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    微生物法測(cè)定嬰幼兒乳粉中葉酸含量方法優(yōu)化

    2021-09-14 12:00:24張曉金楊丹妮鄒雨虹鮑晗鋒
    現(xiàn)代食品 2021年13期
    關(guān)鍵詞:定容葉酸容量瓶

    ◎ 張曉金,楊丹妮,鄒雨虹,鮑晗鋒

    (常州市食品藥品纖維質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,江蘇 常州 213000)

    葉酸是一種水溶性維生素,分子式是C19H19N7O6,它廣泛存在于肉類、鮮果、蔬菜中,因綠葉中含量十分豐富而得名[1]。在自然界中有幾種存在形式,其母體化合物是由喋啶、對(duì)氨基苯甲酸和谷氨酸3種成分結(jié)合而成[2]。葉酸作為人體必需的維生素之一,對(duì)于蛋白質(zhì)的代謝、生理機(jī)能的維持起到重要的作用。我國(guó)建議成年人每日葉酸攝入量為200 μg,孕婦每日葉酸攝入量為400 μg。妊娠期的婦女服用葉酸不但能夠有效促進(jìn)胎兒身體器官的發(fā)育,而且對(duì)于降低胎兒神經(jīng)管畸形發(fā)生率、改善貧血、預(yù)防早產(chǎn)[3]等都具有重要作用。研究表明,維持體內(nèi)較好的葉酸水平,對(duì)降低抑郁癥、腦卒中和腫瘤等疾病的發(fā)病概率具有積極作用。因此食品中葉酸含量的準(zhǔn)確測(cè)定十分關(guān)鍵,對(duì)居民日常飲食、預(yù)防疾病具有重要意義。

    目前對(duì)葉酸的定量檢測(cè)方法有很多,如高效液相色譜法[4]、液質(zhì)聯(lián)用法[5]、酶聯(lián)免疫法[6]等。但是微生物方法因其穩(wěn)定性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)成為葉酸檢測(cè)的首選方法[7-9]。本研究通過(guò)對(duì)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中葉酸的測(cè)定》(GB 5009.211—2014)[10]進(jìn)行方法和細(xì)節(jié)優(yōu)化,理順整個(gè)實(shí)驗(yàn)的操作過(guò)程,改善標(biāo)準(zhǔn)中的接種液的制備、培養(yǎng)基的配制、樣品的培養(yǎng)時(shí)間等關(guān)鍵控制點(diǎn),為需要運(yùn)用國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行葉酸含量檢測(cè)的工作者提供理論和操作的參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    鼠李糖乳桿菌菌種:廣東省微生物菌種保藏中心;葉酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥97%):北京科量技術(shù)有限公司;葉酸測(cè)定用培養(yǎng)基、乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基、菌株儲(chǔ)備用瓊脂培養(yǎng)基:北京陸橋技術(shù)股份有限公司;氫氧化鈉、乙醇、氯化鈉:分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    SQ510C立式壓力蒸汽滅菌鍋:重慶雅馬拓科技有限公司;MPR-710醫(yī)用冷藏箱:松下冷鏈大連有限公司;UV-2600紫外-可見(jiàn)分光光度儀:島津儀器蘇州有限公司;3-18R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī):上海托莫斯科學(xué)儀器;BHC-1300IIB2生物安全柜:蘇潔醫(yī)療器械蘇州有限公司;SB25-12DTD超聲波振蕩器:寧波新芝生物科技股份有限公司;BD115恒溫培養(yǎng)箱:德國(guó)賓德公司;Lab dancer渦旋混勻器:艾卡廣州儀器設(shè)備有限公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 玻璃器皿的清洗

    將實(shí)驗(yàn)所需玻璃器皿洗刷干凈,沸水浴30 min,瀝干后放入鹽酸浸泡液中浸泡2 h,蒸餾水清洗,經(jīng)170 ℃度烘干3 h后備用。

    1.3.2 菌種的制備

    將鼠李糖乳桿菌轉(zhuǎn)種于菌株儲(chǔ)備用瓊脂培養(yǎng)基,36 ℃培養(yǎng)20 h。連續(xù)傳種3代后接種于乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中,于36 ℃培養(yǎng)20 h后的菌懸液接種于磁珠保藏管內(nèi),-70 ℃作為工作菌株保存。臨實(shí)驗(yàn)前一天將磁珠保存的鼠李糖乳桿菌接入乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中,36 ℃培養(yǎng)20 h進(jìn)行活化。活化后放入冷藏冰箱備用,用于接種液的制備。

    1.3.3 葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備

    精確稱取20.6 mg葉酸標(biāo)準(zhǔn)品,用氫氧化鈉乙醇溶液(0.01 mol·L-1)溶解并轉(zhuǎn)入1 000 mL容量瓶中,定容至刻度。

    1.3.4 葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的標(biāo)定

    吸取20 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至100 mL容量瓶,用氫氧化鈉溶液(1 mol·L-1)定容至刻度。吸取20 mL氫氧化鈉乙醇溶液于100 mL容量瓶中,用氫氧化鈉溶液定容至刻度作為調(diào)零管。用1 cm比色杯在256 nm下,測(cè)3次吸光度,取平均值計(jì)算,見(jiàn)表1。標(biāo)定好的葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于棕色瓶中。

    表1 葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度標(biāo)定表

    1.3.5 葉酸標(biāo)準(zhǔn)中間液的制備

    準(zhǔn)確吸取5 mL葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于500 mL棕色容量瓶,用氫氧化鈉乙醇溶液稀釋定容。

    1.3.6 培養(yǎng)基的制備

    按產(chǎn)品要求配制實(shí)驗(yàn)所需用量的葉酸測(cè)定用培養(yǎng)液,加熱煮沸至完全溶解,待培養(yǎng)液冷卻后過(guò)濾,放入冰箱待用。

    1.3.7 葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備

    吸取1 mL葉酸標(biāo)準(zhǔn)中間液于1 000 mL容量瓶,用水定容至刻度(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

    1.3.8 種子培養(yǎng)液的制備

    取4 mL葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液和8 mL葉酸測(cè)定用培養(yǎng)液混勻,分裝至2支10 mL離心管中,并分別標(biāo)注為A管和B管(A管為實(shí)驗(yàn)管,B管為備用管)。另取1支僅含5 mL葉酸測(cè)定用培養(yǎng)液的離心管標(biāo)注為C管。將A、B、C管于121 ℃滅菌5 min。將活化的菌株用接種環(huán)轉(zhuǎn)接于冷卻后的A管和B管中,36 ℃培養(yǎng)20 h,培養(yǎng)后的A管和B管離心棄去上層液體,再用0.85%無(wú)菌生理鹽水重復(fù)清洗3次。在無(wú)菌操作下吸取0.5 mL A管菌懸液轉(zhuǎn)種于僅含5 mL葉酸測(cè)定用培養(yǎng)液的C管,36 ℃培養(yǎng)6 h,即為接種液。

    1.3.9 樣品的制備

    準(zhǔn)確稱取0.1~0.5 g,精確至0.001 g樣品于100 mL 錐形瓶中,另取100 mL錐形瓶做空白。加入80 mL氫氧化鈉乙醇溶液,具塞,超聲4 h,轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中用水定容至刻度,過(guò)濾。根據(jù)試樣中葉酸的含量,用水對(duì)提取液進(jìn)行稀釋,使得稀釋后的葉酸含量在0.2~0.6 ng·mL-1的范圍內(nèi)。

    1.3.10 標(biāo)準(zhǔn)系列管的制備

    取系列管S1~S10分別加入葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液、實(shí)驗(yàn)室用水和葉酸測(cè)定用培養(yǎng)基,見(jiàn)表2。為保證曲線的線性關(guān)系,需配置3套系列管。

    表2 標(biāo)準(zhǔn)系列管的制備表

    1.3.11 樣品系列管的制備

    取3支試管分別加入樣液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL,然后加入實(shí)驗(yàn)室用水和葉酸測(cè)定用培養(yǎng)液,混勻,見(jiàn)表3。

    表3 樣品系列管的制備表

    1.3.12 滅菌及接種培養(yǎng)

    將所有標(biāo)準(zhǔn)系列管和試樣管塞好對(duì)應(yīng)的塞子,于121 ℃高壓滅菌5 min,滅菌完成后為防止培養(yǎng)液顏色加深,應(yīng)立即將系列管放入冷藏冰箱冷卻降溫。冷卻完成后,在無(wú)菌條件下向除0對(duì)照管外的系列管中各加入50 μL的接種液[11],塞好對(duì)應(yīng)塞子,渦旋混勻,于36 ℃培養(yǎng)30 h。

    1.3.13 標(biāo)準(zhǔn)系列管和樣品的測(cè)定

    將培養(yǎng)好的標(biāo)準(zhǔn)系列管和試樣管用1 cm厚的比色皿,于540 nm處,將0對(duì)照管調(diào)節(jié)吸光度為0,測(cè)定系列管和試樣管并記錄對(duì)應(yīng)的吸光度值。在每支需測(cè)定反應(yīng)管的吸光度值前用渦旋器混勻10 s,混勻后立即倒入1 cm比色皿中,放入卡槽,5 s后讀數(shù)并記錄相應(yīng)的吸光度值。因菌懸液的沉淀,所以需要相同時(shí)間上機(jī)讀數(shù),以確保系列管的線性和試樣測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 培養(yǎng)液制備的優(yōu)化

    國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中未對(duì)葉酸測(cè)定用培養(yǎng)液的制備有詳細(xì)的表述,通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)煮沸溶解而未經(jīng)過(guò)濾的培養(yǎng)液會(huì)有少許的沉淀現(xiàn)象出現(xiàn),而這些沉淀容易造成標(biāo)準(zhǔn)曲線基線不穩(wěn)定的情況。因此經(jīng)過(guò)煮沸且過(guò)濾的培養(yǎng)液,可以有效保證標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系。

    2.2 菌懸液接種量和培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化

    國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中菌懸液的接種量為20 μL,培養(yǎng)時(shí)間為20~40 h。由于微生物生長(zhǎng)的特異性,接種量過(guò)少,培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),容易導(dǎo)致葉酸含量少的基點(diǎn)讀數(shù)偏高;接種量少,培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短,容易導(dǎo)致葉酸含量多的基點(diǎn)讀數(shù)偏低。經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)接種量為50 μL,培養(yǎng)時(shí)間30 h最為適宜,其標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)比較穩(wěn)定。

    2.3 滅菌時(shí)間的優(yōu)化

    國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)培養(yǎng)液、系列管和試樣管的滅菌要求都是121 ℃、15 min。但經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),過(guò)長(zhǎng)的滅菌時(shí)間會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)液的自身顏色加深,從而影響整體的準(zhǔn)確性。而121 ℃、5 min也能達(dá)到有效的滅菌效果,其顏色對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響也能降到最低。

    2.4 葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

    以標(biāo)準(zhǔn)系列管中葉酸含量為橫坐標(biāo),以3套標(biāo)準(zhǔn)管每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)吸光度值的平均值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=-0.564 7X2+1.491X+0.237 4,其中標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r2=0.997 6,見(jiàn)圖1。由于微生物生長(zhǎng)分為:遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期4個(gè)時(shí)期[12],所以標(biāo)準(zhǔn)曲線需要應(yīng)用多變量方程來(lái)計(jì)算。

    圖1 嬰幼兒乳粉中葉酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

    2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

    用以上方法對(duì)同批次的嬰幼兒乳粉中的葉酸進(jìn)行取樣測(cè)定6次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為滿意,見(jiàn)表4。

    表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)表

    2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

    稱取已測(cè)試的嬰幼兒乳粉樣品6份,分別加入葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.5 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.0 mL、 2.0 mL和2.0 mL。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定其回收率分別為92.3%、 91.6%、94.2%、95.1%、102.8%和99.3%,平均回收率為95.9%,從而可以看出此優(yōu)化方法可以滿足檢測(cè)需求。

    3 結(jié)論

    本研究方法在培養(yǎng)基配制時(shí),通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基加熱煮沸后增加過(guò)濾的步驟,以此來(lái)減少培養(yǎng)基中雜質(zhì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響;在滅菌時(shí)相對(duì)于國(guó)標(biāo)中的滅菌時(shí)間15 min,此方法優(yōu)化成5 min,以此來(lái)減少培養(yǎng)基因長(zhǎng)時(shí)間的高溫加熱而引起顏色加深對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響;對(duì)于國(guó)標(biāo)中的20~40 h的培養(yǎng)時(shí)間,通過(guò)對(duì)接種量和培養(yǎng)時(shí)間的多次對(duì)比情況,培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化為30 h左右的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)線性較為滿意。微生物法測(cè)定乳粉中葉酸的含量,其因受到人員、設(shè)備、實(shí)驗(yàn)環(huán)境、實(shí)驗(yàn)方法等多方面的影響,所以對(duì)實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)人員的素質(zhì)都有較高的要求。而經(jīng)過(guò)優(yōu)化的方法,通過(guò)對(duì)各檢驗(yàn)步驟的詳細(xì)整理和闡述,能夠?yàn)槌醮芜\(yùn)用微生物法進(jìn)行葉酸檢測(cè)檢驗(yàn)人員提供可靠的理論和操 作參考。

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