兔頸動脈血流灌注減少促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)

生 燕，李秀毛，郭 欣，謝 仟，黃仁杰，生 欣

(遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 1.形態(tài)學(xué)實驗室； 3.生物化學(xué)教研室，貴州 遵義 563000;2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 胸心外科， 貴州 遵義 563000)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性炎性疾病，炎性反應(yīng)在其發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[1]。大量研究顯示血流灌注減少導(dǎo)致的血液流速降低能夠重排內(nèi)皮細(xì)胞骨架進(jìn)而誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)[2-3]。然而，其調(diào)控機制還不清楚。平面細(xì)胞極性信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞極性的重要通路[4]，不僅與內(nèi)皮細(xì)胞的炎性密切相關(guān)[5]，且其核心蛋白凡客蛋白(Van Gogh protein, VANGL2)和蓬亂蛋白(dishevelled，DVL2)等還能夠介導(dǎo)微管等細(xì)胞骨架動力學(xué)變化。然而，這兩種蛋白是否參與了血流灌注減少誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞骨架重排還未見報道。本課題組在細(xì)胞水平的研究顯示兩者在不同流速的血流作用下差異表達(dá)，本研究進(jìn)一步在動物水平上探索其與內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)以及細(xì)胞骨架重排之間的關(guān)系，為探究血流灌注改變導(dǎo)致血管炎性反應(yīng)的機制提供新的資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級的新西蘭兔15只，2月齡，體質(zhì)量(2.0±0.2)kg(重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[許可證號：SCXK(渝)2018-2003])。

1.1.2 試劑：GAPDH 抗體、DVL2 抗體、γ-tubulin抗體、MCP-1 抗體、BBS8 抗體、 VANGL2 抗體以及羊抗兔二抗、兔抗小鼠二抗和兔抗羊二抗等(Proteintech公司)；BCA定量試劑盒、蛋白上樣緩沖液、Tween-20、PMSF(100 mmol/L)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；PBS干粉、SDS-PAGE配膠試劑盒、高效Ripa組織/細(xì)胞快速裂解液、glycine/SDS/Tris(SoLarbio公司)；PCR引物(上海生工生物工程公司合成)；CLarityTMWestern ECL Substrate(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 兔的分組及處理：將兔分為對照組、套管組(參考文獻(xiàn)[5]的方法行左側(cè)頸動脈套管術(shù)建立兔頸動脈狹窄模型，喂以正常飼料)、高脂組(喂以高脂飼料，成分為：5%豬大油、1%白糖、2%膽固醇、0.12%丙基硫氧嘧啶、1%維生素D、0.125%硫酸亞鐵)。

1.2.2 組織的取材：普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，以手術(shù)后為時間起點，繼續(xù)喂養(yǎng)9周后，取套管遠(yuǎn)側(cè)頸總動脈血管，置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 HE染色檢測內(nèi)膜:組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片；二甲苯與梯度乙醇脫蠟。蘇木精染色5 min，自來水沖洗；鹽酸乙醇分化30 s后自來水浸泡15 min；伊紅液染色2 min；梯度乙醇與二甲苯脫水，透明，中性樹膠封片。

1.2.4 免疫組化觀察目的蛋白的定位：參照免疫組化試劑盒說明，切片分別置于二甲苯與梯度乙醇進(jìn)行脫蠟，在檸檬酸溶液中高壓煮沸兩次，6 min/次。冷卻后， TBST溶液沖洗3次，每次3 min。3%的H2O2溶液中避光封閉過氧化物酶15 min。PBS溶液沖洗3次，每次3 min。100 μL的小鼠免疫蛋白A封閉10 min后甩干。一抗(1∶1 000)10 μL 4 ℃過夜孵育。室溫復(fù)溫20 min后， TBST溶液沖洗5 min 3次。試劑B 100 μL 37 ℃孵育20 min，PBS沖洗3次，每次3 min。試劑C 100 μL 37 ℃ 酶聯(lián)孵育10 min。PBS沖洗3次，每次3 min。DAB顯色試劑孵育10 min，純水沖洗5 min。蘇木精復(fù)染1 min后水沖5 min。1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒后水沖3 min，梯度乙醇與二甲苯脫水，中性材料樹膠封片。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測目的基因的表達(dá)：于液氮中磨碎頸總動脈，加入1 mL Trizol裂解液，形成勻漿，參照試劑盒說明進(jìn)行總RNA提取，微量核酸蛋白定量儀檢測RNA濃度與純度，-20 ℃儲存用于熒光定量PCR實驗。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA加入至20 μL反應(yīng)體系中， 以GAPDH做內(nèi)參。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃；熒光定量反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；65 ℃ 5 s，95 ℃ 5 min。目的基因的相對表達(dá)量通過公式2-△△Ct進(jìn)行相對定量分析計算。目的基因引物設(shè)計(表1)。

表1 Real-time PCR所用引物的序列Table 1 Sequence of primers used in real-time PCR

1.2.6 Western blot檢測目的蛋白的表達(dá)：組織于液氮中研磨至粉末狀，分裝離心管內(nèi)并做好標(biāo)記。加入100 μL裂解液后，振蕩30 min，5 min/次，4 ℃，1 200 r/min離心20 min，取上清液，16倍稀釋后BCA法測蛋白濃度，按照濃度補加裂解液，再以1∶4比例加入上樣緩沖液(×5)，沸水浴10 min后做好標(biāo)記置于-2 ℃儲存。

制備凝膠，Marker(蛋白標(biāo)準(zhǔn))上樣量4 μg，蛋白樣品上樣量10 μg，上樣順序從左至右分別為Marker、正常樣品、高脂組樣品、套管組樣品、Marker。SDS-PAGE電泳后，低溫200 mA電轉(zhuǎn)120 min，PVDF膜常溫下封閉2 h，TBST洗滌6次，每次5 min。一抗4 ℃過夜孵育，其中，GAPDH 抗體(1∶5 000)，DVL2 抗體(1∶1 000)，γ-tubulin抗體(1∶1 000)，MCP-1 抗體(1∶1 000)， BBS8 抗體(1∶1 000)，VANGL2 抗體(1∶1 000)。TBST洗滌6次，每次5 min。二抗常溫下孵育2 h，其中，羊抗兔IgG(1∶1 000)；羊抗小鼠IgG(1∶1 000)；兔抗羊IgG(1∶1 000)。TBST洗滌6次，每次5 min。ECL曝光顯影，采用Image LabTM軟件對蛋白顯影圖像吸光度值進(jìn)行分析。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白吸光度值/內(nèi)參蛋白GAPDH吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 組織形態(tài)學(xué)觀察和平面細(xì)胞極性信號通路核心蛋白DVL2與VANGL2的表達(dá)定位

與對照組相比(圖1A)高脂組胞質(zhì)分布散在，血管壁完整且輕微增厚，內(nèi)膜邊界清晰(圖1B)；而套管組胞質(zhì)分布不均勻，血管壁完整且明顯增厚，內(nèi)膜增生更為嚴(yán)重(圖1C),與對照組相比，套管組內(nèi)膜與中膜的比值I/M顯著增加(圖1D)。DVL2，VANGL2蛋白的陽性產(chǎn)物主要定位于內(nèi)膜，對照組無棕黃陽性顆粒(圖2A，A’)，而高脂組與套管組胞質(zhì)均有棕黃陽性顆粒，且兩組陽性顆粒均主要定位于內(nèi)膜增生處(圖2B，C，B’，C’)。更為重要的是，套管組內(nèi)膜增生處的陽性顆粒遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于高脂組。相比，VANGL2來說，DVL2的表達(dá)量更多(圖2C，C’，D)。

A-C. HE staining; D.area of intima-to-media; I/M.(intima-to-media ratio) between each group; *P<0.01 compared with control group; scale bar=200 μm; the arrows indicate intimal hyperplasia

A-C.histological localization of DVL2; A’-C’.histological localization of VANGL2; D.DVL2 and VANGL2 expression in each group;bar=200 μm; *P<0.01 compared with high-fat group; #P<0.01 compared with VANGL2 in cannula

2.2 Real-time PCR檢測VANGL2、DVL2、γ-tubulin、MCP-1 mRNA表達(dá)

高脂組MCP-1 mRNA表達(dá)與對照組無明顯差異，高脂組γ-tubulin與VANGL2 mRNA的表達(dá)較對照組上調(diào)(P<0.05)，而套管組DVL2、VANGL2、γ-tubulin、MCP-1 mRNA的表達(dá)較對照組明顯上調(diào)(P<0.01)(圖3，表1)。

*P<0.05, **P<0.01 compared with control group圖3 各組蛋白 mRNA的相對表達(dá)量Fig 3 Relative expression of mRNA in each group

2.3 Western blot檢測各組血管中DVL2、VANGL2、BBS8、γ-tubulin與 MCP-1的蛋白表達(dá)的影響

高脂和套管組的組織中的MCP-1蛋白表達(dá)均高于對照組(P<0.05)，且呈遞增趨勢。此外，平面細(xì)胞極性信號通路核心蛋白DVL2與VANGL2，微管組織中心蛋白BBS8，γ-tubulin在套管組的表達(dá)也較對照組上調(diào)，與MCP-1呈現(xiàn)同步改變(圖4)。

3 討論

在心血管系統(tǒng)中，血管分支和彎曲等部位由于血流灌注減少導(dǎo)致血液流速降低，成為AS發(fā)生的高風(fēng)險區(qū)域，即AS發(fā)生具有局灶性特征[6]。盡管血流灌注減少作為AS發(fā)生的風(fēng)險因素已經(jīng)受到了廣泛的認(rèn)同，但其導(dǎo)致AS血管重建的分子機制仍未闡明。課題組前期對不同流速的血流加載的血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和GO富集分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因主要富集到炎性反應(yīng)等通路， 提示血流灌注減少能夠?qū)е卵軆?nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)。在本研究中，通過構(gòu)建兔頸動脈狹窄模型導(dǎo)致血流灌注減少，結(jié)果顯示，高脂飲食和頸動脈狹窄模型動脈中MCP-1表達(dá)均高于正常動脈，且動脈狹窄模型中表達(dá)最高，表明MCP-1在兩種不同因素導(dǎo)致AS過程中均發(fā)揮了作用，且其對于血液流速變化更為敏感。鑒于大量的研究證實MCP-1可通過多種途徑直接參與或影響動脈粥樣硬化慢性炎性反應(yīng)的多個病理過程[7-9]，因此推測MCP-1參與了動脈狹窄導(dǎo)致的血管炎性反應(yīng)。

A.immunoblotting images of proteins in each group; B.relative expression of proteins in each group; *P<0.05,**P<0.01 compared with control group

研究顯示血流灌注減少導(dǎo)致的血液流速降低能夠?qū)е聝?nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)梭型，并發(fā)生微絲與微管的重排[10-11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)作為微管組織中心蛋白的BBS8、γ-tubulin在套管導(dǎo)致的狹窄血管中高表達(dá)，且較高脂組和對照組均差異顯著。表明血流灌注減少變化通過調(diào)控微管組織中心蛋白改變微管的重排，從而調(diào)控細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化，最終參與了AS的發(fā)生過程，因此，也可能參與了血管灌注減少誘導(dǎo)的血管重建過程。由于平面細(xì)胞極性信號通路與AS的發(fā)生相關(guān)[12]。本研究顯示血液流速的改變不但會導(dǎo)致血管內(nèi)膜增厚，還會影響該通路的核心蛋白DVL2和VANGL2的表達(dá)。形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)檢測均顯示DVL2及VANGL2的在套管組中顯著上調(diào)，表明平面細(xì)胞極性信號通路通過其核心蛋白DVL2和VANGL2參與了血流灌注減少導(dǎo)致的AS發(fā)生。此外，越來越多的研究顯示，細(xì)胞骨架的重排與平面細(xì)胞極性信號通路密切相關(guān)[13-14]，而課題組前期結(jié)果顯示在細(xì)胞水平上分別干擾DVL2和VANGL2的表達(dá)能夠抑制低切應(yīng)力上調(diào)的BBS8和γ-tubulin的表達(dá)[15]，表明血流灌注減少通過DVL2和VANGL2調(diào)控微管骨架的重排。

此外，盡管血流灌注變化與高脂血癥均是導(dǎo)致AS發(fā)生的風(fēng)險因素，但兩者在AS發(fā)生過程中的主次要作用關(guān)系還未見報道。在本研究中，盡管高脂組各項指標(biāo)較對照組有所增加，但較套管組，其變化甚微?？赡艿脑蛟谟?，相比血流灌注減少導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞急性炎性反應(yīng)，高脂血癥在此過程中的作用可能為長期的慢性的炎性反應(yīng)過程，因此，在AS發(fā)生早期，血流灌注改變導(dǎo)致的炎性反應(yīng)更為明顯。

綜上所述，低切應(yīng)力作用能夠通過誘導(dǎo)血管MCP-1的上調(diào)參與AS早期發(fā)生發(fā)展，并通過DVL2與VANGL2微管組織中心蛋白BBS8和γ-tubulin調(diào)控微管類細(xì)胞骨架的重排。