液相色譜-質(zhì)譜法測定動物源性食品中的三聚氰酸及其同系物

梁愛勇 / 品測（上海）檢測科技有限公司

0 引言

三聚氰胺及其同系物三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺，都是重要的化工原料，本身的毒性不高，但如果被人體攝入，會引起腎結(jié)石或膀胱結(jié)石等病癥，甚至引起腎衰竭，影響身體健康[1]。以三聚氰胺-甲醛樹脂為原料合成的密胺餐具、食品包裝材料等，經(jīng)光照、加熱或遇酸時，殘留的三聚氰胺和三聚氰酸單體會向與之接觸的食品遷移，從而污染食品，危害人體健康[2]。

目前檢測三聚氰酸的分析方法很多，包括氣質(zhì)聯(lián)用法、高效液相色譜法等[3-5]。但尚未有對動物源性食品中三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺同時進(jìn)行檢測的分析方法。本實驗建立了測定動物源性食品中三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺的高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法[6-7]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑

三聚氰酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度大于等于99%；三聚氰酸一酰胺標(biāo)準(zhǔn)品：純度大于等于99%；三聚氰酸二酰胺：純度大于等于99%，均來自美國Dima Technology Inc公司。

甲醇、乙腈：色譜純，來自德國Merck試劑公司；實驗用水為實驗室自制的超純水。

動物源性食品樣品：液態(tài)乳、畜禽肉類加工品，均采樣自上海各大超市。

1.1.2 儀器

液相質(zhì)譜聯(lián)用儀（ESI源）8050：日本島津；電子分析天平XS205DU：美國梅特勒-托利多；電子分析天平PL1502-S：美國梅特勒-托利多；超聲波儀2300TH：上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

三聚氰酸類標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別稱取約0.01 g（準(zhǔn)確至0.000 01 g）的三聚氰酸類標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL的容量瓶中，用甲醇配制成約1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于4 ℃冰箱內(nèi)避光保存，工作溶液逐級稀釋。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

取有代表性樣品，用剪刀剪碎，面積不得大于2 mm×2 mm，混合均勻，待用。

1.3.2 樣品前處理

稱取約0.5 g動物源性食品樣品（精確至0.001 g），于10 mL離心管中，加入大約9 mL乙腈水溶液（8:2，V:V），渦旋3 min后，在超聲波中超聲30 min，每隔5 min振搖1次，保持固相完全分散。取出放置至室溫，定量轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加乙腈水溶液（8:2，V:V）稀釋至分度，混勻。溶液經(jīng)濾紙過濾后，取部分溶液于轉(zhuǎn)速10 000 r/min，4 ℃下離心15 min，取上清液經(jīng)過0.25 μm有機(jī)濾膜于進(jìn)樣小瓶中，進(jìn)樣分析。

1.3.3 樣品加標(biāo)提取

分別稱取9個0.5 g空白動物源性食品樣品，置于10 mL離心管中，加入15 μL、30 μL、150 μL三聚氰酸類混合標(biāo)樣后加入大約9 mL乙腈水溶液（8:2，V:V），渦旋3 min后，在超聲波中超聲30 min，每隔5 min振搖1次，保持固相完全分散。取出放置至室溫，定量轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加乙腈水溶液（8:2，V:V）稀釋至分度，混勻。溶液經(jīng)濾紙過濾后，取部分溶液于轉(zhuǎn)速10 000 r/min，4 ℃下離心15 min，取上清液上機(jī)分析，同時做平行試驗。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：UPLC BEH Amide（2.1 mm×100 mm×1.7 μm），流動相：A為10%乙酸銨水溶液 B為乙腈；梯度洗脫程序：0 min（87%B）→0.15 min（87%B）→2 min（55%B）→2.5 min（40%B）→5.5 min（40%B）→5.51 min（87%B）→7.5 min（87%B）；柱溫箱溫度：40 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流速：0.4 mL/min。

1.3.5 質(zhì)譜條件檢測類型：電噴霧離子源，正負(fù)離子掃描模式（Electrospray ionization，ESI+&ESI-）；

檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（Multiple Reaction Monitor，MRM）；

接口溫度：350 ℃；

DL溫度：200 ℃；

加熱模塊溫度：200 ℃；

霧化氣流速：3.0 L/min；

加熱氣流速：12.0 L/min；

干燥氣流速：8.0 L/min。

表1 質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測條件

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

由三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺的化學(xué)性質(zhì)可知，這三種物質(zhì)在高溫下較不穩(wěn)定，在超聲波水浴提取中超聲波提取過程會產(chǎn)生較多的熱量，影響三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺的穩(wěn)定性。因此，本文優(yōu)化了超聲波提取的溫度條件。

經(jīng)對比試驗，第一組在超聲波提取過程中不控制水溫，連續(xù)超聲30 min；第二組在超聲波提取過程中通過添加冰水，控制水溫不超過20 ℃；第三組在超聲波提取過程中通過添加冰水，控制水溫不超過30 ℃；第四組在超聲波提取過程中通過添加冰水，控制水溫不超過40 ℃。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：第一組和第四組的回收率均不理想，平均回收率分別為62%和73%，而第二組和第三組的回收率均比較理想，平均回收率分別為94%和96%，因此，在超聲波前處理過程中，應(yīng)控制超聲波的水溫不得超過30 ℃。

2.2 色譜條件優(yōu)化

對10.0 μg/mL的三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，得到三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺的質(zhì)譜圖，見圖1～3。由此可知，在設(shè)定條件下，三聚氰酸類物質(zhì)雖不能較好地被分離，但可以通過不同的母離子/子離子對得到區(qū)分。

圖1 三聚氰酸質(zhì)譜圖

圖2 三聚氰酸一酰胺質(zhì)譜圖

圖3 三聚氰酸二酰胺質(zhì)譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在設(shè)定條件下，分別測定0.05 mg/L、0.5 mg/L、10 mg/L、100 mg/L 、250 mg/L三聚氰酸類標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，各組分質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。重復(fù)進(jìn)樣20次空白動物源性樣品，計算其噪聲的標(biāo)準(zhǔn)偏差Sb，按式（1）得到儀器檢出限。

式中：b—— 標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率

將儀器檢出限乘以稀釋倍數(shù)，除以稱樣量，結(jié)合基質(zhì)干擾確定方法檢出限、定量限。三聚氰酸類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表2。

表2 三聚氰酸類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.4 加標(biāo)回收試驗

按1.3.3實驗方法對空白動物源性食品樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，結(jié)果見表3。由此可知，平均回收率為92.7%～101.6%。

表3 加標(biāo)回收試驗結(jié)果

2.5 精密度試驗

在空白動物源性食品樣品中添加0.5 mg/kg三聚氰酸類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行測定6次，測定結(jié)果及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表4。由此可知，各組分測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，該方法適用于動物源性食品樣品中三聚氰酸類物質(zhì)的定量分析，精密度良好。

表4 精密度試驗結(jié)果

2.6 動物源性食品測定結(jié)果

采用本方法測定從上海各超市采樣獲得的6件動物源性食品樣品，測定結(jié)果如表5所示。

表5 各種動物源性食品樣品測定結(jié)果

由表5的測定結(jié)果可知，部分樣品還是存在三聚氰酸或三聚氰酸一酰胺，分析原因可能為包裝材料遷移或不法經(jīng)銷商添加所致。

3 結(jié)語

通過優(yōu)化樣品前處理方法，經(jīng)過對比實驗發(fā)現(xiàn)，控制超聲波提取的水浴溫度不超過30 ℃，即可得到較好的前處理效果。同時采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法對動物源性食品中的三聚氰酸類物質(zhì)進(jìn)行測定，三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺的濃度范圍均在0.05～250 mg/L內(nèi)線性關(guān)系良好（r2≥0.99），加標(biāo)回收率均在92.7%～101.6%之間，精密度≤10%，方法簡便、快速，測定結(jié)果準(zhǔn)確?？梢杂糜趧游镌葱允称分械娜矍杷犷愇镔|(zhì)的日常監(jiān)測。