pH敏感型黃原膠/聚乙烯醇水凝膠的制備與表征*

劉 靜，徐夢(mèng)潔，張秀梅，徐 濤，郭 媛，陳維毅，黃 棣

(1. 太原理工大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系，納米生物材料與再生醫(yī)學(xué)研究中心，太原 030024；2. 太原理工大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程研究所, 材料強(qiáng)度與結(jié)構(gòu)沖擊山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 太原 030024)

0 引言

水凝膠是一種能在水中溶脹但不溶于水的高分子材料，由于其含水率和結(jié)構(gòu)等與生物組織相似，具有良好的生物相容性，因此被廣泛地應(yīng)用于藥物緩釋載體、組織工程支架、皮膚敷料等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[1]。目前研究和應(yīng)用最廣泛的是pH敏感型水凝膠和溫敏型水凝膠，pH敏感型水凝膠是指水凝膠的體積隨外界pH值或離子強(qiáng)度的變化而發(fā)生改變的一類(lèi)水凝膠[2-3]。本課題研究一種pH敏感型水凝膠的溶脹-消溶脹行為從而表現(xiàn)出水凝膠的pH敏感性來(lái)控制藥物的緩釋。

目前用于制備水凝膠的高分子材料有天然和人工合成兩類(lèi)[4-5]，但都存在不足之處，為了滿足符合人體內(nèi)部條件及具有良好生物相容性的材料，對(duì)兩種高分子材料進(jìn)行復(fù)合來(lái)綜合其優(yōu)良性能[6]，本研究制備黃原膠/聚乙烯醇(Xanthan Gun/Polyvinyl alcohol，XG/PVA)水凝膠。PVA是一種無(wú)毒副作用、可降解且具有機(jī)械性能的人工合成材料，制備出的水凝膠雖然具有可調(diào)節(jié)的性能及降解性[7-9]，但與天然高分子相比其生物相容性較差，XG是一種無(wú)毒、可降解、生物相容性好的天然高分子材料[10-13]，本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)交聯(lián)結(jié)合物理交聯(lián)的方式制備出一種XG/PVA復(fù)合水凝膠，研究XG與PVA不同質(zhì)量比、不同交聯(lián)劑用量及不同冷凍-解凍循環(huán)次數(shù)對(duì)XG/PVA水凝膠溶脹性能和力學(xué)性能的影響，確定最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件制備水凝膠，進(jìn)一步研究其pH敏感性及溶脹-消溶脹動(dòng)力行為，同時(shí)以牛血清蛋白(Bovine serum alumin，BSA)為模擬藥物，研究其在該水凝膠中的釋放行為，及其生物相容性的研究，結(jié)果表明XG/PVA復(fù)合水凝膠有望在藥物控釋方面有所應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 主要原材料

XG：上海麥克林生化有限科技有限公司；PVA(10500)：西隴科學(xué)股份有限公司；環(huán)氧氯丙烷：分析純，上海麥克林生化有限科技有限公司；氫氧化鈉：天津市北辰方正試劑廠。去離子水由四川優(yōu)普純水儀制備(18.2 MΩ·cm)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

集熱式恒溫磁力攪拌浴，HWCL-3，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；強(qiáng)力電動(dòng)攪拌機(jī)，JB50-D，上海標(biāo)本模型廠制造；冷凍干燥機(jī)，F(xiàn)D-1A-80，上海比朗儀器制造有限公司；掃描電子顯微鏡(Scanning electric microscopy，SEM)，JSM-7100F，日本Jeol公司；電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)，Instron5544，美國(guó)INSTRON；傅里葉紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR)，Nicolet iS10，美國(guó)Thermo Scientific公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱，F(xiàn)orma311，美國(guó)Thermo Scientific公司；熒光倒置相差顯微鏡，TiS，日本Nikon公司。紫外分光光度計(jì)，SP-756，上海光譜儀器有限公司。

1.3 試樣制備

將一定量的XG和PVA混合在90 ℃機(jī)械攪拌下溶于200 mL去離子水中，待溶解完全后冷卻至室溫，再加入2 g氫氧化鈉和一定量的交聯(lián)劑環(huán)氧氯丙烷，攪拌均勻后倒入模具，放入冰箱進(jìn)行冷凍-解凍循環(huán)即制得XG/PVA復(fù)合水凝膠。

1.3.1 XG與PVA的不同質(zhì)量比

分別稱(chēng)取2 g的XG和6、10、14 g的PVA混合加入200 mL的去離子水中，使XG與PVA質(zhì)量比分別為1∶3、1∶5、1∶7，按照上述實(shí)驗(yàn)步驟，再加入10 mL的環(huán)氧氯丙烷攪拌均勻后倒入模具放入冰箱進(jìn)行2次冷凍-解凍循環(huán)即制得一系列XG/PVA復(fù)合水凝膠。

1.3.2 交聯(lián)劑的不同用量

取XG與PVA的質(zhì)量比為1 : 5，按照上述實(shí)驗(yàn)步驟，分別加入6、10、14 mL的環(huán)氧氯丙烷到混合溶液中，使交聯(lián)劑用量為3%、5%、7%，攪拌均勻后倒入模具放入冰箱進(jìn)行2次冷凍-解凍循環(huán)即制得一系列XG/PVA復(fù)合水凝膠。

1.3.3 冷凍-解凍循環(huán)的不同次數(shù)

取XG與PVA的質(zhì)量比為1∶5，交聯(lián)劑用量為5%，按照上述實(shí)驗(yàn)步驟，得到混合溶液后倒入模具放入冰箱進(jìn)行冷凍-解凍循環(huán)，在-20 ℃下冷凍21 h常溫下解凍3 h為1次，分別進(jìn)行1次、2次、3次的冷凍-解凍循環(huán)即制得一系列XG/PVA復(fù)合水凝膠。

1.4 性能測(cè)試

1.4.1 水凝膠溶脹性能的測(cè)定

采用重量法對(duì)水凝膠進(jìn)行溶脹性能測(cè)試，將制得的試樣在冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，將干燥的樣品稱(chēng)重后室溫下浸泡在pH = 5的PBS中24 h，取出用濾紙拭去表面水分后稱(chēng)重，每組樣品做3次平行試驗(yàn)。水凝膠的溶脹率(SR)按公式計(jì)算[7]：

其中Ms是達(dá)到溶脹平衡時(shí)凝膠重量；Md是烘干后干凝膠重量。

1.4.2 水凝膠力學(xué)性能的測(cè)定

將水凝膠切割成厚度10 mm的圓柱體，用Instron5544萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)對(duì)其進(jìn)行壓縮力學(xué)性能測(cè)試，設(shè)置壓縮速度為3 mm/min，得到應(yīng)力-應(yīng)變曲線，每組樣品做3次平行試驗(yàn)，采用開(kāi)始?jí)嚎s至產(chǎn)生10%應(yīng)變的線性階段進(jìn)行線性擬合得到壓縮模量。采用應(yīng)變至60%時(shí)，單位面積下的應(yīng)力作為壓縮強(qiáng)度。

1.4.3 SEM觀察

將經(jīng)過(guò)冷凍干燥機(jī)干燥后的材料切割成厚度為1 mm的片狀，固定在樣品臺(tái)上，表面噴鉑金(Pt)，觀察XG/PVA復(fù)合水凝膠的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

1.4.4 FT-IR分析

利用KBr壓片法，用FT-IR技術(shù)對(duì)冷凍干燥后的XG、PVA、XG/PVA水凝膠進(jìn)行FT-IR分析，通過(guò)圖譜中的特征峰來(lái)觀察材料的交聯(lián)機(jī)理。

1.4.5 pH敏感性的測(cè)定

將冷凍干燥后的樣品稱(chēng)重后，室溫下分別浸泡在不同pH值的PBS中，每隔一段時(shí)間后取出拭去表面水分稱(chēng)重，計(jì)算水凝膠的溶脹率。每組樣品做3次平行試驗(yàn)。

1.4.6 pH響應(yīng)性的測(cè)定

將冷凍干燥后的樣品稱(chēng)重后，室溫下預(yù)先在pH=7.0的PBS中溶脹24 h，然后分別置于pH=5.0和pH=10.0的PBS中，每隔2 h交替置于pH=7.0的PBS中，取出拭去表面水分計(jì)算溶脹率。每組樣品做3次平行試驗(yàn)。

1.4.7 包埋BSA水凝膠的體外釋放測(cè)定

在XG/PVA共混溶液時(shí)加入BSA，制備BSA含量為0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的復(fù)合水凝膠，把載BSA水凝膠分別置于5 mL pH分別為2.5、7.0和10.0的PBS中，每隔一段時(shí)間后取出5 mL溶液并補(bǔ)充5 mL新鮮PBS，于279 nm處用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定BSA的釋放量，每組樣品做3次平行試驗(yàn)，繪制BSA的累計(jì)釋放曲線。

1.4.8 細(xì)胞相容性

本實(shí)驗(yàn)采用CCK8法進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。將XG/PVA水凝膠冷凍干燥后制成約Φ10 mm × 1 mm的薄片，利用高壓蒸汽滅菌法滅菌處理后放入24孔培養(yǎng)板，同時(shí)設(shè)空白組。將MG63細(xì)胞懸液以1×104個(gè)/mL的濃度接種于24孔板中，每孔1 mL。移至細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37 ℃，5% CO2)，每組3個(gè)平行樣，隔天換培養(yǎng)液，分別于1、4和7天利用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞在材料周?chē)L(zhǎng)情況，并拍攝照片。同時(shí)向每孔中加入10 μL的CCK8溶液，再放入培養(yǎng)箱3 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值(OD)。

2 結(jié)果與討論

2.1 XG/PVA復(fù)合水凝膠溶脹動(dòng)力學(xué)

圖1為影響XG/PVA水凝膠溶脹性能的實(shí)驗(yàn)條件因素，如圖所示，隨著PVA量或交聯(lián)劑量的增加，溶脹率出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；隨著冷凍-解凍循環(huán)次數(shù)的增加溶脹率下降后基于平緩。這可能是因?yàn)?，通過(guò)物理與化學(xué)的交聯(lián)作用，交聯(lián)程度大的凝膠內(nèi)部結(jié)合緊密，溶脹率小。在XG與PVA質(zhì)量比為1∶3時(shí)，或交聯(lián)劑用量為3%時(shí)，XG/PVA復(fù)合凝膠的溶脹率較小，說(shuō)明此時(shí)凝膠內(nèi)部通過(guò)化學(xué)交聯(lián)作用變得緊密[13-14]，之后隨著PVA量或者交聯(lián)劑量的增加，凝膠內(nèi)部形成了更加均勻、更多的孔隙結(jié)構(gòu)，空隙的總體積增加，從而表現(xiàn)出良好的溶脹行為，而下降可能是因?yàn)檫^(guò)量的PVA或交聯(lián)劑會(huì)發(fā)生一定的團(tuán)聚現(xiàn)象，凝膠單位體積的孔隙率相對(duì)減少所致。隨著冷凍-解凍循環(huán)次數(shù)的增加，凝膠物理交聯(lián)點(diǎn)增多，高分子交聯(lián)點(diǎn)間距變小，溶脹率減小，在物理交聯(lián)達(dá)到飽和后，凝膠形成均勻孔隙結(jié)構(gòu)，溶脹率基于平穩(wěn)。故凝膠在XG與PVA質(zhì)量比為1∶5時(shí)，交聯(lián)劑用量為5%，進(jìn)行3次冷凍-解凍循環(huán)時(shí)具有最佳的溶脹性能，此時(shí)溶脹率達(dá)到241%。

圖1 不同實(shí)驗(yàn)條件下的XG/PVA水凝膠的溶脹率

2.2 XG/PVA復(fù)合水凝膠力學(xué)性能

圖2為影響XG/PVA水凝膠壓縮彈性模量和壓縮強(qiáng)度的實(shí)驗(yàn)條件因素，如圖2所示，隨著PVA量或交聯(lián)劑量的增加，力學(xué)性能出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；隨著冷凍-解凍循環(huán)次數(shù)的增加力學(xué)性能不斷增強(qiáng)。這是因?yàn)殡S著PVA量的增加凝膠內(nèi)部形成了更加均勻的孔隙結(jié)構(gòu)，且PVA本身具有一定的機(jī)械性能，從而力學(xué)性能增強(qiáng)，而下降可能是因?yàn)檫^(guò)量的PVA改變了凝膠已有的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使其力學(xué)性能降低。交聯(lián)劑的用量影響著凝膠的交聯(lián)程度，隨著交聯(lián)劑用量的增加，凝膠化學(xué)交聯(lián)程度變大，內(nèi)部結(jié)構(gòu)緊密，孔隙均勻存在，從而力學(xué)強(qiáng)度增加，之后過(guò)量的交聯(lián)劑在凝膠交聯(lián)程度達(dá)到飽和后作為異物存在于凝膠中，阻礙了凝膠的網(wǎng)絡(luò)通道影響力學(xué)性能。冷凍-解凍循環(huán)通過(guò)凝膠內(nèi)部高分子鏈間氫鍵，離子鍵等物理作用交聯(lián)凝膠，隨著冷凍解凍循環(huán)次數(shù)的增加，水凝膠內(nèi)的物理交聯(lián)點(diǎn)增多，高分子交聯(lián)點(diǎn)之間的距離減小，凝膠內(nèi)部結(jié)合緊密，力學(xué)性能增強(qiáng)[7]。與溶脹率相一致，凝膠在XG與PVA質(zhì)量比為1∶5時(shí)，交聯(lián)劑用量為5%，進(jìn)行3次冷凍-解凍循環(huán)時(shí)具有良好的力學(xué)性能，此時(shí)水凝膠的壓縮彈性模量和壓縮強(qiáng)度達(dá)到(26.30±0.03)kPa和(134.36±0.43)kPa。

圖2 不同實(shí)驗(yàn)條件下的XG/PVA水凝膠的力學(xué)性能

這就說(shuō)明可以通過(guò)改變?cè)系牟煌|(zhì)量比、交聯(lián)劑不同用量和冷凍-解凍循環(huán)不同次數(shù)來(lái)控制XG/PVA復(fù)合水凝膠的溶脹性能及力學(xué)性能，這也對(duì)于控制藥物在體內(nèi)的緩釋發(fā)揮出一定作用。當(dāng)XG與PVA質(zhì)量比為1∶5，交聯(lián)劑環(huán)氧氯丙烷用量為5%，冷凍-解凍循環(huán)3次時(shí)，XG/PVA復(fù)合水凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻緊密且具有較高的溶脹性能和良好的力學(xué)性能。之后對(duì)該實(shí)驗(yàn)條件下制備的XG/PVA復(fù)合水凝膠進(jìn)一步表征。

2.3 XG/PVA水凝膠SEM觀察

從SEM可以看出，XG/PVA復(fù)合水凝膠內(nèi)部存在著明顯的孔隙結(jié)構(gòu)，形成了互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，說(shuō)明該凝膠成功交聯(lián)合成，且存在著明顯的孔通道，是具有良好的溶脹性能和力學(xué)性能的原因。XG/PVA水凝膠通過(guò)化學(xué)與物理交聯(lián)作用成功形成了網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

2.4 XG/PVA水凝膠紅外分析

圖4為XG、PVA、XG/PVA復(fù)合水凝膠的FT-IR圖譜。PVA分子鏈上帶有許多可反應(yīng)羥基，環(huán)氧氯丙烷在堿性條件下可與羥基發(fā)生反應(yīng)[15]。從圖中可以看出，3 439、3 432、3 437 cm-1處分別為XG、PVA和XG/PVA復(fù)合水凝膠的羥基伸縮振動(dòng)峰，是分子鏈上羥基存在分子間或分子內(nèi)的氫鍵振動(dòng)吸收造成的，說(shuō)明通過(guò)冷凍-解凍循環(huán)可以使凝膠分子鏈間產(chǎn)生氫鍵等形成物理交聯(lián)；1 110 cm-1處為醚鍵的吸收峰，可以看出在交聯(lián)后，XG/PVA復(fù)合水凝膠有一個(gè)較寬的醚鍵吸收峰，說(shuō)明反應(yīng)可能有新的醚鍵生成，發(fā)生了化學(xué)交聯(lián)[15-16]。可見(jiàn)，通過(guò)化學(xué)與物理交聯(lián)作用，XG與PVA交聯(lián)成功。

圖3 XG/PVA水凝膠的SEM

圖4 XG/PVA水凝膠的紅外光譜圖

2.5 XG/PVA水凝膠的pH敏感性

圖5為pH值對(duì)XG/PVA復(fù)合水凝膠平衡溶脹的影響曲線。從圖中可以看出，該凝膠在酸性及堿性環(huán)境中的溶脹率均高于中性條件下的溶脹率，這是因?yàn)樵趬A性環(huán)境中時(shí)，XG側(cè)鏈中的-COOH基團(tuán)去質(zhì)子化，電離成-COO-使凝膠帶有負(fù)電荷，電荷的相互排斥使凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)疏松易于溶脹；在酸性環(huán)境中，XG中-COOH基團(tuán)質(zhì)子化，水凝膠中含有大量親水基團(tuán)，高分子鏈上的羥基被質(zhì)子化而帶正電荷，致使分子鏈間相互排斥，伸展結(jié)構(gòu)，使凝膠表現(xiàn)出較大的溶脹率。表明了pH值的變化會(huì)造成該凝膠高分子鏈基團(tuán)的質(zhì)子化/去質(zhì)子化的變化，使得鏈段的溶脹率平衡發(fā)生變化[2-3]。

圖5 不同pH的XG/PVA水凝膠的平衡溶脹率

2.6 XG/PVA水凝膠的pH響應(yīng)性

圖6為XG/PVA水凝膠的溶脹-消溶脹曲線。從圖中可以看出，XG/PVA水凝膠置于酸或堿pH緩沖液中2 h該凝膠溶脹率增加，取出置于pH=7.0的PBS中2 h溶脹率降低，在置于酸或堿pH緩沖液2 h后溶脹率又增加，如此交替浸泡呈現(xiàn)出一種“∧”的趨勢(shì)。說(shuō)明該凝膠對(duì)pH的改變具有一定的響應(yīng)性，且其溶脹收縮過(guò)程可逆，在作為控制藥物釋放方面發(fā)揮出一定作用[17]。

圖6 XG/PVA水凝膠的溶脹-消溶脹行為

2.7 不同pH下包埋BSA的水凝膠體外釋放行為

圖7為不同pH值對(duì)BSA體外釋放的影響曲線。從圖中可以看出，XG/PVA水凝膠在酸性條件下和堿性條件下的BSA體外累積釋放率均高于中性條件下，可能是因?yàn)槟z高分子鏈在強(qiáng)酸堿環(huán)境下呈舒展?fàn)顟B(tài)，伸展結(jié)構(gòu)為BSA的擴(kuò)散打開(kāi)了通道。而在中性環(huán)境下呈卷曲狀態(tài)，阻礙了BSA的釋放通道[18-20]。表明了環(huán)境中pH值對(duì)BSA的釋放具有明顯的控制作用。

圖7 不同pH的XG/PVA水凝膠的BSA體外釋放

2.8 XG/PVA復(fù)合水凝膠的細(xì)胞相容性

將MG63細(xì)胞與XG/PVA復(fù)合水凝膠共培養(yǎng)，用熒光倒置顯微鏡觀察材料周?chē)?xì)胞生長(zhǎng)情況。從圖8(a)中可以看出，4天時(shí)，大量梭形細(xì)胞在材料周?chē)鲋成L(zhǎng)，并可以保持良好的細(xì)胞形態(tài)。圖8(b)則表明細(xì)胞與材料共培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞有明顯的增殖，表明XG/PVA復(fù)合水凝膠具有良好的細(xì)胞相容性，可維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)增殖。

圖8 XG/PVA水凝膠的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

3 結(jié)論

本文利用化學(xué)交聯(lián)結(jié)合物理交聯(lián)制備出了pH敏感型XG/PVA復(fù)合水凝膠，研究了其溶脹性能、力學(xué)性能、pH響應(yīng)性能、BSA體外釋放性能及其生物相容性。

(1)當(dāng)XG與PVA質(zhì)量比為1 : 5時(shí)，交聯(lián)劑用量為5%時(shí)，冷凍-解凍循環(huán)3次時(shí)XG/PVA水凝膠具有良好的溶脹性能和力學(xué)性能，溶脹率達(dá)到241%。壓縮彈性模量和壓縮強(qiáng)度分別達(dá)到(26.30±0.03)kPa和(134.36±0.43)kPa。

(2)通過(guò)SEM觀察，XG/PVA復(fù)合水凝膠形成了互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；從FT-IR結(jié)果表明XG與PVA形成了復(fù)合水凝膠。

(3)XG/PVA復(fù)合水凝膠具有良好的pH刺激響應(yīng)性，對(duì)BSA的釋放也表現(xiàn)出了良好的控制緩釋效果，且細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果表明，該凝膠周?chē)?xì)胞生長(zhǎng)良好，形態(tài)正常，表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性，有望用于控制藥物釋放載體。