改性黃腐酸/凹凸棒石復(fù)合材料的制備及其抑菌性能

楊芳芳，張 倩，宋亞萌，惠愛平，康玉茹，王愛勤

(1.中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所，甘肅省黏土礦物應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000；2.中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所盱眙凹土應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，淮安 211700；3.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，蘭州 730000)

0 引 言

在過去的半個(gè)多世紀(jì)，抗生素被大規(guī)模用于動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)，在預(yù)防和治療動(dòng)物傳染性疾病，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)及提高畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)效益等方面發(fā)揮了重要作用[1-2]。然而，抗生素在養(yǎng)殖領(lǐng)域長(zhǎng)期和過度使用造成了嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥性及藥物殘留，對(duì)食品安全和公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了威脅[3]。我國(guó)2020年7月起已全面禁抗?；诖?，開發(fā)抗生素類促生長(zhǎng)劑替代品迫在眉睫。

黃腐酸(fulvic acid, FA)又稱富里酸，是一類分子量較小、活性官能團(tuán)豐富和藥用價(jià)值較高的復(fù)合有機(jī)酸。FA作為飼料添加劑，毒性較低[4]，能夠提高機(jī)體抗氧化能力[5]，可抑制和殺滅腸道內(nèi)的病原菌，維持腸道微生物區(qū)系的平衡，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高免疫力，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[6]。然而其廣譜抑菌性有待進(jìn)一步提升。

凹凸棒石(attapulgite, APT)是一種天然的一維納米含水富鎂鋁硅酸鹽黏土礦物。APT能夠促進(jìn)腸黏膜修復(fù)，增強(qiáng)動(dòng)物抗病能力[7-8]。APT獨(dú)特的棒晶形貌和孔道結(jié)構(gòu)，既可以做功能復(fù)合抑菌材料的載體[9-10]，又可吸附抑菌活性成分，進(jìn)而增強(qiáng)材料的抑菌性能[11-12]。為此，本文利用APT的吸附性能將FA負(fù)載于APT，同時(shí)采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)進(jìn)行改性，獲得了具有一定廣譜抑菌性能的FA/APT復(fù)合抑菌材料。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

APT來自盱眙歐佰特粘土材料有限公司，其主要化學(xué)組成(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為Al2O310.73%，MgO 9.70%，CaO 0.49%，SiO260.83%，K2O 1.18%，F(xiàn)e2O35.71%。FA來自山東創(chuàng)新腐植酸科技有限公司，純度為95%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))以上。CTAB購自成都市科隆化學(xué)品有限公司，分析純。金黃色葡萄球菌(S.aureus, ATCC25912)和大腸桿菌(E.coli, ATCC25922)由蘭州大學(xué)第二醫(yī)院提供，Luria-Bertani營(yíng)養(yǎng)肉湯(LB)培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂(nutrient agar, NA)培養(yǎng)基均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器及測(cè)試方法

試驗(yàn)儀器包括MS204TS電子分析天平、RT10多點(diǎn)磁力攪拌器、DHG-9145A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、TDL-50C低速大容量離心機(jī)。傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜由Thermo Nicolet 6700型紅外光譜儀(波長(zhǎng)為4 000～400 cm-1)測(cè)定，Zeta電位由ZEN3600 Zeta電位分析儀(633 nm He-Ne激光輻射)測(cè)定，復(fù)合材料的表面積和孔隙體積用ASAP2020全自動(dòng)比表面積及微孔物理系吸附儀(N2，196 ℃)測(cè)定，熱重分析(TGA)在PerkinElmer STA 8000同步熱分析儀(N2氣氛，工作溫度為室溫至800 ℃，升溫速率為10 ℃/min)上測(cè)定。

1.3 FA/APT復(fù)合材料制備

在300 r/min攪拌速率下，6個(gè)100 mL燒杯中分別加入20 mL去離子水和0.2 g FA粉末，完全溶解后再分別加入1 g APT粉末，分散完全后依次加入0.5%、1%、5%、10%、15%和20%(相對(duì)于APT質(zhì)量)的CTAB。上述混合液攪拌5 min后超聲分散30 min，再繼續(xù)攪拌6 h后將混合液在轉(zhuǎn)速為4 000 r/min的離心機(jī)中離心10 min，用去離子水洗滌3次，60 ℃干燥12 h，研磨過200目(75 μm)篩，所得樣品依次標(biāo)記為FA/APT-1、FA/APT-2、FA/APT-3、FA/APT-4、FA/APT-5和FA/APT-6。未經(jīng)CTAB改性的樣品標(biāo)記為FA/APT。

1.4 最小抑菌濃度(MIC)評(píng)價(jià)

FA/APT復(fù)合材料抑菌性能評(píng)價(jià)采用最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)法[12]，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為代表革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的試驗(yàn)菌株。平板中樣品的最終濃度如下：大腸桿菌組濃度為5 mg/mL、2.5 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.1 mg/mL，金黃色葡萄球菌組濃度為1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.1 mg/mL、0.05 mg/mL、0.025 mg/mL、0.01 mg/mL。最后用移液槍吸取1 μL的上述菌懸液(含菌量約為1×104CFU/mL)，點(diǎn)種于含待測(cè)樣品的瓊脂平板中，每個(gè)培養(yǎng)皿接種3個(gè)點(diǎn)。將所有平板移至恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在37 ℃下培養(yǎng)16～24 h后，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，完全抑制菌落生長(zhǎng)的最低樣品濃度為所得樣品的MIC值。試驗(yàn)過程中建立不含樣品的陽性對(duì)照組和空白對(duì)照組。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料表征

2.1.1 紅外光譜分析

圖1 FA、APT、FA/APT復(fù)合材料的FT-IR譜和局部放大圖Fig.1 FT-IR spectra of FA, APT, and FA/APT composites and the partial enlarged detail

2.1.2 熱重分析

圖2是APT、FA/APT和不同濃度CTAB改性FA/APT復(fù)合材料的TGA和DTG曲線。由圖可見，對(duì)于APT，200 ℃以下的質(zhì)量損失主要?dú)w因于表面吸附水和沸石水的脫除，230 ℃和450 ℃左右的質(zhì)量損失是由于配位水和結(jié)構(gòu)水的脫除。FA/APT和CTAB改性后的FA/APT復(fù)合材料在70～90 ℃之間的質(zhì)量損失同樣歸因于吸附水的脫除；在200～500 ℃之間的質(zhì)量損失除了APT中配位水和結(jié)構(gòu)水的脫除外，還有FA和CTAB分解的貢獻(xiàn)；隨著CTAB添加量的增加，復(fù)合材料在此區(qū)間的質(zhì)量損失率增大，特別是對(duì)于FA/APT-5和FA/APT-6，由于吸附CTAB的量大幅增加，在200～300 ℃區(qū)間的熱降解最為明顯。熱重分析結(jié)果進(jìn)一步表明，F(xiàn)A被成功負(fù)載到APT上，同時(shí)CTAB也作用于FA/APT復(fù)合材料，實(shí)現(xiàn)了FA/APT復(fù)合材料的改性。

圖2 APT和FA /APT復(fù)合材料的TGA和DTG曲線Fig.2 TGA and DTG curves of APT and FA/APT composites

2.1.3 Zeta電位分析

FA、APT、FA/APT和不同濃度CTAB改性FA/APT復(fù)合材料的Zeta電位如圖3所示。由圖可見，F(xiàn)A和APT均帶負(fù)電荷，分別為-55.13 mV 和-20.93 mV，當(dāng)二者結(jié)合后Zeta電位仍為負(fù)值。當(dāng)FA/APT被陽離子表面活性劑CTAB改性后，隨著CTAB添加量的增加，Zeta電位逐漸增大。Zeta電位的調(diào)節(jié)有利于增強(qiáng)復(fù)合材料與細(xì)菌的界面作用，從而增強(qiáng)FA/APT的抑菌作用。

圖3 FA、APT和FA/APT復(fù)合材料的Zeta電位Fig.3 Zeta potentials of FA, APT, andFA/APT composites

2.1.4 比表面積分析

表1列出了實(shí)測(cè)的APT負(fù)載FA前后以及CTAB改性FA/APT后復(fù)合材料比表面積和孔結(jié)構(gòu)參數(shù)。相比于APT，F(xiàn)A/APT的比表面積(SBET)、外比表面積(Sext)和總孔體積(Vtotal)均明顯減小，尤其是微孔比表面積(Smicro)急劇降低，說明FA分子被成功負(fù)載到APT上。經(jīng)CTAB改性后，F(xiàn)A/APT的SBET、Sext和Vtotal隨CTAB添加量的增加而呈現(xiàn)規(guī)律性的減小，表明CTAB分子結(jié)合到FA/APT復(fù)合材料上。此外，CTAB改性后復(fù)合材料的Smicro急劇降低；當(dāng)CTAB添加量為5%時(shí)，微孔表面積消失。該結(jié)果表明CTAB分子同時(shí)進(jìn)入到了APT的外部通道和內(nèi)部孔道[16]。

表1 APT和FA/APT復(fù)合材料的比表面積和孔結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 1 Specific surface areas and pore structural parameters of APT and FA/APT composites

2.2 抑菌性能和機(jī)理分析

FA、APT、FA/APT和不同濃度CTAB改性FA/APT復(fù)合材料的MIC見表2?？梢园l(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A和APT對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均大于5 mg/mL，F(xiàn)A負(fù)載到APT后復(fù)合材料的抑菌性能沒有明顯提升。采用CTAB改性后，復(fù)合材料對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性明顯增強(qiáng)，并隨著CTAB添加量的增加，MIC值明顯減小。當(dāng)CTAB用量為5%時(shí)，復(fù)合材料對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC可達(dá)0.25 mg/mL；當(dāng)CTAB用量為15%時(shí)，MIC可達(dá)0.05 mg/mL。但采用CTAB改性后復(fù)合材料對(duì)大腸桿菌的抑制作用較弱，當(dāng)CTAB用量達(dá)到15%后，對(duì)大腸桿菌的抑菌作用才較為明顯(MIC為1 mg/mL)。圖4展示了FA/APT-5(15%)和 FA/APT-6(20%)對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度測(cè)試平板數(shù)碼照片。

表2 FA、APT和FA/APT復(fù)合材料的MICTable 2 MIC values of FA, APT, and FA/APT composites

圖4 FA/APT-5和FA/APT-6對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度測(cè)試Fig.4 MIC tests of FA/APT-5 and FA/APT-6 against E. coli and S. aureus

通過上述分析可知，F(xiàn)A和APT對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用相對(duì)較弱，這與文獻(xiàn)中報(bào)道基本一致。蔡防勤等[17]曾采用肉湯和血清肉湯培養(yǎng)基對(duì)鞏縣FA的抑菌性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果證明，鞏縣FA在高濃度時(shí)對(duì)金黃色球菌、肺炎雙球菌和流感桿菌具有抑制作用，而對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌等8種細(xì)菌無抑制作用。高金崗等[18]比較了生化FA和常見抑菌藥品的抑菌效果發(fā)現(xiàn)，生化FA濃度≥40 mg/mL 時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蘇云金桿菌及枯草桿菌均有明顯的抑制作用。Enerkom(Pty)公司采用濕法氧化將煙煤轉(zhuǎn)化為高質(zhì)量的FA，其對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度可達(dá)15 mg/mL[19]?？梢钥闯?，不同來源FA的抑菌性能具有差異性，但均在較高濃度時(shí)會(huì)產(chǎn)生抑菌效果。相對(duì)于體外抑菌性能的評(píng)價(jià)，國(guó)內(nèi)外關(guān)于FA在動(dòng)物生產(chǎn)中應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道較多。Qin等[20]評(píng)價(jià)了FA對(duì)藥物致瀉模型小鼠的抗腹瀉作用，發(fā)現(xiàn)FA中的含氧官能團(tuán)尤其是酚羥基和羧基，以及其分子量分布、膠體性質(zhì)和收斂性，是其發(fā)揮抗腹瀉活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。諸多研究[21-24]發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加FA能夠改善畜禽和水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能和腸道健康狀況，這主要?dú)w因于FA中含有的多種活性功能基團(tuán)可提高腸道內(nèi)消化酶活性，進(jìn)而促進(jìn)氧化還原和新陳代謝，還可通過抑制病原微生物消除炎癥。

APT在改善動(dòng)物腸道健康和生產(chǎn)性能方面已有大量報(bào)道[25-26]，特別是APT可替代抗生素防控仔豬腹瀉[27]。雖然APT本身的抑菌作用較弱，但其作為載體能夠有效提升抑菌類材料的抑菌性能[28]，歸因于其良好的吸附作用，能夠增強(qiáng)抑菌材料與病原菌之間的界面作用[29]。

季銨鹽是一類具有很強(qiáng)表面活性的陽離子表面活性劑和抑菌劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)帶有正電荷和疏水區(qū)域，能夠吸附穿透細(xì)胞壁，溶解細(xì)胞膜，造成細(xì)菌內(nèi)容物的泄漏，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌死亡[30]。本研究采用CTAB改性后，復(fù)合材料抑菌性能明顯得到了改善。其中，在低濃度CTAB改性下，復(fù)合材料對(duì)金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)抑制作用，而對(duì)大腸桿菌的抑制作用則要CTAB濃度大于10%時(shí)才較為明顯，這主要是由兩種細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分不同所造成的。大腸桿菌含有脂多糖和脂蛋白組成的外膜，而金黃色葡萄球菌不存在這種外膜。當(dāng)CTAB吸附到細(xì)菌后，必須先溶解外膜，然后與內(nèi)膜作用，因此金黃色葡萄球菌通常比大腸桿菌更敏感[31]。綜上所述，將具有高生物活性的FA引入到載體APT中，并結(jié)合CTAB改性，通過三者的協(xié)同作用，復(fù)合材料對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出抑菌活性，具有一定的廣譜抑菌作用。

3 結(jié) 論

本文以APT為載體，通過吸附法實(shí)現(xiàn)了FA的負(fù)載和復(fù)合材料的改性。FA和CTAB分子主要通過靜電吸附方式負(fù)載于APT，CTAB的引入實(shí)現(xiàn)了FA/APT復(fù)合材料的電荷調(diào)控。CTAB用量越大，F(xiàn)A/APT復(fù)合材料的抑菌性能越強(qiáng)，且對(duì)金黃色葡萄球菌比大腸桿菌更敏感。當(dāng)CTAB添加量為15%時(shí)，復(fù)合材料對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度為1 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度可達(dá)0.05 mg/mL。該復(fù)合材料的協(xié)同效應(yīng)賦予其一定廣譜抑菌作用，在動(dòng)物健康養(yǎng)殖方面具有廣闊的應(yīng)用前景。