基于生物信息學(xué)探討芍藥甘草湯作用機(jī)制

劉嫣然 施春英 李玲

摘要：基于生物信息學(xué)方法，探究了芍藥甘草湯治療疾病關(guān)鍵基因和通路。采用中藥網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)（TCMSP）、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)搜索芍藥甘草湯的靶點(diǎn)和TN（三叉神經(jīng)痛）對(duì)應(yīng)的所有靶點(diǎn);利用細(xì)胞圖譜3.7.2軟件構(gòu)建了“藥物—成分—疾病—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖并對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG分析。研究結(jié)果表明，TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索得到芍藥甘草湯活性成分106個(gè)，IL1B、VEGFA、MAPK8等是芍藥甘草湯治療三叉神經(jīng)痛的核心靶點(diǎn)，揭示了芍藥甘草湯治療三叉神經(jīng)痛的作用機(jī)制。

關(guān)鍵詞：生物信息學(xué);網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);芍藥甘草湯;潛在機(jī)制

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1006-1037（2021）03-0063-08

芍藥甘草湯是由白芍、甘草組成，具有柔肝、緩急止痛的功效，其中白芍具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、柔肝止痛、平抑肝陽(yáng)的功效，甘草具有健脾益氣、清熱解毒、化痰止咳、止痛的功效[1]。現(xiàn)代臨床研究表明，芍藥甘草湯具有顯著的解痙、抗炎、鎮(zhèn)痛、止咳、平喘、抗過敏、抗病毒、保肝利膽的功效，在臨床中常應(yīng)用治療多種疼痛性疾病、痙攣性疾病、炎癥性疾病、帕金森病及支氣管哮喘[2]。張傳江[3]運(yùn)用芍藥甘草湯治療90例三叉神經(jīng)痛患者疼痛及睡眠質(zhì)量的影響，有效改善三叉神經(jīng)痛患者疼痛情況，提高睡眠質(zhì)量。隨著中醫(yī)藥的不斷深入研究和發(fā)展[4]，芍藥甘草湯在臨床中用于治療三叉神經(jīng)痛的療效和應(yīng)用價(jià)值逐漸被認(rèn)可[5]。生物信息學(xué)是一門利用生物學(xué)、信息學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等技術(shù)將生物信息進(jìn)行采集、處理、存儲(chǔ)、傳播，分析和解釋生物信息以探索生命的學(xué)科[6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是綜合基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)的一門新興的學(xué)科[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為搜索和檢索傳統(tǒng)中藥提供了一整套系統(tǒng)的方法，在搜集活性成分、預(yù)測(cè)中藥靶點(diǎn)及機(jī)制、創(chuàng)新藥物等方面產(chǎn)生重要影響[8]。利用生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)對(duì)中藥的復(fù)方和單體進(jìn)行研究成為了近年來研究熱點(diǎn)和國(guó)自然基金重點(diǎn)扶持領(lǐng)域。本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)的方法分析出了藥物的活性成分并預(yù)測(cè)其關(guān)鍵靶點(diǎn)[9]，揭示了芍藥甘草湯治療三叉神經(jīng)痛的關(guān)鍵通路及潛在作用機(jī)制，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供參考。

1 方法

1.1 芍藥甘草湯活性成分檢索

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索芍藥甘草湯的活性成分，在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)定口服利用度（OB）≥30、類藥性（DL）≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn);在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.swisstargetprediction.ch/）預(yù)測(cè)芍藥甘草湯的潛在靶點(diǎn);將上述得到的芍藥甘草湯的靶點(diǎn)導(dǎo)入至Uniprot（https：//www.unitprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2 TN疾病相關(guān)靶點(diǎn)獲取

以“trigeminal neuralgia”為關(guān)鍵詞在OMIM（http：//www.omim.org/）和GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，得到與TN有關(guān)的疾病靶點(diǎn)。

1.3 芍藥甘草湯治療TN的潛在靶點(diǎn)

運(yùn)用Venn（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在線平臺(tái)獲取芍藥甘草湯與TN靶點(diǎn)的交集部分，得到芍藥甘草湯治療TN的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 藥物—成分—疾病—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

將芍藥甘草湯的活性成分及靶點(diǎn)、以及“藥物—疾病”交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建“藥物—成分—疾病—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，其中節(jié)點(diǎn)代表藥物、活性成分、靶點(diǎn)、疾病，邊代表芍藥甘草湯活性成分與疾病、疾病與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將上述得到的“藥物—疾病”交集靶點(diǎn)導(dǎo)至STRING（http：//string-db.org）數(shù)據(jù)庫(kù)，并將物種限定為人（Homo sapiens），運(yùn)用String數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系。將STRING數(shù)據(jù)庫(kù)得到的數(shù)據(jù)以tsv格式導(dǎo)入至Cytoscape3.7.2軟件中，根據(jù)節(jié)點(diǎn)度值（Degree）大于平均值作為篩選條件，得到芍藥甘草湯治療TN的核心靶點(diǎn)。

1.6 GO生物過程和KEGG通路富集分析

運(yùn)用David（https：//david.ncifcrf.gov/）在線平臺(tái)對(duì)“藥物—疾病”的交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物過程和KEGG通路的富集分析。并以P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，然后將篩選得到的生物過程導(dǎo)入至OmicShare平臺(tái)，進(jìn)行數(shù)據(jù)的可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 芍藥甘草湯活性成分收集

通過TCMSP在線平臺(tái)檢索得到芍藥甘草湯的所有活性成分，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到芍藥甘草湯活性成分106個(gè)，其中白芍13個(gè)，甘草93個(gè)，具體見表1，刪除重復(fù)值后得到芍藥甘草湯靶點(diǎn)共計(jì)130個(gè)。

2.2 芍藥甘草湯與TN交集靶點(diǎn)Venn圖

通過OMIM和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索TN的靶點(diǎn)刪除重復(fù)值后共249個(gè)，將得到的藥物靶點(diǎn)映射到疾病靶點(diǎn)中，獲得25個(gè)交集靶點(diǎn)，制成Venn圖，如圖1，說明芍藥甘草湯可能通過以上靶點(diǎn)參與治療TN。

2.3 藥物—成分—疾病—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將上述得到的藥物活性成分及靶點(diǎn)、“藥物—疾病”的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入至Cytoscape3.7.2軟件中，構(gòu)建“藥物—成分—疾病—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。圖2中共有243個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中“菱形”代表白芍的活性成分，“圓形”代表甘草的活性成分，“V形”代表靶點(diǎn)。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

將Venn圖獲得的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，將物種限定為“人”（homo sapiens），得到25個(gè)節(jié)點(diǎn)，129條邊，平均節(jié)點(diǎn)數(shù)為10.3，制成PP2網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3;將STRING數(shù)據(jù)以TSV格式導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件中，以Degree值大于11作為篩選標(biāo)準(zhǔn)條件得藥物治療疾病的核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4，主要包括IL1B、VEGFA、MAPK8、MAPK1、PTGS2、JUN、CCL2等，提示芍藥甘草湯中的主要活性成分芍藥苷、谷甾醇、β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、甘草黃酮可能通過以上靶點(diǎn)參與治療三叉神經(jīng)痛。

2.5 GO富集結(jié)果分析

對(duì)芍藥甘草湯治療TN的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物功能分析，以P<0.05和FDR<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到GO生物條目148條，其中生物過程109條，分子功能23條，細(xì)胞組分16條，其中BP主要涉及一氧化氮生物過程的正調(diào)控（positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）、對(duì)藥物的反應(yīng)（response to drug）、ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)的正向調(diào)節(jié)（positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade）等，CC主要涉及神經(jīng)元投射（neuron projection）、細(xì)胞外空間（extracellular space）等，MF主要包括酶結(jié)合（enzyme binding）、單胺跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性（monoamine transmembrane transporter activity）、蛋白質(zhì)同二聚活性（protein homodimerization activity）等。說明芍藥甘草湯的活性成分可能通過以上生物過程參與治療TN。按P值降序排列，制成氣泡圖展示，見圖5、6、7。

2.6 KEGG通路富集分析

采用2.5節(jié)同樣的方法富集分析得到44條KEGG通路（P<0.05，F(xiàn)DR<0.05），靶基因主要富集在癌癥信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路以及ErbB信號(hào)通路等信號(hào)通路中，說明芍藥甘草湯的潛在靶點(diǎn)可能通過調(diào)控以上通路參與治療TN。按P值降序排列，將篩選出的前20條信號(hào)通路制成表格展示見表2。

3 討論

三叉神經(jīng)痛被歸屬于“頭風(fēng)”、“偏頭痛”范疇[10]，病因多由于外感風(fēng)寒或風(fēng)熱，肝郁氣滯阻滯經(jīng)絡(luò)，不通則痛[11]，芍藥甘草湯具有滋陰柔肝、緩慢急迫止痛的功效，在臨床中常用于治療各種緩急疼痛[12]。李伯英[11]利用芍藥甘草湯加減治療三叉神經(jīng)痛患者，其臨床總有效率97.1%，說明芍藥甘草湯加減能夠有效減輕三叉神經(jīng)痛患者的臨床癥狀，且疾病肺的復(fù)發(fā)率低，值得推廣和應(yīng)用。但由于中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，作用機(jī)制較為復(fù)雜，因此本文運(yùn)用生物信息學(xué)方法探討芍藥甘草湯治療TN的作用機(jī)制，以期為實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供理論依據(jù)。

本文通過檢索TCMSP得到芍藥甘草湯活性成分106個(gè)，包括芍藥苷、谷甾醇、β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、甘草黃酮等。洪嘉琪等[13]通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷可以通過抑制炎癥因子的釋放和抑制Akt-NF-κB信號(hào)的激活減輕疼痛，且具有助眠作用[14]，因此芍藥苷可以有效減輕三叉神經(jīng)痛患者的疼痛及疼痛帶來的失眠癥狀。神經(jīng)性疼痛多與炎癥反應(yīng)有關(guān)，槲皮素可以通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路，影響脊髓中炎癥因子的水平發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[15]，因此槲皮素可以抑制相關(guān)炎癥因子的激活治療三叉神經(jīng)痛。芍藥中的芍藥總苷和甘草中的甘草黃酮協(xié)同作用可以下調(diào)Sirt1蛋白的表達(dá)[16]，減輕神經(jīng)疼痛。說明芍藥甘草湯中的多個(gè)活性成分可以協(xié)同參與治療三叉神經(jīng)痛。

通過圖4分析發(fā)現(xiàn)，芍藥甘草湯中的活性成分主要通過IL1B、VEGFA、MAPK8、MAPK1、PTGS2、JUN、CCL2等核心靶點(diǎn)治療三叉神經(jīng)痛。IL1B是一種可以調(diào)節(jié)肌肉疼痛的炎性因子，可以誘導(dǎo)前列腺素的產(chǎn)生而發(fā)生疼痛反應(yīng)，因此抑制ILIB炎癥因子可以拮抗疼痛癥狀[17]。VEGFA是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，其參與血管新生[18]，可以與VEGFA-2受體結(jié)合激活TRPV1和TRPA1通路，保護(hù)感覺神經(jīng)元的疼痛信號(hào)傳遞[19]。前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2（PTGS2）可以參與調(diào)節(jié)疼痛生理病理過程，IRE1αlpha-XBP1可以通過調(diào)節(jié)PTGS2的表達(dá)參與調(diào)節(jié)疼痛反應(yīng)[20]。研究發(fā)現(xiàn)趨化因子2（CCL2）參與慢性疼痛，巨噬細(xì)胞病理性神經(jīng)疼痛的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要作用，CCL2可能引起致痛因子的釋放，作用于感覺神經(jīng)元。因此，提前去除巨噬細(xì)胞可以緩解由CCL2引起的熱痛覺過敏和機(jī)械痛覺過敏[21]。以上研究證實(shí)芍藥甘草湯中的多個(gè)活性成分可以通過多靶點(diǎn)參與治療三叉神經(jīng)痛。

通過富集分析發(fā)現(xiàn)芍藥甘草湯主要通過一氧化氮生物過程的正調(diào)控、對(duì)藥物的反應(yīng)、ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)的正向調(diào)節(jié)、神經(jīng)元投射、細(xì)胞外空間、酶結(jié)合、單胺跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、蛋白質(zhì)同二聚活性等GO生物過程協(xié)同參與治療三叉神經(jīng)痛。KEGG通路富集發(fā)現(xiàn)靶基因主要富集于癌癥信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、E rbB信號(hào)通路等信號(hào)通路中。TNF信號(hào)通路中炎癥因子主要是TNF-α，研究表明TNF-α是參與疼痛的重要炎癥介質(zhì)，白芍能在一定程度上抑制TNF-α的表達(dá)[22]，因此芍藥甘草湯能在一定程度減輕三叉神經(jīng)痛。ErbB信號(hào)通路在分子水平上參與疼痛的形成和發(fā)展，因此阻斷ErbB信號(hào)通路可以干擾疼痛的產(chǎn)生[23]。疼痛的產(chǎn)生與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，研究表明HIF-1信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路等信號(hào)通路參與炎癥反應(yīng)[24]，因此抑制上述信號(hào)通路相關(guān)因子的表達(dá)可以在一定程度減輕三叉神經(jīng)痛的癥狀。進(jìn)一步證實(shí)芍藥甘草湯可以通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路參與治療三叉神經(jīng)痛。

4 結(jié)論

研究通過生物信息學(xué)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法系統(tǒng)對(duì)芍藥甘草湯治療三叉神經(jīng)痛的作用機(jī)制進(jìn)行了分析。芍藥甘草湯中的成分復(fù)雜，主要通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路參與治療TN，為后續(xù)用藥和后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供理論基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

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