非生物脅迫對橡膠樹熱激轉錄因子家族成員表達的影響

李言 余文才 陸慶志 楊署光 田維敏

摘 ?要：熱激轉錄因子（heat shock transcription factor， Hsf）是一類重要的調節(jié)因子，能夠使植物響應多種逆境脅迫，賦予植物多種抗逆性。通過qPCR技術，分析了30個橡膠樹HbHsf家族成員在低溫脅迫下橡膠樹‘93-114和‘熱墾501葉片中的表達模式，結果顯示多個HbHsfs基因可被低溫誘導上調表達，尤其是HbHsfA4a、HbHsfA4d、HbHsfA9b、HbHsfC1a和HbHsfC1b在低溫脅迫下‘93-114葉片中的表達量顯著高于‘熱墾501。此外，HbHsfA4a和HbHsfA4d在干旱和髙鹽脅迫下顯著上調表達，HbHsfA9b在干旱條件下極顯著上調表達，HbHsfC1a和HbHsfC1b響應髙鹽脅迫上調表達。橡膠樹HbHsfs基因響應多種逆境交叉脅迫，暗示著基因功能的多樣性和復雜性。本研究為進一步解析Hsf家族成員的抗逆機理提供理論依據(jù)。

關鍵詞：巴西橡膠樹;熱激轉錄因子;非生物脅迫;低溫脅迫;干旱脅迫;髙鹽脅迫

Abstract： Heat shock transcription factor （HSF） is an important regulatory factor， which can response to multiple abiotic stresses and confers various tolerances to plants. Through qPCR， we analyzed the expression patterns of 30 members of the HbHsfs family in the leaves of rubber tree ‘93-114 and ‘Reken 501 under cold stress. The results showed that many HbHsf genes could be up-regulated by cold stress， especially the expressions of HbHsfA4a， HbHsfA4d， HbHsfA9b， HbHsfC1a and HbHsfC1b in the leaves of ‘93-114 were significantly higher than those in ‘Reken 501 under cold stress. In addition， HbHsfA4a and HbHsfA4d were up-regulated under drought and salt stress， HbHsfA9b was up-regulated under drought， and HbHsfC1a andHbHsfC1b were up-regulated in response to high salt stress. The HbHsf genes of rubber tree responded to multiple stresses， suggesting the functional diversity and complexity. It would provide a theoretical basis for further analysis of the stress resistance mechanism of the Hsf genes.

Keywords： Hevea brasiliensis Muell. Arg.; heat shock transcription factor; abiotic stresses; cold stress; drought stress; salt stress

熱激轉錄因子（heat shock transcription factor， HSF）在植物適應生物脅迫和非生物脅迫的過程中起著重要的調節(jié)作用，賦予植物多種抗逆性。熱激轉錄因子家族成員序列大小不一，但結構域比較保守，主要包含N端高度保守的DNA結合結構域（DNA-binding domain， DBD），它可識別并結合熱激元件（heat shock element， HSE）從而激活熱激蛋白（heat shock protien， HSP）基因的轉錄;依次是寡聚化結構域（oligomerization domain， OD），由2個疏水七肽重復區(qū)域（HR-A和HR-B）組成，并通過一段可變長度（15～80個氨基酸殘基）的柔性序列連接到DBD。該結構域可促進與HSP啟動子中HSE的結合，調控HSP的轉錄[1-2];接著是核定位信號（nuclear localization signal， NLS）和核輸出信號（nuclear export signal， NES），NLS是一簇堿性氨基酸區(qū)域，與進入細胞核有關。NLS和NES協(xié)同調控Hsfs在細胞核和細胞質中的分布;C端轉錄激活結構域（C-transcriptional activation domain， CTD）含有短肽AHA（aromatics， hydrophobic and acidic acid residues）基序，具有轉錄激活功能。根據(jù)Hsfs結構特點，將植物Hsfs分為3個主要亞家族（HsfsA、B和C）[1， 3]。橡膠樹Hsfs家族共30個成員，也分為HsfsA（18）、B（10）和C（2）[4]。Hsfs能夠識別熱激元件HSE（GAAnnTTC）并與之結合，從而激活下游基因如HSP的轉錄，響應生物脅迫和非生物脅迫。小麥熱激轉錄因子TaHsfA6f調控一系列下游基因（TaHsp16.8， 17， 17.3， TaGAAP， TaRof1）的轉錄，參與保護植物免受高溫損傷[5]。枇杷EjHsf1通過調節(jié)下游基因EjHSP的轉錄響應低溫脅迫[6]。擬南芥NPR1與HsfA1互作從而激活HsfA1參與低溫脅迫反應[7]。DREB2A能夠調控HsfA3的表達進而響應鹽脅迫和干旱脅迫[8]。HsfA4a亦能提高擬南芥的耐鹽性和耐氧化性[9]。植物Hsfs家族成員較多，結構復雜，功能多樣，響應于多種逆境交叉脅迫，是一類理想的遺傳改良候選基因。

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）是重要的熱帶經(jīng)濟作物，原產(chǎn)于亞馬遜河流域。目前，已大規(guī)模種植于南亞或東南亞以及赤道附近南北緯度10之間的熱帶地區(qū)，該地區(qū)屬于傳統(tǒng)植膠區(qū)，無低溫侵襲，且雨水充足。我國的橡膠樹種植區(qū)位于熱帶北緣，屬于非傳統(tǒng)植膠區(qū)，經(jīng)常遭遇寒潮侵襲，以及干旱危害。選育高產(chǎn)抗逆品種是保障我國天然橡膠高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的有效途徑。但是，由于橡膠樹育種周期特別漫長，而且因缺乏高效的早期評選技術，高產(chǎn)性狀和耐寒性狀難于聚合，導致生產(chǎn)上的高產(chǎn)耐寒品種極度匱乏，嚴重影響我國天然橡膠產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。為了解決這一問題，可開發(fā)相應的分子標記輔助橡膠樹的新品種培育，以及通過轉基因技術提高高產(chǎn)橡膠樹品種的耐寒性，創(chuàng)制新品種。本文分析了30個橡膠樹Hsf家族成員在低溫脅迫下橡膠樹‘93-114和‘熱墾501樹葉中的表達模式，還鑒定了Hsf家族成員對干旱和高鹽脅迫的響應。研究結果為進一步解析Hsf家族成員的抗逆機理提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所橡膠樹種苗培育基地培育的橡膠樹無性系‘93-114和‘熱墾501袋裝苗，處于穩(wěn)定期一蓬葉幼苗。天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒;Ferments公司的RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒;寶生物工程（大連）有限公司的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ （TliRNaseHPlus）;其他生化試劑及耗材均為進口或國產(chǎn)分析純試劑;引物合成由Invitrogen公司完成。

1.2 ?方法

1.2.1 ?材料處理 ?恒溫培養(yǎng)箱（PGR15，COVVILN，加拿大）用于室內處理橡膠樹幼苗，設定28?℃培養(yǎng)箱處理對照材料，設定4?℃培養(yǎng)箱低溫處理材料，其他條件設置為：相對濕度為80%，光照強度為125 μmol/（m2·s），16 h光照和8?h黑暗。

低溫脅迫的處理方法：將橡膠樹無性系‘93-114和‘熱墾501袋裝幼苗轉移至28?℃恒溫培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)2 d。然后把材料平均分為2組，以保留在28?℃恒溫培養(yǎng)箱中的一組作為對照，轉移至4?℃培養(yǎng)箱中的一組作為處理。在0、4、8、24?h分別采集對照和處理的幼苗樹葉。每個時間段采集5株幼苗樹葉制成1個混合樣，共3次生物學重復。

干旱脅迫的處理方法：將‘93-114袋裝苗在28?℃預培養(yǎng)2?d，然后平均分為2組，一組在28?℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，另一組除掉袋子和泥土，裸根置于28?℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在0、2、4、8、12、24 h分別收集葉片，每個時間段采集5株幼苗葉片制成1個混合樣，3次生物學重復。

鹽脅迫處理方法：將‘93-114袋裝苗在28?℃預培養(yǎng)2?d，然后平均分為2組，一組以400?mmol/L NaCl溶液澆灌袋裝苗1次，另一組澆灌同樣體積的水，然后繼續(xù)置于28?℃恒溫培養(yǎng)箱中，分別在0、2、4、8、12、24?h 6個時間段收集葉片，每個時間段采集5株幼苗葉片制成1個混合樣，3次生物學重復[4]。所有采集的樣品都用于提取總RNA。

1.2.2 ?總RNA的提取與cDNA的合成 ?橡膠樹葉片總RNA的提取參照天根生化科技（北京）有限公司的植物總RNA提取試劑盒的操作說明進行。cDNA第1鏈的合成根據(jù)Ferments公司試劑盒的操作步驟進行。

1.2.3 ?熒光實時定量PCR分析 ?采用Bio-Rad公司的CFX實時熒光定量PCR系統(tǒng)，實驗操作按儀器使用說明書進行。合成的cDNA溶液稀釋10倍后作為熒光定量PCR分析模板。反應體系10 ?L，包含模板1 ?L，2×SYBR Premix 5 ?L和每條引物0.3??L，無菌水補足10??L。用于qPCR的Hsfs引物和內參HbActin7a引物參照Li等[4]的文獻。PCR反應程序為：95?℃變性30?s;95?℃ 10?s，60?℃ 20 s，72?℃ 20 s，共40個循環(huán)。40個循環(huán)后進行溶解曲線分析。利用CFX manager 3.0軟件自動進行基線和Cq值分析，算法為2–△△Cq法。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用T-test方法對基因表達水平進行差異顯著性分析（P<0.05為顯著差異;P<0.01為極顯著差異）。

2 ?結果與分析

2.1 ?低溫對熱激轉錄因子基因表達的影響

依據(jù)橡膠樹幼苗耐寒性室內評價鑒定體系，對30個橡膠樹Hsfs家族成員在低溫脅迫下‘93-114和‘熱墾501葉片中的表達模式進行了分析。在30個橡膠樹Hsf家族中，24個成員在‘93-114葉片中的本底表達量顯著高于‘熱墾501（圖1）。在低溫條件下，HbHsfA3b、HbHsfA4a、HbHsfA4d、HbHsfA5b、HbHsfA8a、HbHsfA9b、HbHsfC1a、HbHsfC1b、HbHsfB1a和HbHsfB2b在橡膠樹‘93-114和‘熱墾501葉片中均呈顯著上調表達模式，其中HbHsfA4a、HbHsfA4d、HbHsfA9b、HbHsfC1a和HbHsfC1b在‘93-114葉片中的表達量顯著高于‘熱墾501。C亞家族中的2個基因HbHsfC1a和HbHsfC1b在‘93-114和‘熱墾501葉片中的表達模式非常相似，對低溫脅迫比較敏感。在‘93-114和‘熱墾501葉片中均呈顯著下調表達的基因有HbHsfA3a、HbHsfA4b、HbHsfA5a、HbHsfB4c和HbHsfB4d五個基因，但是這些基因在‘93-114葉片中的表達量顯著高于‘熱墾501。另外，還有7個基因在‘熱墾501中顯著上調表達，而在‘93-114中呈顯著下調表達模式，其中HbHsfA7a和HbHsfB2c在‘93-114中的轉錄水平依然高于‘熱墾501（圖1）。

2.2 ?干旱對熱激轉錄因子基因表達的影響

在橡膠樹30個Hsfs家族成員中，有28個成員響應干旱脅迫，只有HbHsfA1c和HbHsfA5b兩個基因不響應干旱脅迫（圖2）。在干旱處理的橡膠樹‘93-114葉片中，HbHsfA3b、HbHsfA4a、HbHsfA4c、HbHsfA4d、HbHsfA5a、HbHsfA6a、HbHsfA7a、HbHsfA9a、HbHsfA9b、HbHsfB1a、HbHsfB3a、HbHsfB4a和HbHsfB4b共13個基因響應干旱處理并呈持續(xù)顯著上調表達模式，其中HbHsfA7a、HbHsfA7a和HbHsfB4b的上調幅度較大，在干旱處理4 h時它們的上調幅度是0 h的3倍以上，對干旱脅迫比較敏感。HbHsfA1b、HbHsfA2b、HbHsfA3a和HbHsfA4b響應干旱脅迫顯著下調表達，其中HbHsfA1b和HbHsfA3a在干旱處理中后期持續(xù)顯著下調表達，而HbHsfA2b和HbHsfA4b分別在干旱處理2 h和24 h時極顯著下調表達，響應干旱脅迫的時間有明顯差異。HbHsfA1a、HbHsfA2a、HbHsfB2c、HbHsfB3b、HbHsfB4d、HbHsfC1a和HbHsfC1b在干旱處理的前期上調表達，在后期下調表達;而HbHsfA8a和HbHsfB2b的表達模式與之相反，它們在干旱處理的前期下調表達，在后期上調表達（圖2）。HbHsfB2a在干旱脅迫下先顯著上調表達，然后顯著下調，后期又極顯著上調表達;而HbHsfB4c在干旱脅迫下先顯著下調表達，然后顯著上調，中后期又極顯著下調表達（圖2）。

2.3 ?高鹽（NaCl）對熱激轉錄因子基因表達的影響

在橡膠樹30個Hsfs家族成員中，有29個成員響應NaCl高鹽脅迫，只有HbHsfA1c不響應高鹽脅迫（圖3）。在高鹽處理的橡膠樹‘93-114葉片中，HbHsfA2b、HbHsfA3b、HbHsfA4a、HbHsfA4b、HbHsfA5b、HbHsfA7a、HbHsfB1a、HbHsfB2a、HbHsfB2b、HbHsfB2c、HbHsfB3a、HbHsfB3b、HbHsfC1a和HbHsfC1b共14個基因響應高鹽脅迫并呈持續(xù)顯著上調表達模式，尤其HbHsfB2a和HbHsfB3a響應高鹽脅迫上調幅度最大，在高鹽處理2 h時它們的轉錄水平是0 h的2倍以上，對高鹽脅迫比較敏感，而HbHsfA2b對高鹽脅迫的反應比較滯后，在12 h之前無響應，在處理24 h時HbHsfA2b的表達迅速上調，幾乎是0 h的3倍。HbHsfA1a、HbHsfA1b、HbHsfA3a和HbHsfA4c響應高鹽脅迫顯著下調表達，其中HbHsfA1a、HbHsfA3a和HbHsfA4c在高鹽處理中后期持續(xù)顯著下調表達，而HbHsfA1b在高鹽處理8 h時極顯著下調表達。HbHsfA2a、HbHsfA4d、HbHsfA5a、HbHsfA9b、HbHsfB4a、HbHsfB4b和HbHsfB4d、在高鹽處理的前期顯著上調表達，在后期顯著下調表達，與這些基因表達模式相反的基因HbHsfA8a和HbHsfB4c分別在高鹽處理的前、中期顯著下調表達，在中、后期顯著上調表達。HbHsfA6a和HbHsfA9a在高鹽脅迫前期先顯著上調表達，然后顯著下調，后期又顯著上調表達（圖3）。

3 ?討論

本研究分析了30個橡膠樹HbHsf家族成員在低溫脅迫下橡膠樹‘93-114和‘熱墾501葉片中的表達模式。結果表明，在HbHsf家族中有10個基因不僅在抗寒橡膠樹種質‘93-114葉片中上調表達，也在不抗寒橡膠樹種質‘熱墾501葉片中顯著上調表達?；虮磉_在不同組織中既有組織的特異性也有組織的相似性。比如上述葉片中上調表達的10個基因中，在低溫條件下，HbHsfA3b、HbHsfA4a、HbHsfA5b、HbHsfA8a、HbHsfC1a、HbHsfC1b和HbHsfB2b在橡膠樹‘93-114和‘熱墾501葉片中均呈顯著上調表達模式，同時也在相應橡膠樹的樹皮中呈上調表達的模式，呈現(xiàn)組織的相似性。但是其他3個基因在樹皮和葉片中的表達模式不一致，呈現(xiàn)組織的特異性[4]。在這2個不同耐寒性的橡膠樹種質中都響應低溫脅迫，但是響應程度不同。尤其HbHsfA4a在低溫脅迫下橡膠樹‘93-114葉片和樹皮中的表達量均顯著高于‘熱墾501。這些基因表達量的高低可能與橡膠樹抗寒性的強弱相對應。

枇杷EjHsf1（A4）響應低溫誘導，通過轉錄調控EjHsp基因參與提高枇杷抵抗低溫脅迫能力[6]。水稻OsHsfA4d受低溫脅迫后上調表達[10]。OsHsfA4s在高鹽脅迫后表達量上調[11]。草莓FvHsfA4a受低溫和干旱脅迫上調表達[12]。橡膠樹HbHsfA4a和HbHsfA4d是EjHsf1、OsHsfA4和FvHsfA4a的同源基因，同樣受低溫、干旱和高鹽脅迫后表達量上調表達（圖4），另外，HbHsfA4a受高溫脅迫上調表達，而HbHsfA4d受高溫誘導下調表達[4]。水稻OsHsfA3和OsHsfA9受低溫脅迫后上調表達[10， 13]。草莓FvHsfA3a在高溫、低溫、干旱和高鹽脅迫下上調表達，F(xiàn)vHsfA9a在低溫和高鹽脅迫下上調表達[12]。辣椒CaHsfA3/A9受高鹽脅迫上調表達[14]。同源基因HbHsfA3b在高溫、低溫、干旱和高鹽脅迫下的橡膠樹‘93-114葉片中上調表達，HbHsfA9b響應高溫、低溫和干旱上調表達（圖4）。小麥B2亞家族TaHsf3響應高溫、低溫、干旱和高鹽的誘導，過表達該基因激活下游基因熱激蛋白HSP70，從而提高擬南芥植株的耐熱性和抗寒性[15]。鷹嘴豆CarHsfB2在高溫、高鹽和干旱脅迫下上調表達，過表達CarHsfB2能夠提高擬南芥植株的耐熱性和抗旱性[16]。但是OsHsfB2b對水稻的抗旱性起負調控作用[11]。B1亞家族基因響應高溫、干旱和高鹽的誘導[2， 12， 14]。同源基因HbHsfB2b在高溫、低溫和高鹽脅迫下的橡膠樹‘93-114葉片中上調表達，HbHsfB1a響應高溫、低溫、高鹽和干旱上調表達（圖4）。水稻OsHsfC1a/b、OsHsfC2a/b在低溫脅迫下表達量顯著上調，其中OsHsfC1對低溫脅迫最敏感[17]。擬南芥的AtHsfC1同樣可被低溫誘導，表達量極顯著上調[18]。另外，在葡萄、胡蘿卜和甘藍等園藝植物中也發(fā)現(xiàn)VaHsfC1a、DcHsfC16和BraHsfC039受低溫脅迫表達量顯著上調[19-21]。由此可見，C亞家族成員在植物抵抗低溫脅迫中也起著重要的作用。此外，小麥TaHsfC2a受高溫脅迫上調表達，過表達TaHsfC2a可上調干旱和高溫誘導基因的表達，提高轉基因植株的耐熱性[22]。OsHsfC1b在水稻抵抗高鹽脅迫中起著重要的作用[23]。由此可見，橡膠樹HbHsfA3b、HbHsfA4a、HbHsfA9b、HbHsfC1a、HbHsfC1b和HbHsfB2b等基因響應多種逆境交叉脅迫，暗示著上述基因功能的多樣性和復雜性。

橡膠樹響應高溫脅迫的研究引自Li等[4]的文獻。

高溫、低溫、高鹽、干旱等逆境常常會導致植物體內發(fā)生氧化脅迫[24]。Hsfs是上調ROS清除酶的活性和HSP基因表達的關鍵因子，利于提高植物對逆境脅迫的抗性[1]。擬南芥體內的AtHsfA3受活性氧誘導表達量上調，過表達AtHsfA3的擬南芥植株中，該基因可直接結合肌醇半乳糖苷合成酶基因GolS1和GolS2的啟動子從而激活GolS1和GolS2的轉錄，肌醇半乳糖苷的含量顯著增加，利于清除羥基自由基，以免植物細胞受到逆境脅迫的傷害[25]。過表達CmHsfA4能夠上調轉基因菊花中CmHSP70、CmHSP90等基因的表達，提高SOD、APX、CAT等活性氧清除酶的活性，降低植物細胞內活性氧的含量，從而增強了轉基因植株的抗逆性[26]。東南景天SaHsfA4c轉基因擬南芥可激活ROS清除酶的活性和上調HSP的表達，降低活性氧的積累，從而增加植物對逆境脅迫的抗性[27]。水稻體內OsHsfC2a響應H2O2誘導表達量上調，可以提高水稻對氧化脅迫的敏感性和抵抗能力[17]。由此可見，橡膠樹HbHsfA3b、HbHsfA4a以及HbHsfC亞家族成員可能參與氧化脅迫反應，保護細胞免受氧化損傷，提高橡膠樹的抗逆性。

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責任編輯：謝龍蓮