中上調(diào)表達，以上結(jié)果表明MaTGA2、MaTGA3和MaTGA8在香蕉抗枯萎病中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。本研究結(jié)果為香蕉TGA轉(zhuǎn)錄因子功能挖掘奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：香蕉;TGA轉(zhuǎn)錄因子;生物信息學(xué)分析;基因表達分析

Abstract： Banana fusarium wilt， caused by Fusarium oxysporum f. sp. Cubense （Foc）， is one of the major diseases in banana-producing areas in China， seriously affects the yield and quality of bananas. The transcription and its regulation of the TGA defense response gene is a crucial role in banana responses to the challenge of Fusarium oxysporum stress. In this study， using the TGA transcription factor family members protein sequences from Arabidopsis as the query， the banana TGA transcription factor family members were blasted in the banana genome database and analyzed using bioinformatics analysis. A total of 9 family members were identified， named as MaTGA1～ MaTGA9. TGA family proteins of banana was rich in acidic amino acids， and most of the proteins were alpha helices. The subcellular location was mainly in the nucleus. The nine MaTGA transcription factor members could be classified into two groups， Class Ⅰ and Class Ⅱ， by phylogenetic tree analysis. The distribution of gene structure and functional domains also showed a high degree of consistency. The RT-qPCR analysis showed that MaTGA2， MaTGA3， and MaTGA8 were significantly down-regulated both in Williams （susceptible） and Nantianhuang （disease-resistant） after Foc infection， and the gene espression of MaTGA1， MaTGA6， MaTGA7 and MaTGA9 declined first and then rose， however MaTGA4 and MaTGA5 were only up-regulated in William， indicating that MaTGA2， MaTGA3， and MaTGA8 played important biological functions in banana resistance to wilt. The results of this study would lay a theoretical foundation for the function excavation of banana TGA transcription factors.

Keywords： banana （Musa spp.）; TGA transcription factor; gioinformatic analysis; gene expression analysis

香蕉（Musa spp.）與柑橘、葡萄、蘋果共同被聯(lián)合國糧農(nóng)組織列為世界四大水果。但近年來，香蕉枯萎病在世界大部分的種植區(qū)域爆發(fā)，導(dǎo)致香蕉種植面積急劇減少，香蕉市場受到嚴(yán)重打擊[1-2]，因此探究香蕉枯萎病防御反應(yīng)的分子機理對于枯萎病的防治意義重大。

TGA轉(zhuǎn)錄因子是bZIP（basic leucine zipper，bZIP）家族的D亞族[3]，能夠特異性識別并結(jié)合TGACG為核心的激活序列（activation sequence， as-1），調(diào)節(jié)下游靶標(biāo)基因的表達，在調(diào)節(jié)植株抗性及花器官發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[4]。研究表明as-1是PR-1中啟動子的順式作用元件，而水楊酸（salicylic acid， SA）介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中病程相關(guān)基因NPR1可以增強TGA與PR的結(jié)合，提高植物抗病能力[5]。因此植物受到病害時SA積累，NPR1解聚成單體在細(xì)胞核內(nèi)與TGA因子相互作用，促進PR基因的表達，提高植物的抗病性[6-7]。

自TGA轉(zhuǎn)錄因子首次在煙草發(fā)現(xiàn)后，擬南芥中分離鑒定出10個TGA轉(zhuǎn)錄因子，可分為5類：第Ⅰ類AtTGA1和AtTGA4、第Ⅱ類AtTGA2、AtTGA5、AtTGA6、第Ⅲ類AtTGA3和AtTGA7、第Ⅳ類AtTGA9和AtTGA10、第Ⅴ類AtPAN[8]。其中AtTGA1-AtTGA7基因廣泛參與植物抗病反應(yīng)引起的基礎(chǔ)抗性和系統(tǒng)獲得抗性（Systemic Acquired Resistance， SAR）[9-10]。隨后，在水稻[11]、蘋果[12]、小麥[13]等多種植物中發(fā)現(xiàn)TGA轉(zhuǎn)錄因子家族。研究發(fā)現(xiàn)蘋果中MdTGA2.1、水稻中rTGA2.1、rTGA2.2、rTGA2.3、煙草中TGA2.2等轉(zhuǎn)錄因子均能與擬南芥中的NPR1相互作用，說明不同物種TGA成員均能夠啟動植物抗病性[14]。到目前為止，香蕉中TGA轉(zhuǎn)錄因子家族的研究尚未見報道。因此，本研究基于香蕉基因組數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學(xué)技術(shù)系統(tǒng)分析香蕉TGA轉(zhuǎn)錄因子家族成員，并進一步研究其在枯萎病菌脅迫下的表達分析，為闡明TGA轉(zhuǎn)錄因子參與香蕉枯萎病防御反應(yīng)的分子機理提供理論依據(jù)，為植物的抗性育種提供技術(shù)支撐。

1 ?材料與方法

1.1 ?香蕉TGA轉(zhuǎn)錄因子家族序列檢索

以擬南芥TGA轉(zhuǎn)錄因子成員蛋白序列為查詢序列，在香蕉基因組數(shù)據(jù)庫（https：//banana-genome- hub.southgreen.fr/）中進行Blastp同源序列比對，E值≤1×10–5。搜索并獲得香蕉所有TGA轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)序列，以進行后續(xù)生物信息學(xué)分析。

1.2 ?香蕉TGA轉(zhuǎn)錄因子生物信息學(xué)分析

使用在線軟件ExPASy（https：//web.expasy.org/ protparam/），分析所有成員基因所編碼蛋白質(zhì)的基本特性;運用Gene Structure Display Server（GSDS）網(wǎng)站（http：//gsds. cbi.pku.edu.cn/）分析成員基因內(nèi)含子/外顯子數(shù)量分布;采用鄰接法通過MEGA 7軟件構(gòu)建所有成員基因種內(nèi)進化樹;利用SMART網(wǎng)站（http：//smart.embl- heidelberg.de/）進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測;利用PRABI網(wǎng)站中SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi- bin/secpred_sopma.pl）分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，包括α螺旋、延伸鏈、β折疊和無規(guī)卷曲;利用SWISS-MODEL網(wǎng)站（https：//swissmodel.expasy.org/）進行蛋白三維結(jié)構(gòu)同源建模分析;采用在線網(wǎng)站（http：//www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測成員的蛋白信號肽;使用在線網(wǎng)站（http：//www. cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/）預(yù)測成員跨膜結(jié)構(gòu);以在線網(wǎng)站MBC（https：//cello.life.nctu.edu.tw/）對所有成員基因進行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.3 ?香蕉TGA蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建及多序列比對

使用在線Phytozome（https：//phytozome.jgi. doe.gov/pz/portal.html）網(wǎng)站，以TGA為關(guān)鍵詞搜索其他物種的TGA蛋白，下載不同植物所有TGA家族成員的氨基酸序列。與水稻和擬南芥的TGA轉(zhuǎn)錄因子家族進行多序列比對，通過MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，采用鄰接法在默認(rèn)參數(shù)下生成系統(tǒng)發(fā)育樹[15]。

1.4 ?香蕉‘威廉斯和‘南天黃TGA轉(zhuǎn)錄因子表達分析

易感香蕉枯萎病品種‘威廉斯和抗香蕉枯萎病品種‘南天黃由廣州石生源生物科技發(fā)展有限公司提供。選取健康、長勢一致的香蕉苗，采用蘸根接菌法將抗、感病品種的香蕉苗植株根系分別浸泡在配制好的Fusarium oxysporum f. sp. Cubense race 4（Foc TR4）孢子懸浮液（1×106孢子/mL）中2?h。取樣時間為接種Foc TR4后0、2、4、6?d，每個時間點分別取3株香蕉根系混合，迅速置于液氮中，–80?℃保存。

利用天根多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取上述香蕉根系樣品的總RNA，通過RNA的完整性、純度及濃度檢測后，將質(zhì)量符合要求的RNA利用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Takara）試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。最后利用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計定量引物，以香蕉Actin基因為內(nèi)參（引物序列如表1），反應(yīng)程序為95?℃ 30?s;95?℃ 5?s，55?℃ 30?s，72?℃ 30?s，40個循環(huán)，每個反應(yīng)重復(fù)3次。

1.5 ?數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)由Excel 2010軟件和SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析，對同一處理隨時間變化的差異性采用LSD（Least Significant Difference）多重比較分析，利用Excel 2010軟件繪圖。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?香蕉TGA轉(zhuǎn)錄因子家族成員的鑒定與分析

本研究使用擬南芥TGA轉(zhuǎn)錄因子家族的序列作為參照序列，在香蕉中共鑒定得到9個TGA轉(zhuǎn)錄因子家族成員（表2）。9個TGA基因主要定位在香蕉的Chr.02、Chr.03、Chr.04、Chr.05、Chr.07、Chr.08和Chr.11染色體上，將它們命名為MaTGA1～MaTGA9。香蕉MaTGA轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸殘基數(shù)在261～499 aa之間，分子質(zhì)量（MW）在29.60～54.93?kD之間;蛋白等電點（pI）為5.22～8.87之間，7個成員在酸性范圍內(nèi)，表明該家族蛋白富含酸性氨基酸。利用MBC分析預(yù)測香蕉MaTGA轉(zhuǎn)錄因子家族成員蛋白的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)MaTGA5定位于細(xì)胞外，其余MaTGA成員定位于細(xì)胞核。

MaTGA轉(zhuǎn)錄因子家族成員種內(nèi)進化樹結(jié)果將轉(zhuǎn)錄因子分為2大類（圖1）。GSDS分析基因結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，MaTGA1～MaTGA9中MaTGA3、MaTGA5不含有內(nèi)含子;MaTGA6、MaTGA7成員含有7個內(nèi)含子，MaTGA4含有8個內(nèi)含子，MaTGA8含有10個內(nèi)含子;MaTGA1、MaTGA2、MaTGA9成員含有11個內(nèi)含子（圖2）。

通過SMART網(wǎng)站對香蕉的TGA轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白功能結(jié)構(gòu)域進行分析，發(fā)現(xiàn)香蕉MaTGA成員蛋白均具有DOG1結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包括TGA蛋白和PERIANTHIA蛋白;MaTGA3和MaTGA5蛋白中無bZIP結(jié)構(gòu)域，其余成員都含有bZIP結(jié)構(gòu)域，bZIP結(jié)構(gòu)域中包含介導(dǎo)序列特異性DNA結(jié)合的堿性區(qū)域和二聚化所需的亮氨酸拉鏈區(qū)域的蛋白質(zhì)（圖3）。

運用SOPMA進行蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示MaTGA家族主要由α螺旋、延伸鏈、β折疊和無規(guī)卷曲組成（圖4）。

2.2 ?多序列比對及種間進化樹分析

將擬南芥（10個）AtTGA家族成員、水稻（15個）OsbZIP家族成員和香蕉（9個）MaTGA家族成員蛋白構(gòu)建進化樹，發(fā)現(xiàn)香蕉MaTGA家族種間進化樹可分為Class Ⅰ、Class Ⅱ 2類（圖5）。Class Ⅰ分為a、b兩個亞支，Class Ⅰa中有4個香蕉TGA成員（MaTGA1、MaTGA2、MaTGA8、MaTGA9）、6個擬南芥TGA成員和13個水稻TGA成員;Class Ⅰb中有3個香蕉TGA成員（MaTGA4、MaTGA6、MaTGA7）、4個擬南芥TGA成員和2個水稻TGA成員;Class Ⅱ亞支有MaTGA3、MaTGA5兩個成員，該亞支與水稻和擬南芥沒有同源基因。比較三個物種的遺傳關(guān)系，發(fā)現(xiàn)香蕉TGA轉(zhuǎn)錄因子與同為單子葉植物的水稻TGA轉(zhuǎn)錄因子遺傳關(guān)系更為相近。

多序列比對結(jié)果顯示，TGA轉(zhuǎn)錄因子家族中重要的bZIP和DOG1結(jié)構(gòu)域、氨基酸殘基在不同物種間高度保守（圖6）。其中bZIP結(jié)構(gòu)域，一部分由14個氨基酸殘基組成保守的DNA結(jié)合位點，即堿性區(qū)域，該區(qū)域C-端具有核定位信號（nuclear localization signals，NLS）;一部分是參與形成二聚體的亮氨酸拉鏈區(qū)域，其N-末端的堿性區(qū)域與堿性區(qū)域緊密結(jié)合。

2.3 ?TGA轉(zhuǎn)錄因子家族成員在香蕉‘威廉斯及‘南天黃表達分析

為確定香蕉中TGA轉(zhuǎn)錄因子家族成員是否參與Foc TR4的脅迫，利用RT-qPCR檢測香蕉感、抗病品種在Foc TR4侵染不同時間后TGA轉(zhuǎn)錄因子家族成員的表達情況。結(jié)果表明，接種Foc TR4后，在感、抗病兩個香蕉品種中MaTGA2、MaTGA3及MaTGA8表達量顯著下調(diào)，而MaTGA4和MaTGA5在易感品種被誘導(dǎo)上調(diào)表達（圖7）。其中MaTGA4在威廉斯中的表達量呈上調(diào)趨勢，4 d時表達量最高，是0 d時（CK）的2.5倍。MaTGA5同MaTGA4，在易感品種威廉斯侵染Foc TR4 6 d時達最高，為0 d時（CK）表達量的3.7倍。感、抗品香蕉品種中的MaTGA2、MaTGA3及MaTGA8在Foc TR4侵染下被迅速誘導(dǎo)下調(diào)表達，與0?d時相比，表達量受到嚴(yán)重抑制。而MaTGA1、MaTGA6、MaTGA7及MaTGA9在感、抗病香蕉品種呈先降后上升的趨勢（圖7）。因此推測MaTGA2、MaTGA3及MaTGA8是介導(dǎo)香蕉抗枯萎病的關(guān)鍵基因。

3 ?討論

轉(zhuǎn)錄因子是與轉(zhuǎn)錄機制的其他成分相互作用的DNA結(jié)合蛋白，以募集或阻止RNA聚合酶進入基因啟動子[16]，在某些情況下，轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)多個基因的表達[17]。據(jù)報道研究最多的WRKY轉(zhuǎn)錄因子和MYB轉(zhuǎn)錄因子家族參與植物對病原體的防御[18-19]。此外，一些研究報道了含有堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域（bZIP）的轉(zhuǎn)錄因子，在植物中，調(diào)節(jié)基因以響應(yīng)非生物脅迫，種子成熟，花朵發(fā)育和病原體防御[20]。本文利用擬南芥TGA轉(zhuǎn)錄因子，首次在全基因組水平對香蕉TGA轉(zhuǎn)錄因子家族成員進行鑒定，獲得9個TGA轉(zhuǎn)錄因子成員。蛋白理化性質(zhì)表明香蕉TGA蛋白富含酸性氨基酸。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測和序列比對發(fā)現(xiàn)，MaTGA蛋白中DOG1結(jié)構(gòu)域和bZIP結(jié)構(gòu)域高度保守。研究表明，bZIP結(jié)構(gòu)域中堿性區(qū)域通過固定的核定位信號結(jié)構(gòu)N-X7-R/K-X9與DNA結(jié)合，從而決定DNA的特異性以及核定位作用[21];對MaTGA蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，分析表明所有蛋白均具有α螺旋、延伸鏈、β折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，且以α螺旋為主，三級結(jié)構(gòu)同源建模發(fā)現(xiàn)與bZIP典型三維結(jié)構(gòu)相似[22]。亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)香蕉TGA轉(zhuǎn)錄因子主要在細(xì)胞核內(nèi)，與其他植物TGA轉(zhuǎn)錄因子所報道的一致[23-24]，說明香蕉TGA轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用。

香蕉MaTGA轉(zhuǎn)錄因子家族在進化上分為ClassⅠ和ClassⅡ兩類，與基因結(jié)構(gòu)及DOG1和bZIP結(jié)構(gòu)域的分布高度一致，通過香蕉與擬南芥和水稻TGA蛋白進化關(guān)系遠近，推測香蕉TGA轉(zhuǎn)錄因子家族基因的生物學(xué)特性和功能。其中ClassⅠ分為a、b兩個小亞組，ClassⅠa分支中香蕉MaTGA1、MaTGA2、MaTGA8、MaTGA9成員與擬南芥AtTGA2、AtTGA5、AtTGA6、AtTGA9、AtTGA 10、AtPAN成員為同一分支。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中AtTGA2、AtTGA5、AtTGA6任一基因缺失，僅3個基因同時缺失則不誘導(dǎo)防御相關(guān)PR1基因表達，說明AtTGA2、AtTGA5、AtTGA6參與植物的抗性[10];AtTGA9、AtTGA10、AtPAN三個基因突變導(dǎo)致擬南芥花表型改變[25-26];因此，推測ClassⅠa分支的MaTGA1、MaTGA2、MaTGA8、MaTGA9轉(zhuǎn)錄因子依賴于NPR1抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提高植物抗病性，且與植物花器官發(fā)育有關(guān)。ClassⅠb分支中香蕉MaTGA4、MaTGA6、MaTGA7成員與擬南芥AtTGA1、AtTGA3、AtTGA4、AtTGA7成員為同一分支。AtTGA4與乙烯反應(yīng)因子（ERF）相互作用，進一步調(diào)控植物抗病反應(yīng)[27];AtTGA3與ARR2相互作用并在細(xì)胞分裂素（CTK）作用下與PR1啟動子結(jié)合提高植物抗病性[28];推測該分支上的MaTGA4、MaTGA6、MaTGA7轉(zhuǎn)錄因子既可依賴NPR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑又依賴其他抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)節(jié)植物抗病性。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，TGA轉(zhuǎn)錄因子在植物生物脅迫和非生物脅迫反應(yīng)中起重要作用[29-30]。草莓[31]中的FaTGA在白粉病侵染過程中，通過SA信號途徑響應(yīng)植物抗病;小麥[13]中TaTGA1對白粉菌脅迫亦有響應(yīng);黃瓜[32]中CsbZIP120遺傳轉(zhuǎn)化至擬南芥，過表達株系對灰霉菌抗性增強。本研究對香蕉TGA轉(zhuǎn)錄因子成員在感、抗病品種上的生物脅迫基因表達分析發(fā)現(xiàn)，接種Foc TR4后，不同時間下MaTGA轉(zhuǎn)錄因子成員在感、抗病香蕉品種的誘導(dǎo)表達響應(yīng)程度不同，表達差異明顯，如MaTGA4和MaTGA5，在威廉斯中被誘導(dǎo)上調(diào)表達，MaTGA2、MaTGA3及MaTGA8，在感、抗香蕉品種中相對表達量被下調(diào)最明顯。表明MaTGA2、MaTGA3及MaTGA8可能參與香蕉抗枯萎病過程，且在抗病過程中可能具有重要的負(fù)調(diào)控作用。本課題組將進一步深入挖掘關(guān)鍵TGA轉(zhuǎn)錄因子在香蕉枯萎病防御反應(yīng)過程的分子機制，為香蕉枯萎病的防治提供理論依據(jù)。

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