超聲波輔助提取玉米花絲多酚工藝優(yōu)化及其抑菌活性研究

任世達(dá)，方曉敏，羅雁非，賈 睿，劉倩男，蔡 丹,*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；2.小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130118；3.長(zhǎng)春海關(guān)技術(shù)中心，吉林長(zhǎng)春 130062）

玉米花絲（Zea maysL.）又稱玉蜀黍花、玉米須，是玉米雌穗花柱和柱頭的統(tǒng)稱。玉米花絲中富含多糖、多酚、有機(jī)酸和生物堿等成分[1]，具有促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)[2]、抗氧化[3]、增強(qiáng)免疫力[4]、抗疲勞[5]、降血糖[6]、抗癌抑瘤[7?8]和抑菌[9]等生理活性。玉米花絲多酚是玉米花絲重要活性成分之一，研究人員從中分離出了兒茶素、表兒茶素、原花青素等多種物質(zhì)[10?11]，具有抗氧化、降血壓[12?13]、保護(hù)神經(jīng)[14]等功能活性。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)玉米花絲多酚主要開(kāi)展了分離提取及抗氧化活性評(píng)價(jià)等研究。多酚常見(jiàn)的提取方法主要有溶劑提取法、超聲波輔助提取法[15]、超臨界CO2萃取法[16]、酶解提取法[17]和亞臨界水萃取法[18]等，其中超聲波以其高效簡(jiǎn)便、綠色安全等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[19?20]。李靜等[21]、侯敏娜等[22]開(kāi)展了超聲波輔助提取玉米須多酚的工藝研究，但玉米花絲品種不明確，對(duì)于玉米花絲多酚的抑菌活性研究鮮有報(bào)道。

本文首次以甜糯玉米品種墾糯1 號(hào)玉米花絲為主要原料，考察超聲波頻率、超聲波功率、超聲波溫度和超聲波時(shí)間各因素對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，并初步探討玉米花絲多酚對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性，為進(jìn)一步深入研究品種對(duì)玉米花絲成分構(gòu)成的影響奠定研究基礎(chǔ)，同時(shí)為糯性玉米品種花絲資源的高附加值利用提供必要的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米花絲 墾糯1 號(hào) 實(shí)驗(yàn)室提供；大腸桿菌（E.coliATCC8739），金黃色葡萄球菌（S.aureusATCC12600） 實(shí)驗(yàn)室提供；沒(méi)食子酸（分析純（98.5%）、福林酚（分析純98%）、無(wú)水碳酸鈉（分析純99.8%）、無(wú)水乙醇（分析純99%） 上海源葉生物科技有限公司。

101A-1ET 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海試驗(yàn)儀器廠有限公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；Allegra X-30R 高速離心機(jī) 美國(guó)Beckman 公司；KQ3200DB 型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；JK-3200B 型超聲波清洗器 合肥金尼克機(jī)械制造有限公司；FLUO star Omega 型全自動(dòng)酶標(biāo)儀 德國(guó) BMG 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多酚提取工藝 將玉米花絲清洗干凈，烘干至恒重，粉碎過(guò)100 目篩。稱取1.0 g 玉米花絲粉，在一定液料比、乙醇濃度、超聲波頻率、超聲波功率、超聲波溫度和超聲波時(shí)間的條件下，提取3 次，離心過(guò)濾后取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮樣品，蒸餾水定容至50 mL，待測(cè)。

1.2.2 多酚含量的測(cè)定

1.2.2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 制備1 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 定容至10 mL，得到質(zhì)量濃度為0、10、20、30、40、50、60 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液各 50 μL，依次加入 200 μL 雙蒸水和250 μL 福林酚工作液，室溫下避光靜置 5 min 后加入 250 μL 10% 無(wú)水碳酸鈉溶液，再置于室溫下避光反應(yīng) 1 h，隨后測(cè)定其在波長(zhǎng) 765 nm 處的吸光度值。以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到線性回歸方程y=0.0056x+0.0756，其中R2= 0.9995。

1.2.2.2 玉米花絲多酚含量的測(cè)定 按照1.2.1 中的方法提取玉米花絲多酚，含量測(cè)定方法同標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算公式如下：

式中，C—玉米花絲多酚的質(zhì)量濃度，mg/mL；V—提取液體積，mL；N—稀釋倍數(shù)；M—玉米花絲粉質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 液料比對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響 在乙醇濃度60%，超聲波頻率40 kHz，超聲波功率300 W，超聲波溫度60 ℃，超聲波時(shí)間40 min 條件下，考察液料比為10:1、20:1、30:1、40:1、50:1 時(shí)對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響。

1.2.3.2 乙醇濃度對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響在液料比30:1，超聲波頻率40 kHz，超聲波功率300 W，超聲波溫度60 ℃，超聲波時(shí)間40 min 條件下，考察乙醇濃度為40%、50%、60%、70%、80%時(shí)對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響。

1.2.3.3 超聲波頻率對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響

在液料比30:1，乙醇濃度60%，超聲波功率300 W，超聲波溫度60 ℃，超聲波時(shí)間40 min 條件下，考察超聲波頻率為30、35、40、45、50 kHz 時(shí)對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響。

1.2.3.4 超聲波功率對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響

在液料比30:1，乙醇濃度60%，超聲波頻率40 kHz，超聲波溫度60 ℃，超聲波時(shí)間40 min 條件下，考察超聲波功率為100、200、300、400、500 W 時(shí)對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響。

1.2.3.5 超聲波溫度對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響

在液料比30:1，乙醇濃度60%，超聲波頻率40 kHz，超聲波功率300 W，超聲波時(shí)間40 min 條件下，考察超聲波溫度為40、50、60、70、80 ℃時(shí)對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響。

1.2.3.6 超聲波時(shí)間對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響

在液料比30:1，乙醇濃度60%，超聲波頻率40 kHz，超聲波功率300 W，超聲波溫度60 ℃條件下，考察超聲波時(shí)間20、30、40、50、60 min 時(shí)對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 利用Design Expert 10，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選定A 超聲波頻率、B 超聲波功率、C 超聲波溫度、D 超聲波時(shí)間，進(jìn)行4 因素3 水平響應(yīng)面試驗(yàn)。因素及水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素和水平Table 1 Levels and factors of response surface methodology

1.2.5 玉米花絲多酚抑菌活性測(cè)定

1.2.5.1 最小抑菌濃度的測(cè)定 采用二倍梯度稀釋法[23]，并稍加修改。取分別稀釋至106CFU/mL 的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌液，加入到無(wú)菌的96 孔板中，梯度稀釋使得大腸桿菌每孔的多酚抑菌液終濃度為10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL，金黃色葡萄球菌每孔的多酚抑菌液終濃度為8、4、2、1、0.5 mg/mL，將96 孔板放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以肉眼觀察到無(wú)明顯沉淀為最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。

1.2.5.2 抑菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 參考盧彩會(huì)[24]的方法，并稍加修改。分別取稀釋至106CFU/mL 的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌液，將不同質(zhì)量濃度的玉米花絲多酚溶液（終濃度分別為0、1、2、4 MIC）加入試管中，在最適溫度下振蕩培養(yǎng)24 h，每隔1 h 測(cè)定菌液在600 nm 處的吸光度值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用 Origin2017 和Design Expert.10 進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和繪圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 液料比對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響 圖1為液料比對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響。從圖中可以看出隨著液料比的增大，使得玉米花絲與提取劑的接觸面積增大，多酚類(lèi)物質(zhì)能更加充分的從物料中溶出，因此玉米花絲多酚的提取量也逐漸增大，且當(dāng)液料比為30:1 時(shí)，多酚提取量達(dá)到最大；但當(dāng)提取劑與玉米花絲的比例繼續(xù)增加，多酚提取量反而稍有降低，這是由于當(dāng)液料比為30:1 時(shí)，玉米花絲中的多酚成分已基本溶出，因此即使繼續(xù)增加液料比，也不會(huì)提高多酚的提取量，而因?yàn)槿軇┑脑龆啵率褂衩谆ńz中其它醇溶性成分的溶出，阻礙了多酚成分的溶出[25]。

圖1 液料比對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響Fig.1 The effect of liquid-solid ratio on extraction amount of corn silk polyphenols

2.1.2 乙醇濃度對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響 圖2為乙醇濃度對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響。從圖中可以看出在乙醇濃度達(dá)到60%之前，隨著乙醇濃度的增加，玉米花絲多酚的提取量持續(xù)增大，且當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，多酚提取量最高，此時(shí)為13.13 mg/g，但隨著乙醇濃度的繼續(xù)增加，玉米花絲多酚提取量不再繼續(xù)增加，這是因?yàn)楫?dāng)乙醇濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致極性降低，因此會(huì)抑制多酚類(lèi)物質(zhì)從玉米花絲中提出，且乙醇濃度越高，成本越高[26]。因此最終確定乙醇提取劑的濃度為60%。

圖2 乙醇濃度對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on extraction amount of corn silk polyphenols

2.1.3 超聲波頻率對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響圖3 為超聲波頻率對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響。從圖中可以看出隨著超聲波頻率的增大，玉米花絲多酚提取量也隨之增大，且當(dāng)超聲波頻率為40 kHz時(shí)，多酚提取量達(dá)到最大，但當(dāng)超聲波頻率大于40 kHz時(shí)，玉米花絲多酚的提取量卻逐漸降低。這是因?yàn)槌暡l率產(chǎn)生的空化作用，擊碎效應(yīng)等隨著超聲波頻率的增加而強(qiáng)度增大，使得細(xì)胞壁破碎速度加快，玉米花絲細(xì)胞分子內(nèi)部間隙增大，增加了多酚的溶出速率，但隨著超聲波頻率的繼續(xù)增大，多酚物質(zhì)的結(jié)構(gòu)遭到破壞，反而降低了提取量[27]。

圖3 超聲波頻率對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響Fig.3 The effect of ultrasonic frequency on extraction amount of corn silk polyphenols.

2.1.4 超聲波功率對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響圖4 為超聲波功率對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響。從圖中可以看出在超聲波功率達(dá)到300 W 之前，隨著超聲波功率的增大，玉米花絲多酚提取量也隨之增加，并且當(dāng)功率為300 W 時(shí)，玉米花絲多酚的提取量最大，此時(shí)為13.15 mg/g。這是因?yàn)殡S著超聲波功率的增強(qiáng)，超聲所產(chǎn)生的空化效應(yīng)增強(qiáng)，有效促進(jìn)了溶劑向花絲細(xì)胞內(nèi)部的擴(kuò)散，使得細(xì)胞內(nèi)的多酚成分可以充分溶出[28]，并在超聲波功率為300 W 時(shí)，玉米花絲多酚具有最高的提取量，但隨著超聲波功率的繼續(xù)升高時(shí)，過(guò)強(qiáng)的空化效應(yīng)反而會(huì)破壞多酚物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取量的稍有降低。

圖4 超聲波功率對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響Fig.4 The effect of ultrasonic power on extraction amount of corn silk polyphenols

2.1.5 超聲波溫度對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響圖5 為超聲波溫度對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響。從圖中可以看出在溫度達(dá)到60 ℃之前，超聲波溫度的升高可以有效促進(jìn)多酚的溶出，當(dāng)超聲波溫度為60 ℃時(shí)，多酚提取量最高，為13.10 mg/g，但隨著超聲波溫度繼續(xù)升高時(shí)，玉米花絲多酚的提取量卻有所降低。這是由于超聲場(chǎng)強(qiáng)工作時(shí)會(huì)產(chǎn)生一定的熱效應(yīng)，加之過(guò)高的提取溫度，會(huì)造成局部高溫，導(dǎo)致多酚的分解[29]，致使玉米花絲多酚提取量有所降低。

圖5 超聲波溫度對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響Fig.5 The effect of ultrasonic temperature on extraction amount of corn silk polyphenols

2.1.6 超聲波時(shí)間對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響圖6 為超聲波時(shí)間對(duì)玉米花多酚提取量的影響。從圖中可以看出隨著超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng)，且當(dāng)處理時(shí)間少于40 min，多酚提取量與超聲波處理時(shí)間呈正相關(guān)，當(dāng)超聲波時(shí)間為40 min 時(shí)，多酚具有最高的提取量。這是因?yàn)槭褂贸暡ㄌ幚砘ńz的時(shí)間越長(zhǎng)，使得花絲可以與提取劑更加充分的接觸，并伴隨超聲波產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)，使得玉米花絲多酚可以有效地從花絲中釋放出來(lái)，因此在提取時(shí)間為40 min 時(shí)，多酚提取量最大為13.20 mg/g，但同樣由于過(guò)長(zhǎng)的處理時(shí)間，會(huì)伴隨著其它因素的影響，對(duì)多酚結(jié)構(gòu)具有一定的破壞作用[30]，因此提取量有所降低。

圖6 超聲波時(shí)間對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響Fig.6 The effect of ultrasonic time on extraction amount of corn silk polyphenols

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

以玉米花絲多酚提取率為響應(yīng)值，選定A 超聲波頻率、B 超聲波功率、C 超聲波溫度、D 超聲波時(shí)間，進(jìn)行4 因素3 水平響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and experimental results

2.2.1 模型建立與顯著性分析 由Design Expert.10軟件分析得到響應(yīng)面回歸擬合方程如下：多酚提取量（mg/g）=13.36+1.26A+0.28B+0.19C+0.46D?0.088AB?0.19AC?0.18AD+0.075BC?0.18BD?0.12CD?1.20A2?0.54B2?0.52C2?0.75D2

方差分析如表3 所示。從表中可以看出，模型F值為130.85，P值小于0.0001，模型擬合度較高，說(shuō)明模型可以很好地反應(yīng)各因素對(duì)響應(yīng)值的影響；失擬項(xiàng)P值為0.8299，大于0.05，表明非試驗(yàn)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較??；模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9924，R2adj=0.9848 和R2pre=0.9705 的差值小于0.2，再次說(shuō)明模型的合理性，變異系數(shù)CV=1.14%，精密度38.642，表明模型可靠。各因素對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響極顯著，其中交互項(xiàng)其中交互項(xiàng)AC、AD、BD 對(duì)提取量影響顯著（0.01D>B>C，即超聲波頻率影響最大，依次為超聲波時(shí)間、超聲波功率和超聲波溫度。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis.

如圖7 所示為利用回歸模型得到的對(duì)玉米花絲多酚提取量影響顯著的AC、AD、BD 的響應(yīng)面圖和等高線圖，從圖中可以看出各因素交互作用均為開(kāi)口向下的平滑曲面，其中超聲頻率和超聲溫度，超聲頻率和超聲時(shí)間，超聲功率和超聲時(shí)間三組交互響應(yīng)面彎曲程度較大，說(shuō)明這三組交互因素對(duì)玉米花絲多酚提取量的影響顯著，這也與方差分析結(jié)果一致。

圖7 各因素交互作用對(duì)玉米花絲多酚提取量影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface diagram of the interaction of various factors on the extraction amount of corn silk polyphenols

2.2.2 試驗(yàn)驗(yàn)證 由模型分析結(jié)果，預(yù)測(cè)玉米花絲多酚最佳提取工藝為超聲波頻率42.465 kHz，超聲波功率350.1 W，超聲波溫度56.17 ℃，超聲波時(shí)間45.37 min，此時(shí)玉米花絲多酚提取量為13.502 mg/g。根據(jù)實(shí)際情況，調(diào)整提取條件為：超聲波頻率40 kHz，超聲波功率350 W，超聲波溫度56 ℃，超聲波時(shí)間45 min，得到玉米花絲多酚提取量為（13.31±0.12） mg/g，與預(yù)測(cè)結(jié)果相近，說(shuō)明模型擬合效果良好。

2.3 玉米花絲多酚抑菌活性結(jié)果分析

2.3.1 最小抑菌濃度的測(cè)定 表4 為玉米花絲多酚對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度。從中可以看出，玉米花絲多酚對(duì)大腸桿菌的MIC 為2.5 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC 為2 mg/mL，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的代表菌種，表明玉米花絲多酚對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有更強(qiáng)的抑制活性。

表4 玉米花絲多酚對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度Table 4 minimum inhibitory concentration of corn silk polyphenols against Escherichia coli and Staphylococcus aureus

2.3.2 玉米花絲多酚對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響 圖8 為不同濃度玉米花絲多酚對(duì)兩種供試菌生長(zhǎng)曲線的影響。圖（A）為不同濃度玉米花絲多酚對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響，從圖中可以看出，與對(duì)照組相比，1 MIC 玉米花絲多酚處理的大腸桿菌出現(xiàn)生長(zhǎng)遲滯現(xiàn)象，將大腸桿菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間從5 h 延長(zhǎng)至7 h；2 MIC 的玉米花絲多酚處理的大腸桿菌則未出現(xiàn)典型的生長(zhǎng)周期現(xiàn)象。圖（B）為不同濃度玉米花絲多酚對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響，與大腸桿菌相似，玉米花絲多酚對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制情況也呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。其中，1 MIC 玉米花絲多酚可將金黃色葡萄球菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間從5 h 延長(zhǎng)至7 h；2 MIC 玉米花絲多酚可將其進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間延長(zhǎng)至9 h。當(dāng)玉米花絲多酚濃度達(dá)到4 MIC 時(shí)，兩種供試菌的生長(zhǎng)均完全受到抑制。

圖8 玉米花絲多酚對(duì)兩種供試菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.8 The effects of corn silk polyphenols on growth curves of two tested bacteria

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以墾糯1 號(hào)玉米花絲為主要原料，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上優(yōu)化超聲波輔助提取玉米花絲多酚工藝，得到最佳超聲波輔助提取玉米花絲多酚的工藝條件為：超聲波頻率40 kHz，超聲波功率350 W，超聲波溫度56 ℃，超聲波時(shí)間45 min，此時(shí)得到玉米花絲多酚提取率為（13.31±0.12） mg/g，與預(yù)測(cè)值接近，模型擬合效果良好。抑菌試驗(yàn)證明：玉米花絲多酚對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度分別為2.5 mg/mL 和2 mg/mL，不同濃度玉米花絲多酚對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定的抑制效果，且當(dāng)玉米花絲多酚濃度為4 MIC 時(shí)，可以達(dá)到完全抑制其生長(zhǎng)的效果，證明玉米花絲多酚可作為天然的抑菌劑，也為糯性玉米品種花絲資源的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。