骨關節(jié)炎軟骨的近紅外光譜學研究及分期診斷

符娟娟， 馬丹英， 唐金蘭， 包一麟， 趙 遠， 尚林偉， 尹建華

南京航空航天大學自動化學院生物醫(yī)學工程系， 江蘇 南京 211106

引 言

關節(jié)軟骨是覆蓋于骨關節(jié)表面的半透明、 光滑的結締組織， 具有彈性和韌性， 能減少關節(jié)面間的摩擦、 承受高負荷和緩沖震動[1]。 關節(jié)軟骨主要由軟骨細胞(占總體積的1%～2%)和軟骨基質(占總體積的98%～99%)組成[2]。 軟骨基質從外表面到軟骨下骨之間具有明顯的板層狀結構， 一般分為3層： 表層區(qū)(SZ， 軟骨總厚度的10%)、 過渡區(qū)(TZ， 軟骨總厚度的10%)、 深層區(qū)(DZ， 軟骨總厚度的80%)[3]。 基質中主要含有水、 膠原蛋白(Collagen)、 蛋白多糖(PG)和少量無機鹽離子[4]。 其中膠原蛋白排列成網架結構， 維持軟骨的結構和形狀， 并能有效固定PG[5]。 而PG可以保證關節(jié)軟骨的彈性和耐壓性。 在3個分區(qū)中， 深度不同其基質主成分結構和含量也不同[3]。 肥胖、 增齡、 負傷和過度使用等因素都可能會導致關節(jié)軟骨整體結構和成分含量的變化， 從而導致骨關節(jié)炎(OA)[6]。 OA的初級病變主要表現(xiàn)在細胞外基質成分含量和軟骨細胞形態(tài)的變化， 在臨床上的表現(xiàn)并不明顯， 且現(xiàn)有的臨床方法和實驗方法并不能較準確的識別OA的早期病變[7-10]， 對OA的早期診斷造成極大困難。

傅里葉變換近紅外(FTNIR)光譜技術近年來因為其分析速度快、 成本低、 易于穿透組織并含有對應組織成分信息等特點而發(fā)展應用較為迅速， 已被用于手術導航、 無損檢測和疾病診斷等各個領域。 NIR光譜范圍內的光譜吸收主要來自O—H， C—H， N—H和S—H鍵泛頻的伸縮振動， 不同的基團或是同一基團在不同的化學環(huán)境中NIR吸收的波長和強度存在差異[11]。 關節(jié)軟骨基質成分中的膠原蛋白和蛋白多糖中含有近紅外光可探測的大分子鍵(O—H， C—H， N—H和S—H),使得NIR光譜學成為探測關節(jié)軟骨微觀和宏觀變化合適的光學技術[12-13]。 然而， 樣品的狀態(tài)、 光的散射、 儀器等因素會使NIR光譜產生一些與待測樣品無關的干擾， 導致NIR光譜的基線漂移或重復性不強等問題， 因此對原始光譜進行預處理非常必要。 同樣， 光譜預處理選擇會很大程度的影響預測的準確性， 故選擇合適的預處理方法至關重要。 關節(jié)軟骨主成分膠原蛋白、 蛋白多糖和水的特征譜帶在5 300～4 000 cm-1范圍內[14]， 將此波段的光譜進行分析并與化學計量學算法相結合有利于實現(xiàn)快速的樣本分類和識別[15]。

主成分分析(PCA)是一種通過降維技術從多個原始數(shù)據(jù)提取重要信息的分析方法。 為了盡量減少變量和研究對象數(shù)據(jù)信息的損失， 選取累計方差貢獻率達85% 以上的主因子作主成分分析[16]。 Fisher 判別(FDA)通過方差分析建立判別函數(shù)， FDA的原則是使類別間的分散盡可能大， 類別內的分散盡可能小。 通過比較分類中心和樣本之間的距離， 快速對數(shù)據(jù)集進行分類識別[17]。

本研究采用FTNIR 技術對不同分區(qū)(SZ， TZ， DZ)健康和病變的關節(jié)軟骨進行分析， 結合PCA-FDA方法挑選出最佳光譜預處理方法和識別分區(qū)， 基于該最佳預處理方法將PCA-FDA應用于OA不同時期的有效識別。

1 實驗部分

2.1 樣本制備

用于NIR光譜分析的所有比格犬的膝關節(jié)樣本， 均由江蘇南京亞東實驗動物研究中心提供， 并經倫理審查機構批準(SCXK蘇2016-0009)。 選擇9只健康比格犬， 對其中3只(Y7， Y8， Y9)的左后腿膝關節(jié)脛骨平臺進行原位提取， 從而獲取健康樣本； 其余6只進行任一單后腿的膝關節(jié)前交叉韌帶橫切(ACL)手術后[18]， 分別培養(yǎng)3個月(OA-3M： Y1， Y2， Y3)和7個月(OA-7M： Y4， Y5， Y6)， 再從相應手術側的后腿膝關節(jié)脛骨平臺提取樣本。 從實驗犬獲得關節(jié)軟骨樣本后， 用生理鹽水沖洗， 然后將關節(jié)軟骨切割成大小為2 mm×2 mm×2 mm的小塊樣本， 再經去離子水包埋及液氮速凍后， 用低溫切片機(Leica CM 1950,Germany)沿著平行于軟骨表面的方向將軟骨樣本以50 μm的厚度進行連續(xù)切片， 并將切片移取到直徑為13 mm， 厚2 mm的硒化鋅(ZnSe)晶片上(江蘇南晶紅外光學儀器有限公司)， 然后將樣本置于空氣中風干2 h再進行NIR光譜數(shù)據(jù)采集。

軟骨切片樣本信息如表1所示， 實驗所選用的比格犬關節(jié)軟骨切塊厚度低于1 050 μm。 因實驗中3， 4和11號切塊深度為50 μm(最表層)的切片樣本缺失， 未進行光譜檢測。

表1 關節(jié)軟骨水平切片的樣本信息Table 1 Sample information of horizontalsection of articular cartilage

1.2 NIR光譜數(shù)據(jù)采集及數(shù)據(jù)分析

采用傅里葉變換紅外光譜儀(Vertex 70， Bruker公司)及配套的OPUS 7.0軟件對ZnSe晶片上樣本以透射模式進行NIR光譜數(shù)據(jù)采集， 光譜采集范圍10 000～4 000 cm-1， 光譜分辨率8 cm-1， 掃描16次。 在OPUS軟件中采用計算相對積分面積表示基線校正后的特征譜帶的吸光度。 OA-3M組中切塊編號為1—3和5—6； OA-7M組中切塊編號為7—10； 健康組切塊編號為12—15和18的切片(214組)光譜數(shù)據(jù)用于健康和OA的分類分析， 研究不同預處理方法對健康和病變樣本識別率的影響。 在導數(shù)預處理不同參數(shù)結合PCA-FDA的結果中， 發(fā)現(xiàn)一階導數(shù)中2次多項式21點Savitzky-Golay平滑和二階導數(shù)中3次多項式25點Savitzky-Golay平滑的結果最優(yōu)。 故本研究先采用Unscrambler X軟件(CAMO Software,Inc.,Woodbridge,NJ)對獲得的光譜數(shù)據(jù)分別進行基線校正(BC)、 一階導數(shù)2次多項式21點Savitzky-Golay平滑(1st-2-21SG)和二階導數(shù)3次多項式25點Savitzky-Golay平滑(2nd-3-25SG)三種預處理。 再使用IBM SPSS Statistics 20 軟件對光譜數(shù)據(jù)進行主成分分析(PCA)， 并選擇適當主成分因子數(shù)進行Fisher判別(FDA)。

為更進一步對OA樣本進行早期準確識別， 在預測時增加樣本的數(shù)量， 僅對SZ進行樣本切片。 OA-3M組中1—6號切塊； OA-7M組中7—11號切塊和健康組12—18號切塊的光譜數(shù)據(jù)(24組數(shù)據(jù))用于OA的分期分析， 其中包括9組健康和15組OA樣本的光譜數(shù)據(jù)。 在PCA-FDA分類處理過程中， 在健康、 OA-3M和OA-7M光譜數(shù)據(jù)中隨機選擇6， 5和5組(共16組)作為FDA的訓練集， 其余8組光譜數(shù)據(jù)作為預測集進行分類識別。

2 結果與討論

2.1 光譜分析

圖1(a)， (b)和(c)分別是經BC后的健康和OA樣本(3M， 7M)在不同分區(qū)(SZ， TZ， DZ)的近紅外吸收平均光譜。 可發(fā)現(xiàn)， 健康和病變的關節(jié)軟骨在不同深度下的光譜譜形基本相似且具有相同的特征峰。 其中5 150 cm-1譜帶的主要貢獻來自結合水和自由水； 4 130～4 460 cm-1特征譜帶主要貢獻來自膠原和蛋白多糖綜合成分； 4 050， 4 610和4 898 cm-1譜帶主要來自膠原蛋白[14]。

圖1 健康和多期病變樣本的SZ(a)， TZ(b)， DZ(c)的NIR平均光譜圖Fig.1 The near-infrared average spectra of healthy and multi-stage OA tissues at SZ(a)， TZ(b)， DZ(c), respectively

圖2表示健康和多期病變樣本在不同深度(SZ， TZ， DZ)特征帶吸光度(積分面積)比值： 4 610 cm-1/4 898 cm-1(a)、 復合帶/4 898 cm-1(b)、 復合帶/4 610 cm-1(c)。 從圖2(a，b)知： SZ(TZ)中各積分帶比值隨著病變時間(健康、 OA-3M、 OA-7M)的延長呈下降趨勢； 從圖2(a)和(b)得知， 健康樣本中SZ和TZ的吸光度比值高于OA-3M和OA-7M樣本， 分析認為病變初期軟骨中膠原含量幾乎不變， PG含量減少且主要發(fā)生在SZ和TZ[19]。 OA-7M中DZ比值突然升高， 可能是膠原含量不變， DZ中PG修復合成含量增加所致。 圖2(a)和(b)相似的變化趨勢證明4 610 cm-1帶可能亦是復合帶。

圖2 健康和多期病變樣本的4 610 cm-1帶和4 898 cm-1帶(a)、 復合帶和4 898 cm-1帶(b)、 復合帶和4 610 cm-1帶(c)在不同深度(SZ， TZ， DZ)的吸光度比Fig.2 The absorbance ratios of the 4 610 to 4 898 cm-1 band (a), the complex to 4 898 cm-1 band (b), the complex to 4 610 cm-1 band (c) of healthy and multi-stage OA tissues at different depths (SZ, TZ, DZ), respectively

進一步比較SZ， TZ和DZ的吸光度比值變化趨勢， 發(fā)現(xiàn)圖2(b)中同一病期(健康)的吸光度比值梯度下降比較顯著， OA-3M略有緩和， OA-7M病期的梯度變化則趨于平緩甚至相反， 表明手術誘發(fā)OA病變后PG含量的變化。 圖2(c)中復合帶/4 610 cm-1帶的吸光度比值隨分區(qū)深度的變化在健康、 OA-3M和OA-7M中趨于一個非常接近的斜率， 進一步證明4 610 cm-1帶是包含PG成分和膠原蛋白的復合帶。

上述特征帶吸光度的比值研究， 證實了4 610 cm-1帶是綜合成分的整體貢獻， 而不似文獻[14]所報道的4 610 cm-1帶僅來源于膠原蛋白的這一說法。 因為NIR光譜的吸收帶多是X—H基團振動的重疊， 所以比較復雜， 不像MIR特征帶分配定義較為清晰， 易于定量分析。 因此， 仍需將NIR光譜結合化學計量學方法進行進一步的定量研究或分期診斷。

2.2 光譜預處理后樣本分類的PCA-FDA

圖3為健康和OA樣本SZ位置的NIR光譜數(shù)據(jù)分別BC， 1st-2-21SG， 2nd-3-25SG預處理后的前3個主因子的散點圖。 從圖3(a)得知， 經BC預處理和PCA后健康和OA樣本的3個主因子混合在一起， 無法較好的區(qū)分； 比較圖3(b)和(c)發(fā)現(xiàn)， 經2nd-3-25SG預處理和PCA后的樣本主因子混合程度較1st-2-21SG嚴重。 TZ和DZ的光譜數(shù)據(jù)經與SZ相同的預處理后， 前3個主因子圖的變化趨勢與SZ大抵相同。 說明導數(shù)預處理可以較好地區(qū)分不同類間的差異。 預處理(BC， 1st-2-21SG， 2nd-3-25SG)后的NIR光譜的SZ， TZ及DZ前3個主因子的累計貢獻率均超過85%， 但隨著因子數(shù)的增加， 樣本的正確識別率上升， 所以本研究選擇固定的前5個主成分因子(累計貢獻率均超過90%)進行FDA處理。

圖3 健康和OA樣本SZ的NIR光譜數(shù)據(jù)分別經BC(a)， 1st-2-21SG(b)和2nd-3-25SG(c)預處理后的前3個主因子散點圖Fig.3 The scatter plots of the first 3 principal factors on the SZ NIR spectra of healthy and OAtissues with preprocess of BC(a)， 1st-2-21SG (b) and 2nd-3-25SG (c), respectively

表2為健康和病變樣本的NIR光譜(SZ 20片、 TZ 21片、 DZ 173片)經BC， 1st-2-21SG， 2nd-3-25SG等3種不同預處理后PCA-FDA的判別結果， 可分析不同的預處理方法對關節(jié)軟骨分類的影響。 從表2知， SZ的NIR光譜經BC預處理后的初始案例和交叉案例的正確識別率分別為80%和50%； 經1st-2-21SG預處理后的初始案例和交叉案例的正確識別率分別為95%和90%； 經2nd-3-25SG預處理后的初始案例和交叉案例的正確識別率分別是85%和70%。 在樣本TZ中的NIR光譜經1st-2-21SG預處理后正確識別率為85.7%(初始案例)和85.7%(交互驗證案例)， 經BC預處理后的初始案例正確識別率為76.2%和交叉驗證的正確識別率為71.4%。 經2nd-3-25SG預處理后的初始案例和交叉案例的正確識別率分別為76.2%和42.9%。 在樣本DZ中的NIR光譜經1st-2-21SG預處理后的判別結果最優(yōu)， 正確識別率也僅有73.8%(初始案例)和71.8%(交互驗證案例)， BC， 2nd-3-25SG的識別率更低， 其中初始案例的最高的識別率才達到71.3%。

表2 健康和病變樣本的NIR光譜不同預處理后的Fisher判別結果

綜上所述， 同一軟骨分區(qū)的NIR光譜經3種不同預處理后， PCA-FDA的初始案例和交叉驗證案例的正確識別率均是經1st-2-21SG預處理后的判別結果最好， 其中SZ的識別率高達95%(初始案例)和90%(交互驗證案例)。 1號切塊50 μm深度的樣本在初始案例和交叉驗證中均被誤判到健康組， 誤判的原因可能是該部位基質成分并未出現(xiàn)明顯的變化； 3號切塊100 μm深度的樣本在交叉驗證中被誤判到健康組， 可能是由于在OA過程中該部位并未出現(xiàn)明顯的損傷導致誤判。 本研究結果說明采用一階導數(shù)光譜預處理可以很好的消除基線偏移， 能凸顯健康和病變的特征， 從而達到良好的區(qū)分； 基于光譜均作1st-2-21SG預處理的判別結果， 可得出， 表層區(qū)的判別結果優(yōu)于過渡區(qū)， 更優(yōu)于深層區(qū)。

表3是SZ， TZ和DZ的NIR光譜數(shù)據(jù)經1st-2-21SG預處理后PCA-FDA顯著性檢驗結果。 Wilk’s Lambda是組內的平方和與總平方的比， 范圍從0到1。 Wilk’s Lambda值越低， 說明類間差異就越大[20]。 sig.為顯著性水平假設檢驗， sig.值小于0.05， 說明函數(shù)判別顯著。 從表3可知， TZ DZ中sig.的值雖然都小于0.05， 但Wilk’s lambda的值偏大(0.366， 0.772)， 類間的差異不明顯， 故DZ的誤判率最高。 由SZ中Wilk’s lambda(0.345)和sig.(0.006)可知： SZ的NIR光譜數(shù)據(jù)經1st-2-21SG預處理后對健康和病變組織的分類具有很好的辨別能力。 根據(jù)相關文獻[19,21]， OA關節(jié)軟骨早期病變基質成分含量的變化最明顯的區(qū)域就是SZ， 也是最易受損的區(qū)域， 與本研究的結果分析是一致的。 因此進一步選擇SZ的樣本進行不同階段的OA分期判別。

表3 SZ， TZ和DZ的NIR光譜數(shù)據(jù)經1st-2-21SG后的PCA-FDA顯著性檢驗結果

2.3 OA分期的PCA-FDA

健康和多期OA軟骨NIR光譜的訓練集和預測集的PCA-FDA結果如表4所示。 訓練集的初始案例識別率為93.8%和交叉驗證識別率為87.5%； 預測集的識別率為87.5%， 其中健康組和OA-7M組樣本是否病變及病變時期全部被正確識別， OA-3M組也全被正確識別為病變樣本， 只是OA-3M組中Y3的5號切塊、 50 μm深度的樣本切片(預測集)被誤判到OA-7M組。 出現(xiàn)誤判的原因可能是： 在OA過程中， 由于個體差異， 預測集中Y3犬的該部位出現(xiàn)明顯的損傷， 導致誤判； 在初始案例和交叉案例的識別中， 有同一樣本被誤判(6號切塊深度為50 μm)， 該樣本的存在， 影響了訓練集的模型。

表4 健康和多期OA樣本NIR光譜的訓練集和預測集的PCA-FDA(SZ， TZ， DZ)Table 4 PCA-FDA of NIR spectral training and prediction sets ofhealthy and multi-stage OA cartilage (SZ， TZ， DZ)

基于以上結果， 如果將影響訓練集模型的該數(shù)據(jù)移出， 再次做OA分期分析， 發(fā)現(xiàn)訓練集的初始案例正確識別率為100%、 交叉驗證正確識別率為93.3%、 預測集的正確識別率為87.5%， 提高了訓練集模型的穩(wěn)定性。 在訓練集交叉驗證判別結果中OA-3M組Y2犬3號切塊、 100 μm深度的切片樣本被誤判到健康組， 且在健康和OA分類分析中， 該樣本同樣出現(xiàn)誤判， 出現(xiàn)誤判的原因可能是： 由于ACL手術3個月， 處于OA的早期病變， 該部位基質成分并未出現(xiàn)明顯的變化。 預測集健康組和OA-7M組樣本是否病變及病變分期也全部被正確識別， OA-3M組也全被正確識別為病變樣本， 同樣是OA-3M組中Y3的5號切塊50 μm深度的切片樣本被誤判到OA-7M組。

采用1st-2-21SG的NIR光譜預處理方法結合PCA-FDA能有效地改善NIR光譜的分析效果， 并能較準確地對OA的不同病期進行識別。 僅針對OA早期病變進行初步研究， 為更深入地對早期OA病變進行研究， 需擴大樣本數(shù)量， 提高模型的穩(wěn)定性， 提高預測效果。

3 結 論

采用FTNIR技術結合PCA-FDA方法對比格犬健康和不同病期的OA進行研究。 詳細地探討B(tài)C， 1st-2-21SG和2nd-3-25SG三種不同預處理方法對FDA結果的影響。 發(fā)現(xiàn)經1st-2-21SG預處理后在SZ的判別結果最優(yōu)， 初始案例和交互驗證案例的識別率分別達到95%和90%； 在OA分期識別結果中， 模型的初始案例正確識別率為100%， 交互驗證正確識別率為93.3%， 預測集的識別率為87.5%。 采用NIR光譜的1st-2-21SG預處理結合PCA-FDA能有效地改善NIR光譜的分析效果， 較準確地鑒別關節(jié)軟骨是否發(fā)生病變， 并能準確地對OA的不同病期進行判別， 本研究有效實現(xiàn)了OA的NIR監(jiān)督分類/分期識別， 為OA的早期原位診斷提供一種臨床可借鑒方法， 對骨關節(jié)炎OA的研究、 監(jiān)測和診斷具有重要意義。