植物菌根塊菌分子鑒定及菌絲培養(yǎng)基優(yōu)化的研究

樊莉娟 張國珍 張冰冰 徐鶯 秦小波

摘 要：塊菌屬（Tuber）是由真菌感染其適宜植物根系形成，部分塊菌如法國黑孢塊菌（T. melanosporum）和中國印度塊菌（T. indicum）等為珍稀藥食兩用菌，具有很高的經(jīng)濟價值。對塊菌的過度挖掘造成野生塊菌資源匱乏，塊菌人工栽培技術(shù)則是實現(xiàn)塊菌產(chǎn)業(yè)可持續(xù)性發(fā)展的重要基礎(chǔ)。目前國內(nèi)外人工栽培主要采用塊菌子實體勻漿制成的子囊孢子懸浮液，與人工種植苗木根系共生。利用塊菌菌絲替代子實體孢子懸浮液進行接種，具有減少對塊菌子實體的依賴性和生產(chǎn)成本、保護林下塊菌野生資源、促進塊菌人工繁育進程的積極意義，但需要成熟高效的菌絲培養(yǎng)技術(shù)。該研究從云南、陜西等地林下采取塊菌樣品，在ITS分子鑒定并純化得到純種菌絲的基礎(chǔ)上，以菌絲直徑為指標(biāo)，經(jīng)單因素實驗和4因素3水平正交實驗L9（34），篩選得出最適宜的菌絲生長培養(yǎng)基。結(jié)果表明：（1）形態(tài)和ITS分子鑒定得到的13份塊菌樣品分屬印度塊菌（T. indicum）和假凹陷塊菌（T. pseudoexcavatum）兩種。（2）純化的印度塊菌菌絲培養(yǎng)基的最佳碳源為馬鈴薯浸出液，最佳氮源為酵母膏，VB1對印度塊菌菌絲生長并無顯著性促進作用。（3）最佳的碳源、氮源、無機鹽組合為馬鈴薯浸出液150 g·L-1、酵母膏3 g·L-1、MgSO4 2 g·L-1、KH2PO4 2 g·L-1。25 ℃，自然pH下培養(yǎng)8 d菌絲直徑可達49.44 mm。

關(guān)鍵詞：塊菌屬，ITS，菌絲，固體培養(yǎng)基，優(yōu)化

中圖分類號：Q943.1

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2021）08-1288-08

Abstract： Tuber is a type of fungus underground， formed by infecting suitable plant roots. And some species such as T. melanosporum and T. indicum are rare and valuable for both medicine and food， and have high economic values. The over excavation of Tuber has caused a shortage of wild Tuber resources， and the artificial cultivation technology of Tuber is an important foundation for the sustainable development of the Tuber industry. At present， the ascosporic suspension made from the homogenate of the fruiting body， is mainly used in the artificial cultivation， which is symbiotic with the roots of the planting seedlings. It is valuable for reducing the dependence on the fruiting body of Tuber and the production cost， protecting the wild resources of Tuber under the forest and promoting the process of artificial propagation of Tuber， to use the hyphae of Tuber instead of the spore suspension for inoculation， but it needs mature and efficient technology for hyphae culture. Tuber samples in this study were taken from the forests of Yunnan， Shaanxi and other places. Then， ITS sequence analysis was carried out to identify species and purify hyphaes. The most suitable hyphae growth medium was selected by the L9（34） orthogonal test （four factors with three levels）， using the hyphae diameter as an index. The results were as follows： （1） The 13 Tuber samples identified by morphological and ITS molecular identification belonged to T. indicum and T. pseudoexcavatum. （2） The optimum carbon source for T. indicum hyphae was potato extract， and the optimum nitrogen source was yeast extract. However， VB1 had no significant promotion effect on the hyphae growth of T. indicum. （3） The optimal combination of carbon， nitrogen and inorganic salts was potato extract 150 g·L-1， yeast extract 3 g·L-1， MgSO4 2 g·L-1， and KH2PO4 2 g·L-1. The diameter of hyphae can reach 49.44 mm， which is cultured at 25 ℃ and natural pH for 8 d.

Key words： Tuber， ITS， hyphae， solid medium， optimization

塊菌屬（Tuber）是由土壤真菌感染其共生的植物根系形成（王曙光和林先貴，2001）。全世界已知塊菌種類超過180種，主要分布在法國、意大利（Bonito et al.， 2010）以及中國的四川、云南、新疆、西藏等地（張介平和劉培貴，2015）。塊菌富含蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，風(fēng)味獨特（陶愷和劉波，1990），其含有的α-雄烷醇、塊菌多糖具有提升免疫力、抗腫瘤與抗氧化等重要功效（曹晉忠等，2011），價格昂貴，異常珍稀，是重要的經(jīng)濟真菌（鄧曉娟等，2019）。

近年來由于開發(fā)過度，野生塊菌產(chǎn)量顯著減少，開展其人工栽培是其必然趨勢。目前國內(nèi)外主要采用塊菌子實體勻漿制成的子囊孢子懸浮液，接種于適宜的人工種植宿主苗木根系共生，模擬野生生長環(huán)境來進行半人工栽培。但是，子實體中的害蟲和病原體以及其他菌根真菌會污染植物根系，影響塊菌菌根形成。并且每株植物根系均接種多個孢子，且子囊孢子是有性孢子，因此，其菌根成分可能互不相同，難以適應(yīng)特定的土壤和氣候條件（Iotti et al.， 2016）。特別是由于塊菌本身價值就很高，造成子實體勻漿接種成本也高，存在過程繁瑣、周期長、產(chǎn)量低、對自然環(huán)境條件依賴嚴重等問題（胡炳福等，2010）。Iotti et al.（2016）報道將勃氏塊菌的純培養(yǎng)菌絲代替子實體勻漿孢子懸浮液，接種于宿主苗木獲得菌根，并成功產(chǎn)生子實體。該技術(shù)不僅降低了其根系污染的風(fēng)險，而且極大地節(jié)約了生產(chǎn)成本。印度塊菌作為中國主要商業(yè)塊菌，采用印度塊菌菌絲接種而獲得菌根及子實體的案例，目前尚未有報道。因此，本研究從塊菌的分子鑒定著手，通過篩選優(yōu)良的印度塊菌母種菌絲培養(yǎng)基，獲得優(yōu)良菌絲，旨在為后續(xù)的印度塊菌菌絲接種植物根系、獲得菌根和子實體提供理論依據(jù)和支持，對降低成本、加快其人工栽培進程具有重要價值，還促進了林下塊菌菌根的資源保護。

1材料與方法

1.1 試驗材料

從陜西、云南等地林下采取塊菌子實體見圖1。宿主苗木見表1，經(jīng)初步形態(tài)鑒定后組織分離培養(yǎng)獲得純種菌絲。

1.2 方法

1.2.1 菌絲分離純化 以PDA為純化培養(yǎng)基，采用組織分離法進行（周建平等，2017）。

1.2.2 基于rDNA ITS序列的分子鑒定

1.2.2.1 樣品DNA提取及rDNA ITS序列擴增 采用植物DNA提取試劑盒 （天根生化北京有限公司）提取塊菌子實體組織DNA。采用真菌ITS序列通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對樣品rDNA ITS序列進行擴增。PCR體系：2×primestar Mix 高保真酶25 μL、模板2 μL、引物各2 μL、ddH2O 19 μL。擴增程序：98 ℃預(yù)變性2 min，35個循環(huán)（98 ℃變性30 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s），72 ℃再延伸2 min，12 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小，凝膠回收目的條帶。

1.2.2.2 目的條帶的載體構(gòu)建、測序及序列比對分析 采用T4 Quick Blunt試劑盒（諾唯贊生物科技有限公司）連接目的條帶至T4載體中，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。將所測ITS序列利用BLAST程序與NCBI中的核酸數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，以相似性比對得分最高的參考序列確定所測樣品的物種。

1.2.3單因素試驗 碳源篩選：分別以葡萄糖20 g·L-1、馬鈴薯200 g·L-1、蔗糖20 g·L-1、麥芽糖20 g·L-1作為碳源。其他成分：蛋白胨2 g·L-1，KH2PO4 1 g·L-1，MgSO4 1 g·L-1，VB1 0.05 g·L-1，瓊脂粉20 g·L-1。

氮源篩選：分別以蛋白胨2 g·L-1、酵母膏2 g·L-1、牛肉膏2 g·L-1、氯化銨2 g·L-1、硝酸銨2 g·L-1作為氮源。其他成分：葡萄糖20 g·L-1，KH2PO4 1 g·L-1，MgSO4 1 g·L-1，VB1 0.05 g·L-1，瓊脂粉20 g·L-1。

VB1篩選：將VB1作為變量，分別設(shè)置空白對照組與VB1組。其他成分：葡萄糖20 g·L-1，蛋白胨2 g·L-1，KH2PO4 1 g·L-1，MgSO4 1 g·L-1，VB1 0.05 g·L-1，瓊脂粉20 g·L-1。

各設(shè)置3個重復(fù)，自然pH，置于25 ℃培養(yǎng)（馬欣燕等，2016），7 d后統(tǒng)計菌絲生長直徑。數(shù)據(jù)統(tǒng)計及顯著性分析采用GraphPad Prism 5軟件及SPSS 22.0軟件的ANOVA 方法完成。

1.2.4 正交試驗 將單因素試驗篩選出的最佳因子，結(jié)合前人研究表明對食用菌菌絲有促進作用的MgSO4及KH2PO4兩個因素（何明霞等，2009;馬欣燕等，2016）進行正交試驗，以篩選各因素的最佳組合，各設(shè)置4個重復(fù)，培養(yǎng)條件同上。正交試驗極差分析采用Minitab 17軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于ITS序列分子鑒定

以子實體提取的DNA為模板，采取真菌通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增，13個樣品均擴增出清晰條帶，大小約600 bp（圖2）。將樣品序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中進行比對，共匹配出3種塊菌：印度塊菌（Tuber indicum）、假凹陷塊菌（T. pseudoexcavatum）和中國塊菌（T. sinense）（表1）。由于目前中國塊菌和印度塊菌已被鑒定為同種（Chen et al.， 2011），故本次調(diào)查獲得的塊菌實際只有2個種。

2.2 塊菌菌絲分離

菌絲提取DNA后，進行ITS序列鑒定比對后確定為印度塊菌。

2.3 單因素試驗不同碳源對印度塊菌菌絲生長的影響

以菌絲直徑為衡量指標(biāo)，判斷不同碳源對印度塊菌菌絲生長的影響（圖3）。發(fā)現(xiàn)4種碳源均能較好地被印度塊菌所利用，而馬鈴薯浸出液培養(yǎng)基和麥芽糖培養(yǎng)基上的菌絲直徑明顯大于葡萄糖與蔗糖培養(yǎng)基（圖3：A）。其中，馬鈴薯浸出液組、麥芽糖組與葡萄糖組在α=0.01水平上具有極顯著差異;馬鈴薯浸出液組與麥芽糖組在α=0.05水平上也具有顯著性差異，故馬鈴薯浸出液為本試驗中塊菌最佳碳源，采用馬鈴薯進行后續(xù)正交試驗（圖3：B）。

2.4 單因素試驗不同氮源對印度塊菌菌絲生長的影響

因食用菌對無機氮源和有機氮源均能進行吸收利用，且部分食用菌對無機氮源利用率更高（牛玉蓉等，2013），故本次以菌絲直徑為衡量指標(biāo)，以蛋白胨為對照，對兩類氮源均進行了試驗（圖4）。有機氮源和無機氮源對菌落直徑的影響在α=0.01水平上極顯著差異，前者的效果明顯好于后者，但牛肉膏的效果要遜于蛋白胨和酵母膏。在無機氮源中，硝酸銨的效果要優(yōu)于氯化銨，在α=0.05水平上顯著差異。綜上結(jié)果表明，印度塊菌對5種氮源的吸收利用率為酵母膏>蛋白胨>牛肉膏>硝酸銨>氯化銨，因此，本研究采用酵母膏進行后續(xù)正交試驗。

2.5 VB1對印度塊菌菌絲生長的影響

前人研究證明，VB1對某些食用菌如雞樅菌絲、草原白蘑菌絲等生長有促進作用（王小丹等，2011;馬榮山和方蕊，2011）。但是在本試驗中，VB1對塊菌的生長并無顯著性促進作用（圖5）。因此，從實際生產(chǎn)利用的成本出發(fā)，在培養(yǎng)母種菌絲時，未將VB1納入后續(xù)正交試驗。

2.6 正交試驗篩選最佳培養(yǎng)基

將單因素試驗所得的最佳碳源、最佳氮源，以及前人研究所得的MgSO4及KH2PO4按L9（34）4因素3水平設(shè)計正交試驗，復(fù)選優(yōu)化印度塊菌菌絲生長的固體培養(yǎng)基（表2）。極差R的大小代表各個因素在不同水平時對菌絲直徑影響程度的大小，其中極差R越大，則此因素在不同水平對菌絲直徑的影響就越大（Gregory et al.， 2013），故碳源馬鈴薯浸出液對印度塊菌菌絲生長直徑影響最大，MgSO4次之，再次為酵母膏，最后為KH2PO4。

k值代表同一因素不同水平對菌絲直徑的影響，其中k值較大者代表此水平對菌絲直徑有較好的促進作用（陳文強等，2005），因此，本研究中的印度塊菌菌絲生長的最佳培養(yǎng)條件為A1B3C3D3，即馬鈴薯浸出液150 g·L-1、酵母膏3 g·L-1、MgSO4 2 g·L-1、KH2PO4 ?2 g·L-1。

3 討論與結(jié)論

塊菌營養(yǎng)物質(zhì)豐富，但因資源稀缺、采摘難度大等多種因素，造成其價格極昂貴，人工培育將成為其必然發(fā)展趨勢（郭尚等，2014）。塊菌菌絲對比子實體勻漿孢子懸浮液，具有易獲得、易保存、純化程度高、成本低等優(yōu)點。本研究獲得了印度塊菌菌絲最適宜母種培養(yǎng)基，該結(jié)果不僅促進了印度塊菌的人工培育進程，而且能促進林下塊菌菌根的資源保護。

在多數(shù)食用菌碳源篩選中，最佳碳源多為葡萄糖、蔗糖以及麥芽糖等（陳文強等，2002;徐瑞雅等，2007;何明霞等，2009）。葡萄糖是多數(shù)食用菌良好同化利用的碳源，但并非是所有食用菌最好的碳源。馬鈴薯浸出液的主要成分為淀粉物質(zhì)，據(jù)報道，葡萄糖經(jīng)高溫滅菌后還原糖含量降低，而可溶性淀粉經(jīng)高溫滅菌處理后產(chǎn)生復(fù)雜變化，還原糖含量升高，更容易被一些食用菌菌絲吸收利用，例如，香菇、柳松茸在高溫滅菌的可溶性淀粉為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長最快，蛹蟲草在間歇滅菌的可溶性淀粉為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長最快（何培新等，2003）。本研究中，印度塊菌培養(yǎng)基的最適碳源為馬鈴薯浸出液，可能是印度塊菌菌絲能產(chǎn)生高活性的淀粉酶快速分解淀粉。另外據(jù)報道，馬鈴薯含有多種營養(yǎng)物質(zhì)、酶類、生理活性物質(zhì)以及礦物質(zhì)等微量元素（呂巨智等，2009;丁紅瑾，2013），具有豐富的營養(yǎng)價值。鄧曉娟等（2019）在印度塊菌子囊果內(nèi)細菌的群落結(jié)構(gòu)研究中，發(fā)現(xiàn)其細菌物種豐富，群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，包括4屬40種，其中變形菌門、擬桿菌門和放線菌門的物種占總物種數(shù)的99.7%，是其優(yōu)勢細菌。其中放線菌門產(chǎn)生的多種酶類，變形菌門的固氮細菌有效固氮，多種細菌產(chǎn)生的復(fù)雜影響有利于印度塊菌的菌絲生長和子囊果的形成（Streiblová et al.， 2012）。馬鈴薯作為印度塊菌的最適碳源，可能是馬鈴薯浸出液中的有關(guān)酶類等生物活性物質(zhì)，以及礦物質(zhì)等微量元素彌補了塊菌子囊果中細菌產(chǎn)生的有效活性物質(zhì)，從而促進印度塊菌菌絲的生長。塊菌菌根是與其適宜苗木的根系共生而形成，馬鈴薯塊莖作為一種變態(tài)莖，其中可能含有與塊菌共生苗木根系的類似成分，而促進塊菌菌絲的生長，這暗示也許可從植物的根莖中分離出可促進塊菌菌絲生長的物質(zhì)，我們將在以后的工作中進行實驗探索和驗證。

本研究結(jié)果表明，VB1對印度塊菌的菌絲生長并無促進作用，相反，VB1對某些食用菌如雞樅菌絲、草原白蘑菌絲等生長則有促進作用（王小丹等，2011;馬榮山和方蕊，2011）。目前塊菌尚無相關(guān)研究涉及維生素的應(yīng)用機理，猜測可能是印度塊菌長期與宿主植物根系共生，多種細菌影響子囊果的生態(tài)適應(yīng)性，使得形成無需VB1的獨特性質(zhì)，但具體的機理等還需進一步研究。

綜合本研究結(jié)果，最后得出印度塊菌優(yōu)化母種培養(yǎng)基配方為馬鈴薯浸出液150 g·L-1、酵母膏3 g·L-1、MgSO4 2 g·L-1、KH2PO4 ?2 g·L-1，在25 ℃下培養(yǎng)8 d后可使菌絲直徑達49.44 mm。本研究為印度塊菌利用菌絲代替子實體勻漿孢子懸浮液接種于宿主根系產(chǎn)生子實體提供了研究基礎(chǔ)，可解決子實體勻漿孢子懸浮液的高成本、過程繁瑣以及子實體勻漿孢子中其他真菌污染植物根系等問題。同時，如何將優(yōu)化固體培養(yǎng)基上長出的印度塊菌菌絲運用于后續(xù)的人工接種及栽培還需進一步研究。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）