微生物法測(cè)定嬰幼兒乳粉中葉酸含量方法優(yōu)化

◎ 張曉金，楊丹妮，鄒雨虹，鮑晗鋒

(常州市食品藥品纖維質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇 常州 213000)

葉酸是一種水溶性維生素，分子式是C19H19N7O6，它廣泛存在于肉類、鮮果、蔬菜中，因綠葉中含量十分豐富而得名[1]。在自然界中有幾種存在形式，其母體化合物是由喋啶、對(duì)氨基苯甲酸和谷氨酸3種成分結(jié)合而成[2]。葉酸作為人體必需的維生素之一，對(duì)于蛋白質(zhì)的代謝、生理機(jī)能的維持起到重要的作用。我國(guó)建議成年人每日葉酸攝入量為200 μg，孕婦每日葉酸攝入量為400 μg。妊娠期的婦女服用葉酸不但能夠有效促進(jìn)胎兒身體器官的發(fā)育，而且對(duì)于降低胎兒神經(jīng)管畸形發(fā)生率、改善貧血、預(yù)防早產(chǎn)[3]等都具有重要作用。研究表明，維持體內(nèi)較好的葉酸水平，對(duì)降低抑郁癥、腦卒中和腫瘤等疾病的發(fā)病概率具有積極作用。因此食品中葉酸含量的準(zhǔn)確測(cè)定十分關(guān)鍵，對(duì)居民日常飲食、預(yù)防疾病具有重要意義。

目前對(duì)葉酸的定量檢測(cè)方法有很多，如高效液相色譜法[4]、液質(zhì)聯(lián)用法[5]、酶聯(lián)免疫法[6]等。但是微生物方法因其穩(wěn)定性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)成為葉酸檢測(cè)的首選方法[7-9]。本研究通過(guò)對(duì)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中葉酸的測(cè)定》（GB 5009.211—2014）[10]進(jìn)行方法和細(xì)節(jié)優(yōu)化，理順整個(gè)實(shí)驗(yàn)的操作過(guò)程，改善標(biāo)準(zhǔn)中的接種液的制備、培養(yǎng)基的配制、樣品的培養(yǎng)時(shí)間等關(guān)鍵控制點(diǎn)，為需要運(yùn)用國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行葉酸含量檢測(cè)的工作者提供理論和操作的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠李糖乳桿菌菌種：廣東省微生物菌種保藏中心；葉酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥97%）：北京科量技術(shù)有限公司；葉酸測(cè)定用培養(yǎng)基、乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基、菌株儲(chǔ)備用瓊脂培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；氫氧化鈉、乙醇、氯化鈉：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SQ510C立式壓力蒸汽滅菌鍋：重慶雅馬拓科技有限公司；MPR-710醫(yī)用冷藏箱：松下冷鏈大連有限公司；UV-2600紫外-可見(jiàn)分光光度儀：島津儀器蘇州有限公司；3-18R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：上海托莫斯科學(xué)儀器；BHC-1300IIB2生物安全柜：蘇潔醫(yī)療器械蘇州有限公司；SB25-12DTD超聲波振蕩器：寧波新芝生物科技股份有限公司；BD115恒溫培養(yǎng)箱：德國(guó)賓德公司；Lab dancer渦旋混勻器：艾卡廣州儀器設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 玻璃器皿的清洗

將實(shí)驗(yàn)所需玻璃器皿洗刷干凈，沸水浴30 min，瀝干后放入鹽酸浸泡液中浸泡2 h，蒸餾水清洗，經(jīng)170 ℃度烘干3 h后備用。

1.3.2 菌種的制備

將鼠李糖乳桿菌轉(zhuǎn)種于菌株儲(chǔ)備用瓊脂培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)20 h。連續(xù)傳種3代后接種于乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中，于36 ℃培養(yǎng)20 h后的菌懸液接種于磁珠保藏管內(nèi)，-70 ℃作為工作菌株保存。臨實(shí)驗(yàn)前一天將磁珠保存的鼠李糖乳桿菌接入乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中，36 ℃培養(yǎng)20 h進(jìn)行活化。活化后放入冷藏冰箱備用，用于接種液的制備。

1.3.3 葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備

精確稱取20.6 mg葉酸標(biāo)準(zhǔn)品，用氫氧化鈉乙醇溶液（0.01 mol·L-1）溶解并轉(zhuǎn)入1 000 mL容量瓶中，定容至刻度。

1.3.4 葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的標(biāo)定

吸取20 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至100 mL容量瓶，用氫氧化鈉溶液（1 mol·L-1）定容至刻度。吸取20 mL氫氧化鈉乙醇溶液于100 mL容量瓶中，用氫氧化鈉溶液定容至刻度作為調(diào)零管。用1 cm比色杯在256 nm下，測(cè)3次吸光度，取平均值計(jì)算，見(jiàn)表1。標(biāo)定好的葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于棕色瓶中。

表1 葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度標(biāo)定表

1.3.5 葉酸標(biāo)準(zhǔn)中間液的制備

準(zhǔn)確吸取5 mL葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于500 mL棕色容量瓶，用氫氧化鈉乙醇溶液稀釋定容。

1.3.6 培養(yǎng)基的制備

按產(chǎn)品要求配制實(shí)驗(yàn)所需用量的葉酸測(cè)定用培養(yǎng)液，加熱煮沸至完全溶解，待培養(yǎng)液冷卻后過(guò)濾，放入冰箱待用。

1.3.7 葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備

吸取1 mL葉酸標(biāo)準(zhǔn)中間液于1 000 mL容量瓶，用水定容至刻度（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.3.8 種子培養(yǎng)液的制備

取4 mL葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液和8 mL葉酸測(cè)定用培養(yǎng)液混勻，分裝至2支10 mL離心管中，并分別標(biāo)注為A管和B管（A管為實(shí)驗(yàn)管，B管為備用管）。另取1支僅含5 mL葉酸測(cè)定用培養(yǎng)液的離心管標(biāo)注為C管。將A、B、C管于121 ℃滅菌5 min。將活化的菌株用接種環(huán)轉(zhuǎn)接于冷卻后的A管和B管中，36 ℃培養(yǎng)20 h，培養(yǎng)后的A管和B管離心棄去上層液體，再用0.85%無(wú)菌生理鹽水重復(fù)清洗3次。在無(wú)菌操作下吸取0.5 mL A管菌懸液轉(zhuǎn)種于僅含5 mL葉酸測(cè)定用培養(yǎng)液的C管，36 ℃培養(yǎng)6 h，即為接種液。

1.3.9 樣品的制備

準(zhǔn)確稱取0.1～0.5 g，精確至0.001 g樣品于100 mL 錐形瓶中，另取100 mL錐形瓶做空白。加入80 mL氫氧化鈉乙醇溶液，具塞，超聲4 h，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中用水定容至刻度，過(guò)濾。根據(jù)試樣中葉酸的含量，用水對(duì)提取液進(jìn)行稀釋，使得稀釋后的葉酸含量在0.2～0.6 ng·mL-1的范圍內(nèi)。

1.3.10 標(biāo)準(zhǔn)系列管的制備

取系列管S1～S10分別加入葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液、實(shí)驗(yàn)室用水和葉酸測(cè)定用培養(yǎng)基，見(jiàn)表2。為保證曲線的線性關(guān)系，需配置3套系列管。

表2 標(biāo)準(zhǔn)系列管的制備表

1.3.11 樣品系列管的制備

取3支試管分別加入樣液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL，然后加入實(shí)驗(yàn)室用水和葉酸測(cè)定用培養(yǎng)液，混勻，見(jiàn)表3。

表3 樣品系列管的制備表

1.3.12 滅菌及接種培養(yǎng)

將所有標(biāo)準(zhǔn)系列管和試樣管塞好對(duì)應(yīng)的塞子，于121 ℃高壓滅菌5 min，滅菌完成后為防止培養(yǎng)液顏色加深，應(yīng)立即將系列管放入冷藏冰箱冷卻降溫。冷卻完成后，在無(wú)菌條件下向除0對(duì)照管外的系列管中各加入50 μL的接種液[11]，塞好對(duì)應(yīng)塞子，渦旋混勻，于36 ℃培養(yǎng)30 h。

1.3.13 標(biāo)準(zhǔn)系列管和樣品的測(cè)定

將培養(yǎng)好的標(biāo)準(zhǔn)系列管和試樣管用1 cm厚的比色皿，于540 nm處，將0對(duì)照管調(diào)節(jié)吸光度為0，測(cè)定系列管和試樣管并記錄對(duì)應(yīng)的吸光度值。在每支需測(cè)定反應(yīng)管的吸光度值前用渦旋器混勻10 s，混勻后立即倒入1 cm比色皿中，放入卡槽，5 s后讀數(shù)并記錄相應(yīng)的吸光度值。因菌懸液的沉淀，所以需要相同時(shí)間上機(jī)讀數(shù)，以確保系列管的線性和試樣測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)液制備的優(yōu)化

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中未對(duì)葉酸測(cè)定用培養(yǎng)液的制備有詳細(xì)的表述，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)煮沸溶解而未經(jīng)過(guò)濾的培養(yǎng)液會(huì)有少許的沉淀現(xiàn)象出現(xiàn)，而這些沉淀容易造成標(biāo)準(zhǔn)曲線基線不穩(wěn)定的情況。因此經(jīng)過(guò)煮沸且過(guò)濾的培養(yǎng)液，可以有效保證標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系。

2.2 菌懸液接種量和培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中菌懸液的接種量為20 μL，培養(yǎng)時(shí)間為20～40 h。由于微生物生長(zhǎng)的特異性，接種量過(guò)少，培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，容易導(dǎo)致葉酸含量少的基點(diǎn)讀數(shù)偏高；接種量少，培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短，容易導(dǎo)致葉酸含量多的基點(diǎn)讀數(shù)偏低。經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)接種量為50 μL，培養(yǎng)時(shí)間30 h最為適宜，其標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)比較穩(wěn)定。

2.3 滅菌時(shí)間的優(yōu)化

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)培養(yǎng)液、系列管和試樣管的滅菌要求都是121 ℃、15 min。但經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)長(zhǎng)的滅菌時(shí)間會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)液的自身顏色加深，從而影響整體的準(zhǔn)確性。而121 ℃、5 min也能達(dá)到有效的滅菌效果，其顏色對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響也能降到最低。

2.4 葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以標(biāo)準(zhǔn)系列管中葉酸含量為橫坐標(biāo)，以3套標(biāo)準(zhǔn)管每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)吸光度值的平均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=-0.564 7X2+1.491X+0.237 4，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r2=0.997 6，見(jiàn)圖1。由于微生物生長(zhǎng)分為：遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期4個(gè)時(shí)期[12]，所以標(biāo)準(zhǔn)曲線需要應(yīng)用多變量方程來(lái)計(jì)算。

圖1 嬰幼兒乳粉中葉酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

用以上方法對(duì)同批次的嬰幼兒乳粉中的葉酸進(jìn)行取樣測(cè)定6次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為滿意，見(jiàn)表4。

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)表

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

稱取已測(cè)試的嬰幼兒乳粉樣品6份，分別加入葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.5 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.0 mL、 2.0 mL和2.0 mL。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定其回收率分別為92.3%、 91.6%、94.2%、95.1%、102.8%和99.3%，平均回收率為95.9%，從而可以看出此優(yōu)化方法可以滿足檢測(cè)需求。

3 結(jié)論

本研究方法在培養(yǎng)基配制時(shí)，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基加熱煮沸后增加過(guò)濾的步驟，以此來(lái)減少培養(yǎng)基中雜質(zhì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響；在滅菌時(shí)相對(duì)于國(guó)標(biāo)中的滅菌時(shí)間15 min，此方法優(yōu)化成5 min，以此來(lái)減少培養(yǎng)基因長(zhǎng)時(shí)間的高溫加熱而引起顏色加深對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響；對(duì)于國(guó)標(biāo)中的20～40 h的培養(yǎng)時(shí)間，通過(guò)對(duì)接種量和培養(yǎng)時(shí)間的多次對(duì)比情況，培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化為30 h左右的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)線性較為滿意。微生物法測(cè)定乳粉中葉酸的含量，其因受到人員、設(shè)備、實(shí)驗(yàn)環(huán)境、實(shí)驗(yàn)方法等多方面的影響，所以對(duì)實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)人員的素質(zhì)都有較高的要求。而經(jīng)過(guò)優(yōu)化的方法，通過(guò)對(duì)各檢驗(yàn)步驟的詳細(xì)整理和闡述，能夠?yàn)槌醮芜\(yùn)用微生物法進(jìn)行葉酸檢測(cè)檢驗(yàn)人員提供可靠的理論和操 作參考。