內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在深靜脈血栓小鼠中的作用

唐茂舜 朱車甫 陳東祥 鄭 義 李建平

1.中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院 （光明）神經(jīng)外科，廣東深圳 518106；2.中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院 （光明）介入手術(shù)室，廣東深圳 518106；3.中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院 （光明）醫(yī)學(xué)實驗中心，廣東深圳 518106；4.中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院 （光明）心血管內(nèi)科，廣東深圳 518106

深靜脈血栓（deep venous thrombosis，DVT）是一種繼心腦血管疾病之后最為常見的外周血管疾病，多發(fā)生在下肢，可繼發(fā)于手術(shù)、創(chuàng)傷、惡性腫瘤、既往的深靜脈血栓史等[1-2]。目前DVT的診斷主要還是通過患者的臨床癥狀并借助輔助檢查實現(xiàn)的，治療上主要是采用抗凝藥物、溶栓及手術(shù)取栓等綜合手段，但這些措施并不能完全消除血栓形成后的一些癥狀[3-4]。年齡、肥胖、吸煙、靜脈曲張等是DVT形成的危險因素，這些危險因素互相作用，致使血流滯緩，血管內(nèi)皮缺氧缺血受損，血液凝度高，進而促使DVT發(fā)生[5-6]。而且目前研究認為靜脈內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)和功能的紊亂是DVT形成的始動因素[7]，特別是氧化應(yīng)激引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)是血管內(nèi)皮損傷的重要原因[8]。因此探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在DVT形成過程中的作用對于DVT的發(fā)病機制及治療將具有重要意義。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

32只清潔級C57BL/6小鼠購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2016-0002。

1.2 實驗試劑與儀器

蘇木素染液、伊紅染色液均購于武漢博士德生物科技有限公司，批號：AR11800-1、AR11800-2；Scott藍化液購于Solarbio公司，批號：G1865；Trizon Reagent購于北京康為世紀生物科技有限公司，批號：CW0580S；TUNEL檢測試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C1088；放射免疫沉淀法（RIPA）細胞裂解液購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號C1053；兔抗糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、X盒結(jié)合蛋白1（XBP1）、CCAAT增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）多克隆抗體購于Affinity公司，批號：DF6025、AF5110、AF5366，稀釋度均為1/1000；兔抗天冬氨酸水解蛋白酶3（cleaved caspase 3）多克隆抗體購于美國Abcam公司，批號：ab2302，稀釋度1/1000；辣根酶標記山羊抗兔IgG（H+L）購于北京中杉金橋生物科技有限公司，批號：ZB-2301。D1008E微型離心機購于SCJLOGEX；UV-1600PC紫外可見分光光度計購于上海美譜達儀器有限公司；TGL-16G低溫高速離心機購于常州中捷實驗儀器制造有限公司；Chemi DocTM XRS+超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購于伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；DYY-6C蛋白垂直電泳儀購于北京市六一儀器廠。

1.3 實驗分組及造模

將32只小鼠隨機分為正常組、假手術(shù)組、模型組，正常組10只，假手術(shù)組及模型組各11只，其中各1只用于模型驗證。模型組：小鼠按0.08 ml/10 g腹腔注射麻醉劑（5%水合氯醛），小鼠麻醉起效后，腹部剃毛，小鼠仰臥位放置在手術(shù)操作臺上，消毒腹部，逐層開腹，將腸內(nèi)容物擠出位于操作者左側(cè)放置于生理鹽水潤濕的紗布上，暴露并分離下腔靜脈，將分離出的下腔靜脈與動脈同造模針頭（直徑0.3 mm，注射器針頭）一起用4-0醫(yī)用真絲編織縫合線結(jié)扎，迅速抽出針頭，并將下腔靜脈的可見分支進行結(jié)扎，關(guān)腹。假手術(shù)組：小鼠按0.08 ml/10 g腹腔注射麻醉劑（5%水合氯醛），小鼠麻醉起效后，腹部剃毛，小鼠仰臥位放置在手術(shù)操作臺上，消毒腹部，逐層開腹，將腸內(nèi)容物擠出位于操作者左側(cè)放置于生理鹽水潤濕的紗布上，暴露并分離下腔靜脈，關(guān)腹。正常組：小鼠不做任何處理。

1.4 取樣

造模后24 h取各組小鼠下腔靜脈組織，正常組和假手術(shù)組將左腎靜脈至髂總靜脈分叉處之間的下腔靜脈段剪下，模型組小鼠取成血栓及其相應(yīng)的下腔靜脈組織，每組取3個樣本置于10%福爾馬林溶液中固定用于HE染色，Tunnel染色檢測，每組取4樣本置于-80℃中保存用于western blot檢測。

1.5 HE染色

石蠟標本經(jīng)流水沖洗數(shù)小時后，經(jīng)梯度乙醇溶液脫水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟至透明。蒸餾水洗滌后，蘇木精染色液進行染色，流水洗去染色液，1%鹽酸乙醇進行分化，稍水洗，促藍液返藍，流水沖洗，伊紅染色，蒸餾水稍洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，細胞核染藍色，細胞漿染紅色。

1.6 TUNEL染色

石蠟切片置于65℃烤箱烘烤2 h，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟，梯度乙醇脫水。按TUNEL檢測試劑盒說明書操作：切片置于濕盒中，加入Proteinase K工作液，37℃反應(yīng)30 min。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌干凈，吸水紙吸干PBS，滴加TUNEL檢測液，45℃避光孵育2 h，PBS洗滌，封片顯微鏡下觀察，綠色熒光為凋亡細胞，藍色熒光為細胞核。

1.7 western blot檢測細胞中蛋白表達

收集細胞，加入細胞裂解液于4℃搖床上作用細胞30 min，后用移液槍反復(fù)的吹打細胞20次左右，4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液。配置濃縮膠及分離膠，2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉（BCA）試劑盒檢測蛋白濃度并定量，30 μg蛋白樣品上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳直至目的蛋白分離，轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯膜30 min。5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，一抗溶液4℃過夜孵育，次日室溫孵育二抗，將化學(xué)發(fā)光試劑加于膜上，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光，并分析目的蛋白條（GRP78、XBP1、CHOP 及cleaved caspase 3）帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用SNK法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠HE染色結(jié)果

正常組及假手術(shù)組小鼠下腔靜脈無血栓形成，血管內(nèi)膜表面光滑、平整。模型組下腔靜脈有混合血栓，主要為均勻分布的紅細胞，紅細胞之間有纖維素網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并有白細胞、血小板散在；血管內(nèi)皮細胞不連續(xù)，靜脈周圍有大量炎癥細胞聚集。見圖1。

圖1 各組小鼠靜脈組織HE染色結(jié)果（×200）

2.2 各組小鼠TUNEL實驗結(jié)果

與正常組（2.35±0.13）%及假手術(shù)組（2.76±0.11）%比較，模型組小鼠靜脈內(nèi)皮細胞凋亡率（32.58±0.43）%上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=12 776.949，P=0.000）。見圖2。

圖2 各組小鼠靜脈組織TUNEL染色結(jié)果（×200）

2.3 各組小鼠靜脈組織中GRP78、XBP1、CHOP及cleaved caspase 3表達測定結(jié)果

與正常組及假手術(shù)組比較，模型組小鼠靜脈組織中GRP78、XBP1、CHOP及cleaved caspase 3蛋白表達量上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3、表1。

圖3 各組小鼠靜脈組織中GRP78、XBP1、CHOP及cleaved caspase 3表達測定結(jié)果

表1 各組小鼠靜脈組織中GRP78、XBP1、CHOP及cleaved caspase 3表達測定結(jié)果（±s）

表1 各組小鼠靜脈組織中GRP78、XBP1、CHOP及cleaved caspase 3表達測定結(jié)果（±s）

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3 討論

本研究通過小鼠下腔靜脈狹窄法構(gòu)建小鼠DVT模型，造模24 h后，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠腹腔內(nèi)腸系膜靜脈明顯擴張，管壁顏色變暗，結(jié)扎處下方血管明顯腫脹，管壁顏色變暗，血管內(nèi)有血凝塊，HE染色發(fā)現(xiàn)模型組小鼠管內(nèi)充滿血栓，血管內(nèi)皮細胞不連續(xù)，靜脈周圍有大量炎癥細胞聚集，這些研究結(jié)果與文獻報道基本一致[9]，也符合人體DVT急性期的病理表現(xiàn)[10]，說明本研究的造模成功。接著通過TUNEL實驗發(fā)現(xiàn)模型組小鼠下腔靜脈TUNEL陽性率高于正常組及假手術(shù)組，說明內(nèi)皮細胞的凋亡在小鼠DVT的形成過程中發(fā)揮重要作用，但具體是由何機制所誘導(dǎo)的，本研究將進一步探討。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）是真核細胞中重要的細胞器，對膜蛋白、分泌蛋白的折疊與加工，鈣的儲存與釋放具有重要調(diào)節(jié)作用，因此對細胞正常功能的維持至關(guān)重要。所以當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白的折疊、加工過程受阻，鈣離子穩(wěn)態(tài)被打破后會使細胞發(fā)生致死性的損害。缺血缺氧、鈣超載、氧化應(yīng)激等外界刺激均會使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能發(fā)生障礙，進而觸發(fā)內(nèi)質(zhì)ERS[11-13]。適度的ERS有助于未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白的清除，并促進鈣穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)，而過度的ERS導(dǎo)致未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白聚集、鈣穩(wěn)態(tài)平衡被打破，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負荷，并引起細胞凋亡。ERS主要通過激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、需肌醇酶1（IRE1）、活化轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）等3條信號通路發(fā)揮作用。在正常生理條件下，糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）通過與PERK、IRE1、ATF6結(jié)合形成復(fù)合物，阻斷這些信號通路的傳遞。但在應(yīng)激條件下，GRP78從復(fù)合物中解離出來，與未折疊或錯誤折疊蛋白結(jié)合，使得這些蛋白無法從ER中輸出，同時這些信號通路被激活。其中激活的IRE1活化X盒結(jié)合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP1），活化的XBP1激活CCAAT增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）凋亡途徑，最終將信號傳遞給Caspase家族，誘導(dǎo)細胞凋亡。而且非晶態(tài)二氧化硅納米顆粒（SiNPs）處理的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs），線粒體腫脹，內(nèi)皮細胞凋亡，ER染色加強，GRP78、XBP1、CHOP、Capase-12表達量均上調(diào)，繼而提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡途徑可能是SiNPs誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡的機制之一[14]。所以說GRP78從跨膜蛋白上解離是ERS啟動的第一步，因此GRP78在細胞內(nèi)的高表達提示ERS的開始[15]。本研究通過western blot實驗發(fā)現(xiàn)模型組較正常組及假手術(shù)組靜脈組織中GRP78蛋白表達量上調(diào)，預(yù)示著ERS的開始促進了DVT的形成。另外本研究western blot實驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)模型組中XBP1、CHOP蛋白表達量均上調(diào)，western blot實驗結(jié)果表明DVT小鼠靜脈組織中cleaved caspase 3蛋白表達量較正常組及假手術(shù)組上調(diào)，說明GRP78、XBP1、CHOP、cleaved caspase 3介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)所誘導(dǎo)的小鼠內(nèi)皮細胞凋亡是小鼠DVT形成的重要原因。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡是小鼠DVT形成的重要原因，且此過程是通過GRP78、XBP1、CHOP、cleaved caspase 3信號進行傳導(dǎo)的，但具體是如何進一步的調(diào)控有待于本課題組下一步研究。