小鼠甲狀腺組織常規(guī)石蠟切片制作體會(huì)

李志紅 黃書娟 王寧 崔茂香

【摘 要】常規(guī)病理石蠟切片制作技術(shù)，是病理技術(shù)中一項(xiàng)最基本、最常用的技術(shù)方法，廣泛應(yīng)用于臨床病理診斷、教學(xué)及科研工作中。根據(jù)小鼠甲狀腺組織特點(diǎn)，探索其常規(guī)病理石蠟切片制作方案，依據(jù)病理切片制作過(guò)程中常出現(xiàn)的質(zhì)量問題做出總結(jié)，提出相應(yīng)的預(yù)防和處理方法，以提高常規(guī)病理石蠟切片質(zhì)量。

【關(guān)鍵詞】小鼠；甲狀腺；石蠟切片

甲狀腺是人和動(dòng)物體內(nèi)重要的內(nèi)分泌器官，全身及自身功能的改變均可引起甲狀腺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，因此甲狀腺疾病的種類繁多。在科學(xué)研究中，常運(yùn)用小鼠制備甲狀腺疾病及治療模型，常規(guī)石蠟切片的質(zhì)量直接影響到對(duì)疾病診斷及治療效果的判斷。小鼠甲狀腺組織較人體甲狀腺組織水分含量多，體積小且稚嫩、柔軟，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[1]，選擇適合的制片方案，以做出高質(zhì)量的石蠟切片。常規(guī)石蠟切片制作歷經(jīng)取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、烤片、染色、封固十一個(gè)步驟，現(xiàn)將小鼠甲狀腺組織石蠟切片制作體會(huì)介紹如下。

1 材料與方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均選用健康balb/c小鼠，體重16g～24g，平均體重（20±2）g；10%中性甲醛緩沖溶液、常規(guī)病理制片與HE染色試劑。

1.2 方法

1.2.1 取材與固定 沿小鼠頸正中線剪開皮膚，分離皮下組織，暴露甲狀軟骨和氣管，從軟骨下插入一眼科鑷，將甲狀軟骨和氣管撐開、挑起，用眼科剪剪斷甲狀軟骨和部分氣管，在甲狀軟骨向氣管過(guò)渡的兩側(cè)緣剝離甲狀腺組織[2]，入10%中性甲醛緩沖溶液中固定。

1.2.2 脫水與透明 將固定后的組織脫水透明，具體程序：60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ脫水各30min～60min，其中95%乙醇可過(guò)夜；無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ脫水各10min～15min，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明各3min～10min。

1.2.3 浸蠟與包埋 透明后用熔點(diǎn)為56℃～58℃石蠟浸蠟，浸蠟溫度設(shè)定在58℃左右，石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ、石蠟Ⅲ浸蠟時(shí)間各5min～10min，包埋蠟溫62℃～64℃。

1.2.4切片、貼片與烤片 切片厚度4um～5um，展片水溫42℃～48℃，烤片溫度60℃～65℃，烤片時(shí)間30min～60min。

1.2.5染色與封固 共七步。脫蠟：三步二甲苯共15min～30min；脫苯至水：二步無(wú)水乙醇共10min～15min、95%乙醇3min、85%乙醇3min、70%乙醇3min、水洗1min～2min；蘇木素染色：Harris蘇木素染液5min～10min、水沖洗10s～30s；分化返藍(lán)：1%鹽酸乙醇分化5s、自來(lái)水沖洗15min～30min；伊紅染色：伊紅染液1min～2min、水分化30s；脫水透明：85%乙醇30s、二步95%乙醇共2min～5min、二步無(wú)水乙醇共5min～10min；封固：中性樹膠封片。

2 結(jié)果

切片平坦、厚薄均勻，染色細(xì)胞漿與細(xì)胞核紅藍(lán)相映，對(duì)比明顯，結(jié)構(gòu)清晰。

3 討論

小鼠甲狀腺組織石蠟切片制作存在一定困難，在操作時(shí)需要注意每一個(gè)環(huán)節(jié)。

3.1取材與固定

小鼠甲狀腺體積小，顏色與周圍組織相近，不易辨認(rèn)，取材時(shí)可用針頭挑取后及時(shí)固定[2]。10%中性甲醛緩沖溶液固定的標(biāo)本在脫水前適當(dāng)水沖洗。

3.2 脫水與透明

脫水需要徹底，組織從低濃度逐級(jí)至高濃度乙醇置換其內(nèi)水分，至無(wú)水乙醇時(shí)要控制時(shí)間，防止組織脫水不足或過(guò)量；透明宜適當(dāng)，避免組織變脆；不同級(jí)別乙醇及二甲苯濃度要保持穩(wěn)定。

3.3 浸蠟與包埋

溫度和時(shí)間是浸蠟的關(guān)鍵問題，浸蠟溫度一般設(shè)定在所選石蠟熔點(diǎn)上線，溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，甲狀腺組織可出現(xiàn)收縮、變脆，溫度過(guò)低或時(shí)間過(guò)短，石蠟在甲狀腺組織塊中將得不到充分的飽和，切片均會(huì)出現(xiàn)困難；組織包埋時(shí)，包埋石蠟的溫度要比浸蠟石蠟溫度高4℃～6℃，取出組織包埋時(shí)操作要迅速，防止組織與包埋石蠟融合不良，導(dǎo)致分離。

3.4 切片、貼片與烤片

切片前要將切片機(jī)上有關(guān)的螺旋擰緊，防止跳刀現(xiàn)象發(fā)生；一次性切片刀要選用新刀口，刀架角度要適宜，手工切片用力要均勻、一致，要輕柔、慢切[3]，必要時(shí)對(duì)蠟面進(jìn)行濕化，防止切片出現(xiàn)顫痕[4]；切出的蠟片可先在常溫水中進(jìn)行粗展，然后再放入42℃～48℃水中進(jìn)行細(xì)致展片，可適當(dāng)增加展片時(shí)間；貼片時(shí)玻片要保證其潔凈度，防止切片粘貼不牢。

3.5 染色與封固

脫蠟、脫苯、脫水、透明要徹底，脫蠟時(shí)間寧長(zhǎng)勿短；梯度乙醇水化要充分；保持染液的清潔，應(yīng)經(jīng)常過(guò)濾或更換；分化要適度，若切片分化不足，組織著色過(guò)深使細(xì)胞核漿的分界不清楚，若分化過(guò)度，細(xì)胞核漿染色過(guò)淡不清晰；水洗要合理，蘇木素染色后水洗時(shí)間不宜長(zhǎng)，而鹽酸酒精分化后水洗時(shí)間不宜短；染色過(guò)程中防止切片干涸，避免形成“龜裂”或細(xì)胞核出現(xiàn)透明不良；封固時(shí)，切片上應(yīng)保留適當(dāng)?shù)亩妆綕穹猓苊飧煞猱a(chǎn)生氣泡[5]。

總之，影響小鼠常規(guī)石蠟切片制作的因素是多方面的，許多因素與結(jié)果關(guān)聯(lián)重疊。欲制作優(yōu)質(zhì)的小鼠甲狀腺組織常規(guī)石蠟切片，需掌握小鼠甲狀腺組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，不斷探索不同條件下切片制作的最適宜方案，科學(xué)處理，精益求精，以獲得良好制片的效果。

參考文獻(xiàn)

[1] 高寶紅.介紹大鼠各組織器官石蠟切片制作法[J].實(shí)用醫(yī)技雜志，2009，16（12）：1023-1024.

[2] 盧文麗，潘志強(qiáng)，方肇勤，等.大？小鼠甲狀腺和甲狀旁腺的解剖[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)，2009，29（5）：310-312.

[3] 鄭偉，劉亞軍，陳倩倩.兩種改良脫水程序在小白鼠不同組織處理中的應(yīng)用比較[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2016，32（8）：940-941.

[4] 薛曉偉，李星奇，王德田，等.探討減少甲狀腺濾泡中膠質(zhì)引起石蠟切片皺縮的方法[J].診斷病理學(xué)雜志，2014，21（3）：192.

[5] 羅燦嶠，莫木瓊，鐘覺民，等.病理HE切片常見的質(zhì)量問題及處理方法[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2010，5（1）：39-40.