高脂飼養(yǎng)C57BL/6J小鼠腎周脂肪組織炎性反應(yīng)的評(píng)估

楊 永，李梓玉，楊 偉，劉 勇，2*

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 病理科, 四川 瀘州 646000； 2.核醫(yī)學(xué)與分子影像四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 瀘州 646000)

隨著現(xiàn)代人的生活方式轉(zhuǎn)變以及生活水平的提高，肥胖人群逐年增多，肥胖的危害性日益凸顯，既往文獻(xiàn)報(bào)道，肥胖通常伴隨低度慢性炎性反應(yīng)[1]。肥胖所導(dǎo)致的機(jī)體多種代謝異常，包括胰島素抵抗、脂代謝紊亂、糖代謝紊亂改變等與慢性炎性反應(yīng)密切相關(guān)[2]。

巨噬細(xì)胞是分布于機(jī)體多種組織的一種重要免疫細(xì)胞。在適當(dāng)?shù)拇碳は?，巨噬?xì)胞被激活為一種炎癥狀態(tài)，可以大致分為M1型和M2型兩類，兩者在功能和標(biāo)志物等方面具有顯著差異。M1型表達(dá)CD11c，M2型表達(dá)CD206，M1型響應(yīng)Th1型細(xì)胞因子呈促炎的表型，釋放IL-6、IL-1β等促炎性因子。M2型響應(yīng)Th2型細(xì)胞因子呈抗炎的表型，釋放IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β1、Fn1等抗炎性因子。因此促進(jìn)M1型向M2型轉(zhuǎn)化，可以達(dá)到減輕脂肪組織炎性反應(yīng)并改善脂肪組織功能障礙的目的，肥胖引起的脂肪組織炎性反應(yīng)浸潤(rùn)的炎細(xì)胞以M1型巨噬細(xì)胞為主，肥胖時(shí)脂肪組織功能失調(diào)，導(dǎo)致脂肪組織內(nèi)部缺氧繼而發(fā)生壞死，能進(jìn)一步吸引巨噬細(xì)胞聚集，促進(jìn)脂肪組織功能失調(diào)和炎性反應(yīng)之間的惡性循環(huán)[3-4]。脂肪組織巨噬細(xì)胞(adipose tissue macrophages，ATMs)的聚集、蓄積并在脂肪組織局部原位增殖等是慢性炎性反應(yīng)相關(guān)肥胖和機(jī)體多種代謝性疾病的主要關(guān)鍵病因。本研究采用高脂飼養(yǎng)(high-fat diet, HFD)的C57BL/6J肥胖小鼠，檢測(cè)其腎周脂肪組織炎性因子及炎細(xì)胞浸潤(rùn)情況，評(píng)估本實(shí)驗(yàn)所造的肥胖相關(guān)腎病模型腎周脂肪組織是否存在炎性反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.2 主要試劑：CD206、TGF-β1、Fn1、IL-10單克隆抗體(廈門慧嘉生物科技有限公司)；TNF-α、IL-1β、CD11c、MCP-1單克隆抗體和F4/80單克隆抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分組及處理:將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(control組)及高脂飼養(yǎng)組(HFD組)，每組6只，對(duì)照組飼喂正常飼料(脂肪14%，蛋白質(zhì)26%，碳水化合物60%)，高脂飼養(yǎng)組在適應(yīng)性喂食正常飼料1周后接受連續(xù)14周的高脂飼料(脂肪45%，蛋白質(zhì)20%,碳水化合物35%)飼養(yǎng)(D12451; Research Diet，New Brunswick，NJ)。14周末處死小鼠，剝離雙側(cè)腎臟及腎周脂肪。

1.2.2 用RT-qPCR檢測(cè)腎周脂肪組織中TNF-α、CD11c、IL-1β、MCP-1、IL-10、TGF-β1、CD206和Fn1 mRNA的表達(dá)量:收集腎周脂肪組織，浸泡在RNA later中，首先進(jìn)行腎周脂肪組織總RNA抽提：從RNA later中取出腎周脂肪組織，4 ℃下充分勻漿，吸取上清，移入不含RNA酶的離心管內(nèi)，加入氯仿200 μL，經(jīng)過(guò)15 s劇烈振蕩后，放在冰上靜置2 min，經(jīng)12 000×g離心15 min，將離心后的上清液轉(zhuǎn)入新的無(wú)RNA酶離心管，加異丙醇500 μL，充分混勻，靜置10 min，12 000×g離心10 min，棄上清，用75%乙醇1 mL洗滌，再經(jīng)過(guò)7 500×g心5 min，棄上清；用100 μL RNase-Free 水溶解即為提取的總RNA。立即進(jìn)行后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)腎周脂肪及腎實(shí)質(zhì)F4/80、CD68和LCA的表達(dá):制作白片，脫蠟至水；二甲苯Ⅰ、II處理后，梯度乙醇脫水各5 min；抗原修復(fù)：2% EDTA修復(fù)液(pH=9.0)進(jìn)行高壓修復(fù)；室溫下3%甲醇浸泡；再分別滴加一抗和第二抗，分別在27 ℃孵育60 min、30 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染；0.1%稀鹽酸分化，飽和碳酸鋰反藍(lán)；顯微鏡下觀察并采集圖片。運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0彩色圖像分析軟件進(jìn)行定量分析：選取切片中棕黃色陽(yáng)性染色區(qū)域，分析各視野下陽(yáng)性吸光度(intensive absorbance，IA)及陽(yáng)性面積(area)，計(jì)算平均吸光度(IA/area×100%)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 腎周脂肪組織巨噬細(xì)胞極化表型

與對(duì)照組相比，高脂飼養(yǎng)組腎周脂肪組織TNF-α、CD11C、IL-1β、MCP-1基因的mRNA表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)(圖1)。

2.2 腎周圍脂肪組織及腎臟實(shí)質(zhì)內(nèi)ATMs及炎細(xì)胞

腎周脂肪組織內(nèi)出現(xiàn)較多量的以ATMs浸潤(rùn)為主的炎細(xì)胞，與對(duì)照組相比，高脂飼養(yǎng)組腎周脂肪巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80, CD68及炎細(xì)胞廣譜標(biāo)志物L(fēng)CA的表達(dá)均呈高表達(dá)(P<0.05)(圖2～4，表1)。

表1 兩組小鼠腎周脂肪組織中F4/80、CD68和LCA蛋白免疫組化平均吸光度值比較

*P<0.05 compared with control group圖1 兩組小鼠腎周脂肪組織各炎性因子mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較

圖2 免疫組化顯示兩組小鼠腎周脂肪組織F4/80、CD68和LCA蛋白的表達(dá)

3 討論

全球的肥胖人口明顯增加使人類健康面臨極大的問(wèn)題，給全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)，流行病學(xué)研究表明肥胖與胰島素抵抗、脂代謝紊亂、心血管疾病、慢性炎癥等密切聯(lián)系，巨噬細(xì)胞向M2型方向轉(zhuǎn)化有助于調(diào)節(jié)肥胖相關(guān)的炎性反應(yīng)和胰島素抵抗，已成為肥胖相關(guān)代謝性疾病的新療法的重要靶點(diǎn)[5]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)在肥胖的動(dòng)物模型脂肪組織內(nèi)分泌量增加，這是首次將肥胖與炎性反應(yīng)聯(lián)系起來(lái)[6]。肥胖條件下，脂肪組織主要浸潤(rùn)的炎細(xì)胞是促炎性的M1型巨噬細(xì)胞[7-8]。M1型巨噬細(xì)胞能釋放促炎性因子(如IL-1β、IL-6等)，炎性因子進(jìn)一步刺激M1型巨噬細(xì)胞分泌炎性因子，募集更多M1型巨噬細(xì)胞，最終形成脂肪組織功能障礙與炎性反應(yīng)的惡性循環(huán)，并且炎性因子干擾脂肪細(xì)胞的胰島素相關(guān)信號(hào)通路，可導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生[9-10]。

圖3 免疫組化顯示兩組小鼠腎實(shí)質(zhì)F4/80、CD68和LCA蛋白的表達(dá)Fig 3 F4/80, CD68 and LCA proteins in renal parenchyma of mice in two groups by immunohistochemistry(×200)

IHC.immunohistochemistry;*P<0.05 compared with control group圖4 兩組小鼠腎周脂肪組織巨噬細(xì)胞定量分析Fig 4 Quantitative analysis of macrophages in perirenal adipose tissue of mice in two groups

巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物在高脂飼養(yǎng)小鼠白色脂肪組織中的表達(dá)量升高，巨噬細(xì)胞較特異的標(biāo)志物F4/80陽(yáng)性，并且陽(yáng)性比例明顯升高[11]。因此，本研究選用了較為特異的巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80，但也存在低表達(dá)及檢測(cè)不到的情況，因此，選擇了其他巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68聯(lián)合使用[12]，此外還選用了炎細(xì)胞廣譜標(biāo)志物L(fēng)CA對(duì)腎實(shí)質(zhì)及腎周脂肪組織進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)果提示HFD組腎周脂肪組織和腎實(shí)質(zhì)內(nèi)都發(fā)生了炎性反應(yīng)，但主要發(fā)生在腎周脂肪組織。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)HFD組腎周脂肪組織中主要為M1型巨噬細(xì)胞分泌的炎性因子，而M2型巨噬細(xì)胞分泌的炎性因子沒(méi)有明顯升高，可能是高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖相關(guān)腎病腎周脂肪炎性反應(yīng)主要為促炎型巨噬細(xì)胞M1型主導(dǎo)。本研究結(jié)果與大多數(shù)關(guān)于肥胖導(dǎo)致的脂肪組織炎性反應(yīng)特點(diǎn)較為一致；推測(cè)其作用機(jī)制與高脂飲食介導(dǎo)TLR-4炎性信號(hào)通路活化并產(chǎn)生大量炎性因子有關(guān)。

大量研究結(jié)果表明，肥胖引起的脂肪組織炎性反應(yīng)主要以M1型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)為主的原因與TLR4-MyD88信號(hào)通路密切相關(guān)，TLR4-MyD88信號(hào)通路刺激ATMs分泌白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)，通過(guò)IL-1β刺激骨髓增生，從而單核細(xì)胞趨化進(jìn)入又形成新的ATMs，如此形成惡性循環(huán)，結(jié)果就是使脂肪組織內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量急劇增加，脂肪組織炎性反應(yīng)加重[13-14]。有學(xué)者通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食可介導(dǎo)TLR-4信號(hào)通路活化，使IL-1β、IL-6等炎性因子在脂肪組織中的含量升高，從而導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)代謝異常等改變[15]。巨噬細(xì)胞M1型與M2型的調(diào)節(jié)是一個(gè)較為復(fù)雜的過(guò)程。干擾ATMs的蓄積、募集以及在脂肪組織局部原位增殖并促進(jìn)ATMs向M2型方向轉(zhuǎn)化可能成為預(yù)防和治療肥胖相關(guān)代謝異常性疾病的靶點(diǎn)。