微動力負壓護創(chuàng)對糖尿病大鼠創(chuàng)面血管生成及其受體表達的影響〔1〕

朱艷，宗明，盛霞，江芳芳，胡玲，熊國平，付海燕，秦淑蘭*

(1.南昌大學第三附屬醫(yī)院，江西 南昌 330008；2.南昌市第三醫(yī)院，江西 南昌 330008)

糖尿病足創(chuàng)面屬于難治性創(chuàng)面，其特點是致殘率高、花費高、病程長，給患者和家庭帶來了沉重負擔。目前研究證實[1]，創(chuàng)面的愈合過程大致包括了早期(炎癥反應(yīng)期)、中期(細胞組織增生期)及晚期(組織結(jié)構(gòu)及功能重塑期)。臨床常見的全身性疾病合并慢性潰瘍、壓瘡等慢性創(chuàng)面時，由于組織的嚴重缺損及反復(fù)發(fā)作的炎癥常導致創(chuàng)面不能自愈。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，近年來出現(xiàn)的負壓創(chuàng)面治療技術(shù)被證實具有明顯減輕創(chuàng)面水腫、縮短創(chuàng)面愈合時間、增加創(chuàng)面血液供應(yīng)的作用，被廣泛應(yīng)用于治療各種慢性創(chuàng)面，并取得了良好的效果。微動力負壓技術(shù)是一種全新的臨床封閉治療方法，屬于負壓創(chuàng)面治療技術(shù)的一種，但其優(yōu)點在于治療期間患者的活動更加方便，利用新型材料覆蓋創(chuàng)面后再用醫(yī)用透明貼膜完全貼合密封，創(chuàng)造密閉負壓環(huán)境達到治療效果。目前微動力負壓護創(chuàng)治療對燒傷創(chuàng)面的作用機制可見少量報道，但對糖尿病足創(chuàng)面血管的分子信號通路影響，國內(nèi)外尚無深入的研究，本文就此展開研究，報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取50 只雄性無特定病原體(SPF)級封閉群級斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?SD)大鼠(由南昌大學實驗動物中心提供，8 周齡，體質(zhì)量200～250 g)，進行1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(25±1) ℃，飼養(yǎng)濕度(50±2)%，符合中國國家技術(shù)委員會頒布的《實驗動物管理條例》[2]。采用隨機數(shù)字表法將其分為觀察組與對照組，每組25 只。

1.2 實驗主要材料及試劑

多聚甲醛(購自美國Sigma公司)；CD31抗體(購自美國R&D公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自日本TaKaRa公司)；SYBR Green熒光定量檢測試劑盒(購自日本TaKaRa公司)；微動力負壓護創(chuàng)敷料(購自廣州美捷威通生物科技有限公司)；異氟烷(購自中國河北九派制藥公司)；戊巴比妥鈉(購自美國Sigma公司)。

1.3 儀器

深低溫冰箱(購自瑞士Nuaire公司)；FSX100生物圖像導航儀(購自日本Olympus公司)；IQ5TMreal-time PCR儀(購自美國Beckman Coulter公司)；穩(wěn)豪微型血糖儀(購自美國強生公司)；千分之一電子天平(購自瑞士Mettle-Toledo公司)；激光多普勒血流成像儀(購自瑞典Perimed AB公司)；光學顯微照相機(購自日本佳能公司)。

1.4 方法

糖尿病大鼠模型制備：完成1 周的適應(yīng)性喂養(yǎng)后，采用高糖高脂飼料(蔗糖20%、豬油18%、蛋黃3%、基礎(chǔ)飼料59%)喂養(yǎng)4 周，采用濃度為1%的鏈脲佐菌素(STZ)30 mL/kg腹腔注射構(gòu)建糖尿病模型，注射后3 d檢測尾靜脈血糖，血糖≥16.67 mmol/L為造模成功；不成功的再次1% STZ 10 mL/kg標準注射。造模成功后，血糖≥30 mmol/L的大鼠皮下注射長效胰島素，隔日2～4 IU，保持大鼠活力，避免出現(xiàn)酮癥酸中毒。

創(chuàng)面大鼠模型制備[3]：腹腔注射濃度為1%的巴比妥鈉全麻，劑量為50 mg/kg。用剃毛機將大鼠背部毛發(fā)完全剃除，采用濃度為10%的硫化鈉進一步脫毛，然后復(fù)蘇備用。脫毛后1 d大鼠吸入濃度為體積分數(shù)3%的異氟烷全身麻醉，俯臥位，75%的乙醇消毒脫毛區(qū)，在大鼠背部正中切除2 cm×2 cm全層皮膚制備創(chuàng)面，壓迫止血。創(chuàng)面處理：對照組大鼠創(chuàng)面隔日給予普通常規(guī)換藥，每兩天1次；觀察組給予微動力負壓護創(chuàng)治療，根據(jù)創(chuàng)面大小及形狀剪裁覆膜，每周更換1次，連續(xù)14 d。

1.5 觀察指標

比較兩組大鼠治療后每周的血糖、創(chuàng)面血管密度與創(chuàng)面血流量。治療前及治療當日、治療后1周、治療后2周，每組取5 只大鼠，用激光多普勒血流成像儀檢測創(chuàng)面血流量，檢測時掃描窗口大小統(tǒng)一為10.0 cm×10.0 cm，探頭距創(chuàng)面距離統(tǒng)一為14.0 cm，檢測結(jié)果單位為PU。治療前及治療當日、治療后1周、治療后2周，每組取5只大鼠處死后距創(chuàng)緣0.5 cm擴大環(huán)形切取創(chuàng)面組織至深筋膜淺層，將切取的組織縱行分成左右兩半，右側(cè)組織凍存于液氮中備用；采用濃度為4%的甲醛溶液將左側(cè)組織固定，固定后進行石蠟包埋切片，行CD31免疫組織化學染色。根據(jù)CD31表達情況，每只大鼠選取3 張切片，采用生物圖像導航儀在100倍視野下觀察并計數(shù)血管數(shù)目，每張切片選取5 個視野，計算創(chuàng)面微血管密度，單位為條/視野。比較兩組大鼠治療前后創(chuàng)面血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管內(nèi)皮生長因子受體1(Fit-1)、血管生成素(Ang)-1，Ang-2及酪氨酸激酶受體(Tie-2)的mRNA表達水平。對凍存的右側(cè)組織采用實時熒光定量PCR儀進行熒光定量分析，在無RNA酶情況下提取總RNA并進行定量，而后進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄完成后使用SYBR Green熒光定量檢測試劑盒檢測上述指標水平。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠治療前后血糖和創(chuàng)面血流量及血管密度比較

觀察組大鼠治療當天、治療后1周、治療后2周創(chuàng)面血流量顯著高于對照組(P<0.05)；治療后1周、治療后2周血管密度顯著高于對照組(P<0.05)；兩組治療期間各時間段血糖水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表1)。

表1 兩組大鼠治療前后血糖和創(chuàng)面血流量及血管密度比較

2.2 兩組大鼠治療前后VEGF，F(xiàn)it-1，Ang-1，Ang-2，Tie-2mRNA相對表達量比較

治療前兩組大鼠VEGF，F(xiàn)it-1，Ang-1，Ang-2，Tie-2的mRNA相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療當天、治療后1周觀察組大鼠VEGF，F(xiàn)it-1，Ang-1，Ang-2的mRNA相對表達量均明顯高于對照組(P<0.05)。治療后2 周觀察組大鼠VEGF，Ang-1的mRNA與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；觀察組Ang-2低于對照組，F(xiàn)it-1高于對照組(P<0.05)。治療后1 周及2 周，對照組Tie-2相對表達量顯著高于觀察組(P<0.05)(見表2)。

3 討 論

目前研究證實[4]，創(chuàng)面血管形成是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵所在，創(chuàng)面新生肉芽組織是創(chuàng)面的重要組成部分，豐富的血管能夠為新生肉芽組織提供大量營養(yǎng)，進而促進創(chuàng)面愈合。創(chuàng)面血管形成過程受阻會導致創(chuàng)面不愈合或延遲愈合，同時也是糖尿病足患者創(chuàng)面難愈合的關(guān)鍵原因之一[5]。目前關(guān)于改善糖尿病足潰瘍創(chuàng)面血管形成的相關(guān)研究是內(nèi)分泌科醫(yī)務(wù)工作者關(guān)注的熱點。糖尿病足潰瘍創(chuàng)面的治療關(guān)鍵是將慢性創(chuàng)面轉(zhuǎn)換為急性創(chuàng)面，將感染創(chuàng)面轉(zhuǎn)化為潔凈創(chuàng)面。在此過程中血流量、血管密度及相關(guān)細胞因子均會出現(xiàn)顯著變化。本研究中構(gòu)建糖尿病創(chuàng)面大鼠模型，采用微動力負壓護創(chuàng)與常規(guī)換藥對大鼠進行干預(yù)，同時檢測了創(chuàng)面愈合過程中血流量的改變、血管密度及相關(guān)細胞因子水平。創(chuàng)面血流情況及血管密度能夠間接反映新生血管功能狀況。本研究結(jié)果顯示，觀察組大鼠治療當天、治療后1 周、治療后2 周創(chuàng)面血流量顯著高于對照組，治療后1 周、治療后2 周血管密度顯著高于對照組，兩組治療期間各時間段血糖水平比較，差異無統(tǒng)計學意義，提示采用微動力負壓護創(chuàng)技術(shù)能夠明顯改善創(chuàng)面血流供應(yīng)，進而促進創(chuàng)面愈合，且對大鼠血糖無明顯影響。研究顯示[6-7]，VEGF及血管生成素是血管生成的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子，前者能夠與血管內(nèi)皮細胞特異性受體Fit-1結(jié)合，加速創(chuàng)面血管的形成，后者又分為Ang-1與Ang-2。研究顯示[8]，Ang-1能夠與Tie-2結(jié)合，促進新生血管形成并增強其穩(wěn)定性，在創(chuàng)面愈合過程中具有重要作用。Ang-2作為Ang-1的自身拮抗劑，通過與Tie-2結(jié)合達到拮抗Ang-1功能的作用，防止新生血管數(shù)量過多，同時可降低血管成熟的穩(wěn)定性[9-10]。本研究結(jié)果顯示，治療當天、治療后1周觀察組大鼠VEGF，F(xiàn)it-1，Ang-1，Ang-2的mRNA相對表達量均明顯高于對照組，治療后2 周觀察組大鼠VEGF，Ang-1的mRNA與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義；治療后1 周及治療后2 周，對照組Tie-2 mRNA相對表達量顯著高于觀察組；治療后2 周對照組Ang-2mRNA顯著高于觀察組。說明采用微動力負壓護創(chuàng)技術(shù)能夠增加糖尿病足潰瘍創(chuàng)面VEGF，Ang-1，F(xiàn)it-1的表達水平，促進創(chuàng)面新生血管的形成，同時抑制Ang-1及其受體Tie-2的表達。

表2 兩組大鼠治療前后VEGF，F(xiàn)it-1，Ang-1，Ang-2，Tie-2的mRNA相對表達量比較

綜上所述，微動力負壓護創(chuàng)技術(shù)能通過改變糖尿病潰瘍大鼠創(chuàng)面細胞因子水平，促進創(chuàng)面新生血管形成，進而促進創(chuàng)面愈合。